酶法提取余甘子總多酚的研究

王小艷 向宇楠 馮慧

【摘 要】 目的：采用酶法優(yōu)選余甘子多酚類化合物的提取工藝。方法：在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交設(shè)計(jì)進(jìn)行提取條件的優(yōu)化，以總多酚的提取率為考察指標(biāo)，采用福林-酚比色法進(jìn)行總多酚的含量測(cè)定，確定了提取工藝的最佳參數(shù)。結(jié)果：確定余甘子中總多酚的最佳提取工藝為：溫度60℃，料液比為1∶30 ，纖維素酶和果膠酶的比例為1∶[KG-*3/5]1，總加酶量為2%，pH值為4.0，恒溫振蕩（低速r=60～100/min），提取時(shí)間4h，總多酚提取率為13.68%。結(jié)論：酶法提取優(yōu)于傳統(tǒng)溶劑提取法，操作簡(jiǎn)單可行，為余甘子總多酚的提取工藝提供了參考。

【關(guān)鍵詞】 余甘子;總多酚;纖維素酶;果膠酶;正交設(shè)計(jì)

【中圖分類號(hào)】R284.2 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2020）3-0036-05

Abstract：Objective To optimize the extraction process of polyphenols from Fructus Phyllanthus by enzymatic method.Methods Based on the results of single factor test，we designed the orthogonal experiment to optimize parameters.The content of total polyphenols was used as the investigation index and determined by Folin phenol colorimetric method，then obtain the optimum parameters of the extraction process.Results The optimum extraction process of total polyphenols was as follows： the temperature at 60℃，the ratio of liquid to material in 30∶[KG-*3/5]1，the proportion of cellulase with pectinase about 1∶[KG-*3/5]1，with the amount of adding enzyme 2%，and pH at 4.0， finally， extracting at constant temperature and constant shaking conditions（r=60～100/min） for 4h， so the total polyphenol yield was 13.68%.Conclusion The enzymatic extraction was better than the traditional solvent extraction method，besides the operation was simple and feasible，and the experimental result provide a reference for the extraction process of total polyphenols from Phyllanthus.

Keywords：Fructus Phyllanthus;Total Polyphenols;Cellulase;Pectinase;Orthogonal Design

余甘子，為大戟科植物余甘子Phyllanthus emblica L.的干燥成熟果實(shí)，為常用藏藥，同時(shí)具有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，位列國(guó)家衛(wèi)計(jì)委首批藥食同源中藥名單。其含有沒食子酸、鞣花酸等多酚類主要藥用成分，具有降血糖、抗氧化等藥理活性，在糖尿病、肝病等方面發(fā)揮重要作用[1]。因此，藏醫(yī)藥經(jīng)典著作《藍(lán)琉璃》記載“治尿頻”，《晶珠本草》記載“治赤巴病”[2-3]，在三果湯、十八味訶子利尿丸等藏成藥中應(yīng)用[4-5]。目前，余甘子多采用傳統(tǒng)溶劑提取法[6-7]，以甲醇等有機(jī)溶劑作為提取溶劑，提取溫度過(guò)高造成鞣花酸等有效成分活性降低，提取率較低。針對(duì)植物細(xì)胞壁是由果膠質(zhì)、纖維素、半纖維素等構(gòu)成的復(fù)雜致密結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)[8-11]，以純化水作為提取溶劑，利用纖維素酶、果膠酶將余甘子細(xì)胞壁中纖維素、果膠質(zhì)等成分降解，從而達(dá)到破壞細(xì)胞壁致密結(jié)構(gòu)的目的。該方法提取余甘子總多酚，操作簡(jiǎn)單，安全環(huán)保，旨在探索一種新的余甘子總多酚提取方法。

