撲草凈、辛硫磷和亞甲基藍(lán)制劑對(duì)凡納濱對(duì)蝦的急性毒性及組織病理改變

周桂嫻，馬榮榮，楊宗英，胡鯤,*

1. 上海海洋大學(xué)，國(guó)家水生動(dòng)物病原庫(kù)，上海 201306 2. 上海海洋大學(xué)，水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306 3. 農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306 4. 寧波大學(xué)，寧波 315000 5. 南昌市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，南昌 330038

撲草凈是一種常見的三氯苯類除草劑，穩(wěn)定性很強(qiáng)，易溶于有機(jī)溶劑，可用來(lái)去除闊葉草[1]。撲草凈的半衰期較長(zhǎng)，土壤中為12～18個(gè)月，地下水中達(dá)88 d，光照條件下河水中是263 d[2]。山東萊州灣近海水域中撲草凈的殘留濃度達(dá)到21.2 mg·L-1[3]。李如茵等[4]研究發(fā)現(xiàn)，近年來(lái)因具有清除水體中絲狀藻類和水草的功能，撲草凈也被頻繁用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中，導(dǎo)致水產(chǎn)品中的撲草凈殘留嚴(yán)重，極大影響了消費(fèi)者的健康。

辛硫磷是一種常見的有機(jī)磷類殺蟲劑，因具有高效、低毒等優(yōu)點(diǎn)被用于農(nóng)作物蟲害防治。辛硫磷被膽堿酯酶代謝后抑制膽堿酯酶的活性，導(dǎo)致乙酰膽堿在突觸內(nèi)聚集，引起生物神經(jīng)功能紊亂，從而引發(fā)中毒癥狀[5]。近些年來(lái)，辛硫磷不僅用于稻蝦立體種養(yǎng)模式中農(nóng)作物防蟲，而且用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中防治魚類寄生蟲病害[6]以及魚類敗血癥[5]。辛硫磷對(duì)不同水產(chǎn)動(dòng)物的安全濃度差異比較大，對(duì)虹鱒幼魚的96 h安全濃度是0.407 μg·L-1，屬于劇毒藥物[7]。用辛硫磷殺蟲風(fēng)險(xiǎn)高[8]，因?yàn)樗軌驑O大地影響羅非魚的成活率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，辛硫磷對(duì)斑馬魚是一種高毒藥物[5]。辛硫磷對(duì)凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖的安全性沒有相關(guān)的研究報(bào)道。

亞甲基藍(lán)又名次甲基藍(lán)，是一種噻嗪類的染料，近些年來(lái)作為孔雀石綠的替代品在水產(chǎn)養(yǎng)殖中經(jīng)常使用，可以有效控制和治愈魚類的疾病(如爛鰓病和爛皮病等)[9]。亞甲基藍(lán)是潛在的高風(fēng)險(xiǎn)化合物，美國(guó)和日本等都不允許使用，盡管亞甲基藍(lán)的毒性與孔雀石綠相比并不強(qiáng)，但仍然有可能對(duì)人類健康帶來(lái)影響[10]。

凡納濱對(duì)蝦是我國(guó)普遍養(yǎng)殖的優(yōu)良對(duì)蝦品種之一，具有廣鹽度養(yǎng)殖、產(chǎn)量較高、養(yǎng)殖周期較短和肉質(zhì)鮮美等優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái)隨著對(duì)蝦病害頻繁發(fā)生、養(yǎng)殖水域環(huán)境的惡化、稻蝦養(yǎng)殖模式的興起，一些化學(xué)品如撲草凈、辛硫磷和亞甲基藍(lán)等在凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖中被使用并后續(xù)在環(huán)境中被檢出。雖然，這些化學(xué)品屬于殺蟲劑、消毒劑和除草劑，在水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中也會(huì)被使用。在凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖過(guò)程中，撲草凈可以有效去除青苔及水草對(duì)養(yǎng)殖水體的影響，辛硫磷被用來(lái)防治對(duì)蝦寄生蟲，亞甲基藍(lán)被用來(lái)治療凡納濱對(duì)蝦的纖毛蟲和黑鰓病，但撲草凈、辛硫磷和亞甲基藍(lán)對(duì)凡納濱對(duì)蝦的安全性方面卻沒有相關(guān)的研究報(bào)道。

