三氯卡班對蚯蚓的氧化脅迫及DNA損傷

李倩倩，李光德,*，閆曉彤，劉斌，李紫薇

1. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，泰安 271018 2. 山東省高校農(nóng)業(yè)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，泰安 271018

三氯卡班(triclocarban, TCC)是個人護(hù)理產(chǎn)品中主要有機(jī)成分之一[1]，由于其殺菌(細(xì)菌和真菌)、無毒、無刺激性、皮膚接觸無過敏反應(yīng)，且與皮膚有良好的相容性等特性被廣泛用于廚房洗滌劑、化妝品和兒童玩具等消費(fèi)產(chǎn)品中[2-3]，且經(jīng)常在自然環(huán)境、野生生物和人體組織中被檢出[4]。在中國遼河、海河、黃河、長江和珠江等的表層水和沉積物中，TCC的檢出率為100%，最高濃度達(dá)2 723 ng·L-1[5]。在污水處理廠產(chǎn)生的污泥中，TCC含量高達(dá)10.0～70.0 mg·kg-1，有95%的污泥被用作耕地的土壤有機(jī)質(zhì)補(bǔ)給，污泥農(nóng)用將導(dǎo)致TCC進(jìn)一步進(jìn)入土壤中，加劇土壤環(huán)境污染[6]。陳鳳[7]在廣州省、河北省污泥農(nóng)用土壤中均檢測到TCC的存在，并根據(jù)生態(tài)風(fēng)險評價得出TCC對陸生生物具有高風(fēng)險。Yin等[8]已在人類尿液和指甲中檢測到TCC的存在，且濃度高達(dá)84.66 μg·kg-1和41.05 μg·kg-1，這表明中國人群身體組織中已有TCC的積累。

TCC的物化性質(zhì)穩(wěn)定，在環(huán)境中較難降解，很容易在土壤、污水處理廠污泥和沉積物等環(huán)境介質(zhì)中富集，是一種潛在的持久性有機(jī)污染物(persistent organic pollutants, POPs)。Halden和Paull等[9]發(fā)現(xiàn)TCC在沉積物、土壤、水和大氣中的半衰期分別為540、120、60和0.75 d。汪貞等[10]通過應(yīng)用物種敏感性分布方法對我國地表水中TCC進(jìn)行生態(tài)風(fēng)險評估，得出TCC高風(fēng)險比例為28.6%，中風(fēng)險比例高達(dá)47.6%，TCC對我國淡水環(huán)境的影響應(yīng)當(dāng)引起環(huán)境管理部門的重視。隨著TCC使用量的急劇增加，其對自然環(huán)境的污染水平、對生物體的毒性效應(yīng)和對生態(tài)系統(tǒng)造成的潛在影響不容忽視。

多項(xiàng)研究表明，TCC能對人和動植物引起各種不良反應(yīng)，可通過抗氧化劑生物標(biāo)志物包括過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)和過氧化脂質(zhì)(LPO)進(jìn)行監(jiān)測。由于接觸含TCC成分的消費(fèi)產(chǎn)品的時間更長，女性會更易受TCC的影響[11]。大量研究證明，TCC對動植物和人體的生長發(fā)育存在抑制效應(yīng)，干擾其內(nèi)分泌以及遺傳等。Kajta等[12]將神經(jīng)元細(xì)胞暴露于TCC中24 h后發(fā)現(xiàn)，TCC會抑制ESR1和GPER1的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)，通過基因的甲基化破壞雌激素受體的信號傳導(dǎo)。Dong等[13]研究發(fā)現(xiàn)，133.3 mg·L-1水平的TCC可使斑馬魚心率降低，抑制膀胱發(fā)育，還會抑制其甲狀腺激素，并改變甲狀腺激素反應(yīng)基因的表達(dá)。楊峰等[14]發(fā)現(xiàn)3.57 μmoL·L-1的TCC可抑制腎小管上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白JAM-1的表達(dá)，從而影響腎臟的屏障功能。施金彤等[15]的研究證明，TCC能誘導(dǎo)正常的小鼠乳腺上皮細(xì)胞發(fā)生癌變；李林朋等[16]通過彗星實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TCC能引起人體肝臟細(xì)胞的DNA損傷，且呈現(xiàn)出明顯的“劑量-效應(yīng)”關(guān)系。