1 儀器與材料

V-1100D型可見分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）;DZKW-4型電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）;PHS-3S型精密PH計(jì)（成都世紀(jì)方舟科技有限公司），BSA124S型萬(wàn)分之一電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）;SHA-C恒溫振蕩器（常州澳華儀器有限公司）;福林-酚試劑（濃度2mol/L ，成都科隆化學(xué)品有限公司，批號(hào)：2018042701）;纖維素酶 （酶活力>150U/mg上海源聚生物科技有限公司，批號(hào)：171016），果膠酶（酶活力>50U/mg 上海源聚生物科技有限公司，批號(hào)：170925）。沒食子酸對(duì)照品（含量≥99%，成都德思特生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：DST180226-008）。余甘子藥材（批號(hào)：20151101，購(gòu)自成都市國(guó)際商貿(mào)城藥材市場(chǎng)）經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)賴先榮教授鑒定為大戟科植物余甘子的干燥成熟果實(shí)。其他試劑和藥品均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 福林-酚法測(cè)定余甘子總多酚

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 取沒食子酸對(duì)照品，精密稱定，置50mL量瓶中，加30%甲醇使溶解并稀釋至刻度線，搖勻，制成每1mL含有沒食子酸316μg的對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密量取余甘子提取液1.0mL，水浴蒸干，殘?jiān)?0%甲醇適量使溶解，轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中，加30%甲醇至刻度線，搖勻，即得。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 精密量取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液3.0mL、3.5mL、4.0mL、4.5mL、5.0mL、5.5mL、6.0mL，分別至10mL量瓶中，加30%甲醇至刻度線，得到每1mL分別含有94.8、110.6 、126.4、142.2、158.0、 173.8 、189.6μg沒食子酸的溶液。分別吸取以上稀釋后的對(duì)照品溶液1.0mL置25mL具塞試管中，加5mL純化水，搖勻，加入1mL福林-酚試劑，放置5min，加4mL14%碳酸鈉溶液，再加純化水至刻度，搖勻，室溫避光放置2h。同時(shí)，以30%甲醇溶液代替對(duì)照品溶液為空白，照紫外-可見分光光度法（《中國(guó)藥典》四部通則0401），在754nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，A=0.0049C-0.1843，R2=0.999，當(dāng)沒食子酸質(zhì)量濃度在94.8～189.6μg / mL時(shí)，吸光度與沒食子酸質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.1.4 方法學(xué)考察 取沒食子酸對(duì)照品溶液按“2.1.3”項(xiàng)下的方法進(jìn)行配制和測(cè)定，重復(fù)測(cè)定6次，記錄吸光度（A），計(jì)算其RSD值為2.03%，表明儀器精密度較好。取余甘子提取液按“2.1.2”項(xiàng)下制備6份，同上進(jìn)行測(cè)定，記錄A值并代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，得到平均含量為102.4mg/g，含量的的RSD值為2.08%，表明方法重復(fù)性良好。將制備的同一供試品溶液于2h、4h、6h、8h、10h、12h，進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算得A的RSD值為0.86%，說(shuō)明供試品溶液12h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。參照《中國(guó)藥典》2015版第四部9101指導(dǎo)原則，進(jìn)行加樣回收試驗(yàn)。取9份已知含量的供試品溶液0.15mL（供試品溶液含5g藥材，藥液體積150mL），分別加入相當(dāng)于余甘子總多酚含量的50%、100%、150%的沒食子酸對(duì)照品。同上方法測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，加樣量與結(jié)果見表1，表明加樣回收結(jié)果良好。

2.2 單因素考察試驗(yàn)

2.2.1 酶的種類和比例的選擇 按照表1所列，精密稱定各組所需酶。取余甘子粗粉5g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，分別加入各組相應(yīng)的酶，加pH值已調(diào)至4.0的純化水（用1mol/L NaOH和1mol/L HCL溶液調(diào)節(jié)）100mL，60℃水浴加熱2h，濾過(guò)，濾液轉(zhuǎn)移至100mL量瓶，并用pH值為4.0的純化水稀釋至刻度線。按照“2.1.3”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，計(jì)算余甘子總多酚提取率（提取率=余甘子總多酚含量/余甘子粗粉質(zhì)量*100%）。結(jié)果見表2，當(dāng)纖維素酶和果膠酶比例為1∶[KG-*3/5]1時(shí)，加酶組3的提取率最高。因此選擇纖維素酶和果膠酶比例為1∶[KG-*3/5]1。