本文以凡納濱對(duì)蝦幼蝦為實(shí)驗(yàn)材料，得到了撲草凈、辛硫磷和亞甲基藍(lán)對(duì)凡納濱對(duì)蝦的48 h半數(shù)致死濃度(48 h-LC50)及安全濃度，并分析了隨著時(shí)間延長(zhǎng)3種藥物對(duì)凡納濱對(duì)蝦的肝胰腺、腸道組織的影響，旨在探究3種藥物對(duì)凡納濱對(duì)蝦的急性毒性，為3種藥物在凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖中合理使用和安全性評(píng)估提供參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 受試動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)所用凡納濱對(duì)蝦由上海農(nóng)滄水產(chǎn)養(yǎng)殖公司提供，選擇無(wú)病、規(guī)格均勻且活力較好的幼蝦進(jìn)行本次實(shí)驗(yàn)。平均體長(zhǎng)(6.0±1) cm，平均體重(3.0+1) g，暫養(yǎng)后選取400尾進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)在室內(nèi)進(jìn)行，使用的水是由充分曝氣無(wú)余氯殘留的自來(lái)水和過(guò)濾消毒后的近海海水混合組成。將幼蝦放入500 L塑料桶中暫養(yǎng)，用充氣泵24 h連續(xù)打氧。將養(yǎng)殖水體水溫穩(wěn)定在(25±1) ℃，pH 8.5±0.5，溶解氧濃度>6.0 mg·L-1，鹽度3‰。每日3次按照對(duì)蝦總體重5%投喂配合飼料，暫養(yǎng)7 d。為防止水質(zhì)污染，每日定時(shí)吸取桶底殘餌糞便并換水10%，馴養(yǎng)期間死亡率不超過(guò)5%。實(shí)驗(yàn)前1 d停止投喂，對(duì)幼蝦進(jìn)行撲草凈等3種化學(xué)品的急性毒性實(shí)驗(yàn)。急性毒性實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，使用容積為20 L的塑料桶，實(shí)驗(yàn)水體為10 L，桶內(nèi)放入連接打氧泵的氣泡頭以保證溶氧。為防止受試動(dòng)物從桶中跳出，使用40目軟尼龍網(wǎng)覆蓋在桶面。在試驗(yàn)期間，每隔24 h換試驗(yàn)液一次。在用10% 48 h-LC50藥物濃度處理對(duì)蝦后，分別在0、2、4和6 d分離對(duì)蝦肝胰腺及腸道做組織切片時(shí)，實(shí)驗(yàn)養(yǎng)殖容器為50 L的塑料桶，每桶50尾對(duì)蝦。

1.1.3 供試試劑

撲草凈：浙江中山化工集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)，有效成分含量為40%的可濕性粉劑，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)號(hào)為GB23553—2009。辛硫磷：山東埃森化學(xué)有限公司生產(chǎn)，有效成分含量為40%的乳油制劑，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)號(hào)為GB9557—2008。亞甲基藍(lán)：天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司生產(chǎn)，有效成分含量為98.5%的標(biāo)準(zhǔn)品。飽和苦味酸：西隴化工股份有限公司，有效成分含量為99.8%。甲醛溶液：西隴化工股份有限公司，分析純。乙酸：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純。

撲草凈和辛硫磷采用了符合國(guó)標(biāo)的農(nóng)藥商品制劑，撲草凈商品制劑中60%其余成分主要是分散劑SD-8113、乙二醇、黃原膠和硅酸鋁鎂等助劑；辛硫磷商品制劑中60%的其他成分主要包含寧乳、乙二醇、黃原膠、有機(jī)硅消泡劑和水等，查閱相關(guān)文獻(xiàn)，鮮有對(duì)凡納濱對(duì)蝦的毒性研究[11-12]。

1.1.4 儀器設(shè)備

NIKON Eclipse ci顯微鏡，NIKON digital sight DS-FI2成像系統(tǒng)，日本NIKON公司。

1.2 LC50的測(cè)定

正式實(shí)驗(yàn)之前先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)方法參考《水生生物毒性試驗(yàn)方法》[13]，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果確定正式實(shí)驗(yàn)的藥物濃度。正式實(shí)驗(yàn)藥物濃度的確定依據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果用對(duì)數(shù)等間距法在濃度范圍中設(shè)置5～6個(gè)濃度梯度和自然狀態(tài)下的空白對(duì)照組[14]。實(shí)驗(yàn)采用靜水法，每種藥物組設(shè)置1個(gè)空白對(duì)照組，每個(gè)實(shí)驗(yàn)濃度同時(shí)設(shè)置3個(gè)平行，每組10尾蝦。實(shí)驗(yàn)期間定時(shí)觀察蝦體的存活狀態(tài)、活力狀態(tài)以及是否有中毒癥狀，及時(shí)撈出死亡的幼蝦，統(tǒng)計(jì)并記錄24 h和48 h的幼蝦存活情況。將得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2016進(jìn)行處理，得到藥物濃度-死亡率的線性回歸方程，來(lái)計(jì)算凡納濱對(duì)蝦幼蝦暴露在藥物中24 h和48 h的半致死濃度(24 h-LC50和48 h-LC50)以及相應(yīng)的95%置信區(qū)間[15]。最后采用特倫堡(Turubell)公式計(jì)算實(shí)驗(yàn)藥品的安全濃度(SC)[16]，SC=48 h-LC50×0.3/(24 h-LC50/48 h-LC50)2。

1.3 組織切片的制作

在急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，找出各藥物48 h-LC50，用10% 48 h-LC50藥物濃度處理凡納濱對(duì)蝦并同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組。在0、2、4和6 d分離對(duì)蝦肝胰腺和腸道，放入Bouin’s溶液固定24 h，隨后放入濃度為75%的乙醇中保存。通過(guò)剖取組織，常規(guī)取材，脫水，包埋，制片，蘇木精-伊紅(HE)染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察并描述，并拍攝對(duì)應(yīng)主要描述中不同種類的病變部位。