目前，國際上對TCC的研究主要集中于TCC對水生生物、土壤微生物以及哺乳動物的生態(tài)毒性效應(yīng)及其在環(huán)境中的降解、轉(zhuǎn)移等，而TCC對土壤動物蚯蚓的毒性效應(yīng)研究報道甚少。蚯蚓對土壤污染物質(zhì)的反應(yīng)可作為評價土壤污染和土壤質(zhì)量的指標(biāo)[17]，是土壤污染預(yù)警和診斷的一種工具[18-19]。赤子愛勝蚓(Eiseniafoetida)是國際上常用于蚯蚓毒性試驗(yàn)的品種，因此，本文以赤子愛勝蚓為研究對象，使其暴露于不同TCC含量染毒的人工土壤中[20]，從細(xì)胞水平上研究TCC對蚯蚓抗氧化酶系包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、CAT和GST活性，活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)含量的影響，以及對細(xì)胞DNA的損傷程度，用以探究TCC的生態(tài)毒理學(xué)性質(zhì)，這對評估TCC對環(huán)境的影響尤為重要。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗(yàn)材料

藥品試劑：三氯卡班標(biāo)準(zhǔn)品(純度>99.5%)、L-甲硫氨酸、愈創(chuàng)木酚和瓊脂糖購自美國Sigma-Aldrich公司；考馬斯亮藍(lán)購自北京瑞泰科技有限公司；核黃素和丙三醇(分析純)購自天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；牛血清白蛋白和十二烷基氨酸鈉(分析純)購自上海伯奧生物技術(shù)有限公司。

供試生物：赤子愛勝蚓購于日照老兵蚯蚓養(yǎng)殖場，挑選環(huán)帶明顯、大小(體質(zhì)量300～600 mg)一致的健康成蚓，試驗(yàn)前在配制的人工土壤中馴化一周。

供試土壤：按照經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(OECD)推薦的標(biāo)準(zhǔn)配制人工土：10%的干燥泥炭蘚(pH值5.5～6.0)；20%的高嶺粘土(約含高嶺石成分50%)；69%的工業(yè)石英砂(約含50%的50～200目細(xì)顆粒)；1%碳酸鈣(調(diào)節(jié)人工土pH值到6.0±0.5)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計

試驗(yàn)TCC染毒設(shè)定濃度為0(以丙酮作空白對照)、5、10、20和40 mg·kg-1。染毒試驗(yàn)前，根據(jù)試驗(yàn)染毒濃度設(shè)置，將TCC溶于丙酮后配制成相應(yīng)系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。按配比稱取500 g人工土后放置于l L干燥燒杯中，先取10 g土樣與一定量系列濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液充分混勻，再與490 g土樣充分混勻，待丙酮溶劑揮發(fā)完全后加適量去離子水，調(diào)節(jié)水分至土壤干質(zhì)量的35%左右，明暗時間比為12 h∶12 h。每個濃度處理設(shè)3個重復(fù)。選取15條符合要求的蚯蚓放入燒杯中，用預(yù)先扎孔的保鮮膜封口，將燒杯放置于(20±1) ℃培養(yǎng)箱中，調(diào)節(jié)光暗。在培養(yǎng)第7、14、21和28天，自燒杯中取出蚯蚓，用生理鹽水沖洗干凈后放置于放有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，在(20±1) ℃的培養(yǎng)箱中過夜吐泥，取樣測定相關(guān)指標(biāo)。