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)余甘子總多酚提取率的影響 取余甘子粗粉5g，精密稱取，置于圓底燒瓶中，加入纖維素酶、果膠酶各0.05g，再加pH值調(diào)至4.0的純化水100mL，60℃水浴加熱，加熱時(shí)間分別為0.5h、1h、1.5h、2h、3h、4h，濾過(guò)，濾液轉(zhuǎn)移至100mL量瓶，并用以上溶劑稀釋至刻度線。按照“2.1.3”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，計(jì)算余甘子總多酚提取率。結(jié)果，各個(gè)提取時(shí)間對(duì)應(yīng)的提取率分別為0.64%、2.66%、2.81%、3.32% 3.86%、3.92%，提取時(shí)間在3h后，提取率趨于穩(wěn)定，表明余甘子的最佳提取時(shí)間為3～4h。

2.2.3 溫度對(duì)余甘子總多酚提取率的影響 取余甘子粗粉5g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，加入纖維素酶、果膠酶各0.05g，再加PH值調(diào)至4.0的純化水100mL，分別置于30℃、40 ℃、50 ℃ 、60℃、70 ℃ 溫度下水浴加熱4h，濾過(guò)，濾液轉(zhuǎn)移至100mL量瓶，并用以上溶劑稀釋至刻度線。按照“2.1.3”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，計(jì)算余甘子總多酚提取率。結(jié)果，各個(gè)溫度下的提取率依次為3.60%、3.66%、3.73%、3.80%、3.70%，可以看出無(wú)明顯差異。

2.2.4 pH值對(duì)余甘子總多酚提取率的影響 取余甘子粗粉5g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，加入纖維素酶、果膠酶各0.05g，再分別加入（用1mol/L NaOH和1mol/L HCL溶液調(diào)節(jié)）pH值至3.6、4.0、4.5、5.2、5.6、6.2的純化水100mL，60℃水浴加熱4h，濾過(guò)，濾液轉(zhuǎn)移至100mL量瓶，加入以上相應(yīng)的溶劑至刻度線。按照“2.1.3”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，計(jì)算余甘子總多酚提取率。結(jié)果，提取率依次分別為3.00%、3.30%、3.89%、3.69%、3.61%、3.38%，表明在pH值在4.5左右時(shí)，提取率最高。

2.2.5 料液比對(duì)余甘子總多酚提取率的影響 取余甘子粗粉5g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，加入纖維素酶、果膠酶各0.05g，再分別加入已調(diào)至pH值為4.5的純化水50、75、100、150、200、250mL，60℃水浴加熱4h，濾過(guò)，濾液轉(zhuǎn)移至100mL量瓶，并用以上溶劑稀釋至刻度線。按照“2.1.3”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，計(jì)算余甘子總多酚提取率。結(jié)果，提取率分別為2.80%、4.65%、5.36%、6.97%、8.46%、7.91%，表明當(dāng)料液比為1∶[KG-*3/5]40時(shí)，余甘子得到充分提取，總多酚提取率最大。

2.2.6 酶的用量對(duì)余甘子總多酚提取率影響 取余甘子粗粉5g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，分別加入為余甘子粗粉質(zhì)量1%、2%、3%、4%、5%、6% 的酶（纖維素酶：果膠酶=1∶[KG-*3/5]1），再分別加入已調(diào)至pH值為4.5的純化水200mL，60℃水浴加熱4h，濾過(guò)，濾液轉(zhuǎn)移至200mL量瓶，并用以上溶劑稀釋至刻度線。按照“2.1.3”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，計(jì)算余甘子總多酚提取率。結(jié)果，提取率分別8.65%、9.42%、9.28%、9.36%、8.49%、8.39%，表明提取余甘子總多酚的最佳酶用量為2%～4%。

2.3 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，考察各因素之間的相互影響，選用5因素4水平進(jìn)行L16（45）正交實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步確定提取余甘子總多酚提取的最佳條件，因素水平見表3，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4、極差分析見表5、方差分析見表6。

由表4、5中的極差分析和方差分析可以得出，影響余甘子總多酚提取率的因素的主次D>C>E>B>A 。以溫度A為誤差項(xiàng)進(jìn)行方差分析，因素D料液比對(duì)提取效果有顯著影響，因素B、C、E對(duì)提取效果無(wú)顯著性影響。綜合分析最佳的提取組合為A4 B4 C1D3E2 ，最佳的提取工藝為：提取溫度60℃、提取時(shí)間4h、pH為4.0、料液比為1∶[KG-*3/5]30、酶用量為2%，結(jié)果與單因素考察結(jié)果一致，最佳提取率為10.42%。

在正交試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)余甘子進(jìn)行了振蕩提取的初步研究。采用水浴恒溫振蕩器，60℃條件下考察了振蕩轉(zhuǎn)速對(duì)余甘子提取結(jié)果的影響。結(jié)果低速（r=60～100/min）條件下，振蕩均勻，提取率為13.5%;中速（r=100～200/min）條件下，振蕩幅度較大，提取率低于低速條件下的提取;高速（r=200～300/min）條件下，振蕩劇烈藥材粗粉大部分粘在容器壁，提取不充分，提取率忽略不計(jì)。綜合考慮，選擇低速（r=60～100/min）進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 經(jīng)過(guò)“2.2”“2.3”的單因素考察和正交實(shí)驗(yàn)可以得出提取余甘子的最佳酶解工藝，現(xiàn)對(duì)最佳的工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證。按照以上條件，對(duì)加酶組、不加酶組、加酶振蕩組（r=60～100/min）各平行提取3份，進(jìn)行分析比較。結(jié)果見表7。

由表6可知，各組的余甘子總多酚提取率一致。與未加酶組相比，加酶組的提取率提高了27%，加酶振蕩組提高了64%，加酶振蕩組比加酶組提高了29%?？梢?，加酶組的提取效果較好，加酶振蕩的動(dòng)態(tài)提取更有利于余甘子總多酚的提取。

3 討論

纖維素酶和果膠酶可以降解植物細(xì)胞中纖維素和果膠質(zhì)等成分，從而破壞植物細(xì)胞壁，發(fā)揮生物催化作用。而酶催化需要特定的溫度和pH環(huán)境。本研究參考了纖維素酶和果膠酶的生物酶提取技術(shù)[12-16]和熱動(dòng)力學(xué)理論研究[17-19]的相關(guān)文獻(xiàn)，得到纖維素酶和果膠酶提取黃酮類和多酚類成分的最適溫度為30～60℃，最適pH值在4～6。在一定溫度范圍內(nèi)，酶的催化效果隨溫度升高而增強(qiáng)，超過(guò)一定溫度后，酶的結(jié)構(gòu)被破壞，活性減弱或消失。同時(shí)，酶的催化活性也需要在最適的pH值環(huán)境下，過(guò)酸或過(guò)堿的環(huán)境同樣破壞酶的結(jié)構(gòu)，影響研究結(jié)果。因此，以上討論與研究結(jié)果最終選擇60℃、pH值4.0為提取條件相吻合。在本次研究中，余甘子依靠纖維素酶和果膠酶的催化作用，總多酚的提取率有了提高，此外借助水浴恒溫振蕩器的機(jī)械力，使提取溶劑與藥材充分接觸，反復(fù)振蕩使整個(gè)過(guò)程處于一個(gè)小型的動(dòng)態(tài)循環(huán)之中，進(jìn)一步的促進(jìn)了余甘子總多酚的溶出。

余甘子為藥食同源類中藥，主要含有多酚類化合物，不僅可以發(fā)揮其廣泛的藥理作用，還能發(fā)揮多種營(yíng)養(yǎng)保健作用，應(yīng)用于食品等領(lǐng)域[20-22]。本次研究中，利用纖維素酶和果膠酶提取主要成分，綠色環(huán)?？墒秤?，希望為余甘子在食品和藥品領(lǐng)域的充分利用發(fā)揮一定的參考價(jià)值。

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