1.3 測試指標(biāo)及方法

選擇SOD、CAT、POD、GST、MDA和ROS作為蚯蚓氧化損傷指標(biāo)，其中，SOD活性檢測采用氮藍(lán)四唑(NBT)光還原法，CAT活性測定采用紫外分光光度計法，POD活性檢測采用愈創(chuàng)木酚比色法，MDA含量檢測采用硫代巴比妥酸法，GST活性檢測采用1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)比色法[21-22]。ROS含量測定采用二氯熒光素(DCFH-DA)熒光法測定[23]。

TCC對蚯蚓體腔細(xì)胞DNA損傷的測定采用彗星實(shí)驗(yàn)(Comet Assay)，又稱單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)(SCGE)。根據(jù)Singh等[24]和Song等[25]的研究方法，結(jié)合實(shí)驗(yàn)情況做適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。溴化乙錠染色后，采用熒光倒置顯微鏡觀察玻片、拍照、存取結(jié)果，用CASP軟件分析蚯蚓體腔細(xì)胞DNA的彗星圖片，測定Olive尾矩。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2016對全部數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。通過SPSS 19.0進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，檢測分析不同處理組與空白組之間的差異顯著性。顯著性差異水平設(shè)定為P<0.05。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD，n=3)的形式表示。

2 結(jié)果(Results)

2.1 TCC對蚯蚓的氧化脅迫效應(yīng)

2.1.1 TCC對SOD活性的影響

由圖1可知，在整個實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，在TCC脅迫作用下，蚯蚓體內(nèi)的SOD活性大致呈現(xiàn)先激活后被抑制的情況。染毒處理7 d時，SOD活性較空白組變化不大；14 d后，濃度低于20 mg·kg-1的處理組SOD活性均高于空白組，且存在顯著性差異(P<0.05)，高濃度處理組活性雖高于空白組，但與空白組差異性不顯著；處理21 d時，除40 mg·kg-1處理組的SOD活性小于空白組的，其余濃度處理組SOD活性均高于空白組，且與對照組相比有顯著差異(P<0.05)，但各處理組之間差異性不大；染毒處理28 d時，相比于空白組，各濃度處理組的SOD活性明顯受到抑制，且隨TCC濃度的升高呈下降趨勢。

圖1 三氯卡班(TCC)對蚯蚓體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響注：每組中不同的小寫字母表示處理間差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)；下同。Fig. 1 Effects of triclocarban (TCC) on activities of superoxide dismutase (SOD) in earthwormsNote: Different small letters meant significant difference among treatments at P<0.05; the same as below.

2.1.2 TCC對CAT活性的影響

由圖2可知，在整個實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，高濃度處理組(40 mg·kg-1)CAT活性始終被抑制，其余處理組活性則被激發(fā)。在TCC染毒處理7 d時，CAT活性(除40 mg·kg-1處理組)較空白組略有增長，但激活程度不顯著；染毒14 d后，各處理組CAT活性被激發(fā)；21 d時，各處理組的CAT活性均激活到最高程度，并在10 mg·kg-1處理組活性值達(dá)到最大，與空白組相比增加了31.17%，激發(fā)效果顯著(P<0.05)。第28天時，20 mg·kg-1處理組CAT活性仍高于空白組，但激活程度明顯低于5 mg·kg-1和10 mg·kg-1處理組。

圖2 TCC對蚯蚓體內(nèi)過氧化氫酶(CAT)活性的影響Fig. 2 Effects of TCC on activities of catalase (CAT) in earthworms

2.1.3 TCC對POD活性的影響

由圖3可知，隨著TCC染毒濃度的增加和染毒時間的延長，蚯蚓POD活性也呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。在染毒第7～14天，各處理的POD活性均被不同程度地激發(fā)，且與空白組相比，差異性顯著(P<0.05)。染毒21 d后，5 mg·kg-1和10 mg·kg-1處理組的POD活性被顯著激活，但2個不同濃度處理組之間差異性不明顯，高濃度處理組(40 mg·kg-1)的POD活性則被抑制。染毒至28 d時，各濃度處理組的POD活性隨暴露濃度的增加，抑制作用明顯增強(qiáng)。

圖3 TCC對蚯蚓體內(nèi)過氧化物酶(POD)活性的影響Fig. 3 Effects of TCC on activities of peroxidase (POD) in earthworms

2.1.4 TCC對蚯蚓GST活性的影響

由圖4可知，GST的活性在染毒初期受到輕微抑制，后逐漸被激活升高，在染毒第14天時達(dá)到最高值，最終在染毒28 d時被抑制。在染毒7 d后，各濃度處理組GST活性受到抑制，40 mg·kg-1處理組活性較空白組降低20.1%。染毒14 d時，蚯蚓受TCC刺激變明顯，使各處理組的GST活性迅速增加，且在40 mg·kg-1組GST活性達(dá)到最高。21 d時，染毒組GST活性雖高于空白組，但較染毒14 d時的GST活性降低。在染毒28 d后，GST活性受抑制，但各濃度處理組間無顯著性差異。

圖4 TCC對蚯蚓體內(nèi)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)活性的影響Fig. 4 Effects of TCC on activities of glutathione transferase (GST) in earthworms

2.1.5 TCC對蚯蚓體內(nèi)MDA含量的影響

由圖5可知，在整個染毒周期內(nèi)，除個別處理組外，經(jīng)TCC處理的樣品中MDA含量始終高于空白組，且與空白組之間存在顯著性差異(P<0.05)。染毒第7天時，各處理組MDA含量開始增加，且在20 mg·kg-1時達(dá)到最大值。染毒第14～21天時，除14 d的40 mg·kg-1處理組外，隨著暴露濃度的升高，各處理組的MDA含量也隨之升高。第28天時，蚯蚓體內(nèi)MDA含量的增長趨勢有所減緩。

圖5 TCC對蚯蚓體內(nèi)丙二醛(MDA)含量的影響Fig. 5 Effects of TCC on contents of malondialdehyde (MDA) in earthworms

2.1.6 TCC對蚯蚓體內(nèi)ROS含量的影響

由圖6可知，不同濃度的TCC均可誘導(dǎo)蚯蚓體內(nèi)ROS的含量上升，且隨著染毒時間的增加，蚯蚓體內(nèi)ROS含量呈先升高后緩慢降低至空白的趨勢。染毒第7天時，5 mg·kg-1處理組ROS含量低于空白組，其余處理組ROS含量則隨染毒濃度的增加而增加。第14天時，各處理組ROS含量均顯著高于空白組，并在20 mg·kg-1處理組達(dá)到最大值，比空白組增加了80.43%；21 d時，各處理組蚯蚓體內(nèi)ROS依舊呈現(xiàn)高于空白組的狀態(tài)，但與空白組的差距逐漸變小，且低于14 d時蚯體內(nèi)ROS的含量；第28天時，各處理組ROS含量略有降低，并接近于空白組。

圖6 TCC對蚯蚓活性氧(ROS)含量的影響Fig. 6 Effect of TCC on content of reactive oxygen species (ROS) in earthworms

2.2 TCC對蚯蚓體腔細(xì)胞DNA的損傷

不同濃度TCC脅迫對蚯蚓體腔細(xì)胞造成的損傷如圖2～圖7所示。由圖7可知，空白組的蚯蚓體腔細(xì)胞細(xì)胞核頭部呈致密的圓形，邊緣清晰，無拖尾或尾部極短。經(jīng)TCC染毒后，染毒組的細(xì)胞核結(jié)構(gòu)受到損傷，DNA頭部逐漸變小、變松散，在外加電場下，斷裂的DNA漸漸地離開細(xì)胞核向陽極遷移，呈掃帚狀，形成類似彗星拖尾的圖案，核DNA的斷裂程度和彗星拖尾的長度隨染毒濃度的增大而加長。

圖7 暴露于TCC的蚯蚓體腔細(xì)胞彗星實(shí)驗(yàn)圖像Fig. 7 Typical comet image of earthworms coelomocyte exposed to TCC

用CASP軟件分析彗星圖像，得到TCC對蚯蚓體腔細(xì)胞的Olive尾矩的影響，如圖8所示，Olive尾矩反映蚯蚓體腔細(xì)胞DNA的遷移。5～40 mg·kg-1的TCC均可對蚯蚓體腔細(xì)胞DNA造成損傷，且Olive尾矩隨染毒濃度和時間的增加而增加，與空白組相比差異性顯著。第28天時，20 mg·kg-1和40 mg·kg-1處理組的彗星Olive尾矩較21 d時增長幅度減緩，可能是因?yàn)轵球驹趹?yīng)對外界TCC毒性時，經(jīng)過一段時間的應(yīng)激反應(yīng)后慢慢進(jìn)行自我修復(fù)。

圖8 TCC對蚯蚓體腔細(xì)胞DNA損傷Olive尾距(OTM)的影響Fig. 8 Effect of TCC on DNA damage Olive tail moment (OTM) in earthworm coelomocyte cells

3 討論(Discussion)

3.1 TCC對蚯蚓抗氧化酶系和GST活性的影響

CAT是生物防御體系的關(guān)鍵抗氧化酶之一，廣泛存在于細(xì)胞的過氧化物內(nèi)。它可清除體內(nèi)的H2O2，促使其分解為分子氧和水，使機(jī)體免受來自H2O2的損害。40 mg·kg-1處理組CAT活性在整個實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)始終被抑制，說明高濃度TCC對蚯蚓造成的氧化脅迫程度過大，機(jī)體細(xì)胞膜受到氧化損傷，導(dǎo)致機(jī)體中毒，CAT產(chǎn)生機(jī)制受損，并且機(jī)體持續(xù)累積H2O2的速度大于CAT的清除速度，導(dǎo)致H2O2在機(jī)體內(nèi)累積，抑制了CAT的合成，使機(jī)體內(nèi)的CAT含量降低。除個別濃度處理組外，各濃度處理組的CAT活性始終高于空白組，且隨著染毒時間的增加，CAT活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，染毒處理21 d時，20 mg·kg-1濃度組使CAT活性激發(fā)至最大。

GST是細(xì)胞的主要解毒酶，能夠催化機(jī)體內(nèi)谷胱甘肽(GSH)與有毒物質(zhì)結(jié)合，使其轉(zhuǎn)化為水溶性化合物隨尿液等排出體外，達(dá)到解毒目的。染毒7 d時，GST活性受到抑制，可能是由于抗氧化系統(tǒng)應(yīng)激作用的延遲，TCC脅迫下蚯蚓體內(nèi)的ROS和H2O2等含量上升，部分GST被消耗，活性降低。高濃度處理組GST活性顯著激活，可能是在高濃度作用下，機(jī)體中其他抗氧化酶系發(fā)揮的作用低于中低濃度組，需刺激GST活性來維持機(jī)體的平衡。染毒第28天，GST活性被抑制，濃度越高，受抑制程度越大，表明長時間及高濃度脅迫下，機(jī)體內(nèi)活性氧等有毒物質(zhì)的產(chǎn)生速率大于其清除速率，累積的有毒物質(zhì)對蚯蚓產(chǎn)生影響，阻礙了GST酶蛋白的合成，降低了GSH與有毒物質(zhì)的合成，導(dǎo)致GST的解毒能力下降。

3.2 TCC對蚯蚓MDA和ROS含量的影響

MDA是細(xì)胞膜中自由基與不飽和脂肪酸氧化反應(yīng)的主要產(chǎn)物[32]，其含量的多少可直接反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映自由基對機(jī)體的損傷程度[21]。含量越高，表明機(jī)體受損傷程度越大[33]。染毒初期，受TCC刺激產(chǎn)生且未被抗氧化酶系及時清除的活性氧自由基與細(xì)胞膜發(fā)生過氧化反應(yīng)，脂質(zhì)過氧化作用增強(qiáng)，導(dǎo)致MDA含量升高。實(shí)驗(yàn)后期，除個別濃度組外，蚯蚓體內(nèi)MDA含量隨著時間和TCC濃度的增加而增加，說明在TCC脅迫下蚯蚓機(jī)體產(chǎn)生的ROS含量增加，過量的ROS反過來抑制抗氧化防御系統(tǒng)的活性，抗氧化酶系無力應(yīng)對過量的自由基，從而引起細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化作用增強(qiáng)，使MDA的含量增加。

ROS是機(jī)體正常代謝的產(chǎn)物。環(huán)境中的多數(shù)外源污染物都能影響機(jī)體內(nèi)氧化還原系統(tǒng)的平衡，促使機(jī)體產(chǎn)生大量的ROS，引起膜脂過氧化作用，導(dǎo)致一系列有害的生理生化變化[25]。ROS在調(diào)節(jié)細(xì)胞分化及死亡過程中起到至關(guān)重要的作用[34]。在本實(shí)驗(yàn)整個染毒周期內(nèi)，各處理組ROS含量始終高于空白組，且在14 d時差異性較為顯著，表明TCC對蚯蚓機(jī)體造成了明顯的損傷。Shao等[35]的實(shí)驗(yàn)中同樣發(fā)現(xiàn)離子液體會導(dǎo)致蚯蚓體內(nèi)ROS含量上升。說明TCC脅迫會導(dǎo)致蚯蚓體內(nèi)ROS含量增加，打破機(jī)體ROS產(chǎn)生和消除的動態(tài)平衡，進(jìn)而直接或間接破壞蚯蚓抗氧化防御系統(tǒng)。21 d后，各處理組ROS含量仍高于空白組，但各濃度處理組ROS相比14 d時呈現(xiàn)出下降的趨勢，說明蚯蚓機(jī)體具有一定自我修復(fù)的能力，且本試驗(yàn)中染毒物質(zhì)的濃度并未對蚯蚓機(jī)體造成不可逆的損害。但在整個實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，染毒濃度對蚯蚓體內(nèi)ROS含量的影響并無明顯規(guī)律。

3.3 TCC對蚯蚓DNA損傷的影響

實(shí)驗(yàn)設(shè)置濃度均可對蚯蚓體腔細(xì)胞DNA造成損傷，且低濃度時即可對體腔細(xì)胞產(chǎn)生基因毒性效應(yīng)，說明蚯蚓對TCC有較高的敏感性。隨著染毒濃度、染毒時間的增加，損傷也隨之增加，這說明DNA損傷程度與TCC的劑量呈正相關(guān)。環(huán)境中TCC濃度的增加，破壞了細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致進(jìn)入蚯蚓體內(nèi)的TCC含量增加，大量的TCC對蚯蚓的氧化脅迫作用加強(qiáng)，抑制了蚯蚓機(jī)體的解毒能力及自我修復(fù)能力，加劇細(xì)胞DNA的損傷。染毒第28天，各處理組蚯蚓Olive尾距(OTM)值的增長幅度減緩，與21 d時差距不大，機(jī)體ROS含量回落接近于空白水平，表明蚯蚓機(jī)體開始自我修復(fù)，削弱了TCC對蚯蚓細(xì)胞的損傷程度。損傷較輕的細(xì)胞通過DNA自我修復(fù)機(jī)制將損傷逐漸降低，直至恢復(fù)至正常水平[36]。

綜上所述，TCC能對蚯蚓機(jī)體產(chǎn)生一定程度氧化脅迫，刺激蚯蚓機(jī)體產(chǎn)生大量的ROS，從而激活體內(nèi)的抗氧化酶和解毒酶來消除過量的ROS，維持正常的氧化還原應(yīng)激反應(yīng)。過量的ROS還會造成細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生過氧化產(chǎn)物MDA，對細(xì)胞DNA造成損傷，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本研究證實(shí)了TCC能夠?qū)︱球緳C(jī)體產(chǎn)生氧化脅迫及DNA損傷，但研究內(nèi)容有限，還需更深入探究。