2 結(jié)果(Results)

2.1 凡納濱對(duì)蝦的急性毒性

2.1.1 3種藥物對(duì)凡納濱對(duì)蝦的急性毒性

撲草凈、辛硫磷和亞甲基藍(lán)對(duì)凡納濱對(duì)蝦的急性毒性結(jié)果如表1所示。實(shí)驗(yàn)期間，所有空白對(duì)照組均未發(fā)現(xiàn)死亡情況。凡納濱對(duì)蝦給藥前期中毒癥狀主要是出現(xiàn)狂游、狂跳、不斷碰撞箱壁的行為，隨著中毒時(shí)間的增長(zhǎng)對(duì)蝦漸漸安靜、運(yùn)動(dòng)能力減弱、出現(xiàn)側(cè)臥或者直接死亡。觀察死亡后的對(duì)蝦狀態(tài)，可以看出凡納濱對(duì)蝦在受到撲草凈和亞甲基藍(lán)的毒害死亡之后，蝦體呈乳白色，頭部發(fā)黑；辛硫磷中毒死亡的對(duì)蝦，身體明顯發(fā)紅。凡納濱對(duì)蝦的死亡率與藥物濃度和暴露時(shí)間呈正相關(guān)。相同藥物濃度，暴露時(shí)間越長(zhǎng)，凡納濱對(duì)蝦的死亡數(shù)量越高；在同一時(shí)間內(nèi)，藥物濃度越高則凡納濱對(duì)蝦死亡率也隨著上升。隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)，低濃度藥物組中的幼蝦基本與空白對(duì)照組的幼蝦狀態(tài)一致，高濃度藥物組中的幼蝦在實(shí)驗(yàn)期間(48 h)，3種供試藥物的毒性隨著藥物濃度增大和實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)增強(qiáng)的趨勢(shì)，有顯著的劑量和時(shí)間效應(yīng)。其中，撲草凈、辛硫磷的研究結(jié)果只針對(duì)其商品化的制劑，不排除有聯(lián)合毒性作用產(chǎn)生的可能。

表1 3種藥物對(duì)凡納濱對(duì)蝦的急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 The acute toxicity test results of three kinds of chemicals to Penaeus vannamei

2.1.2 3種藥物對(duì)凡納濱對(duì)蝦的半致死濃度、安全濃度和回歸方程

根據(jù)表1中急性毒性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，經(jīng)過(guò)excel處理之后可以得到表2中回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r2)、半致死濃度(LC50)和安全濃度(SC)。撲草凈對(duì)凡納濱對(duì)蝦的24 h-LC50和48 h-LC50為13.517 mg·L-1和5.050 mg·L-1，安全濃度為0.211 mg·L-1；辛硫磷對(duì)凡納濱對(duì)蝦的24 h-LC50和48 h-LC50為6.32 μg·L-1和1.03 μg·L-1，安全濃度為0.0083 μg·L-1；亞甲基藍(lán)對(duì)凡納濱對(duì)蝦的24 h-LC50和48 h-LC50為5.769 mg·L-1和4.698 mg·L-1，安全濃度為0.935 mg·L-1。由表2可知，這3種藥物對(duì)凡納濱對(duì)蝦的毒性為辛硫磷>亞甲基藍(lán)>撲草凈。

表2 3種藥物對(duì)凡納濱對(duì)蝦的半致死濃度(LC50)和安全濃度(SC)Table 2 The values of median lethal concentration (LC50) and safe concentration (SC) of three kinds of chemicals to Penaeus vannamei

2.2 3種藥物對(duì)蝦組織病理學(xué)的影響

2.2.1 撲草凈對(duì)凡納濱對(duì)蝦的組織病理學(xué)影響

2.2.1.1 肝胰腺組織病理變化

撲草凈脅迫凡納濱對(duì)蝦0 d的肝胰腺組織結(jié)構(gòu)如圖1(a)所示，肝胰臟中肝管排列緊密，肝管壁由單層柱狀細(xì)胞組成，主要為分泌細(xì)胞和吸收細(xì)胞，分泌細(xì)胞內(nèi)可見大小不等的液泡，小管間隙有少量結(jié)締組織及毛細(xì)血管，組織未見明顯異常。撲草凈處理0 d組(圖1(a))和2 d組(圖1(b))肝胰臟中肝管排列緊密，肝管壁由單層柱狀細(xì)胞組成，主要為分泌細(xì)胞和吸收細(xì)胞，分泌細(xì)胞內(nèi)可見大小不等的液泡，肝小管間隙有少量結(jié)締組織及毛細(xì)血管。撲草凈處理4 d組(圖1(c))，肝小管排列緊密，但可以看到管壁細(xì)胞壞死，胞核固縮深染，少量小管結(jié)構(gòu)破壞，管壁細(xì)胞缺失。撲草凈處理6 d組(圖1(d))，局部肝管排列疏松，間質(zhì)增寬，間質(zhì)內(nèi)可見較多鄰近組織脫落的細(xì)胞，可見部分炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

圖1 撲草凈脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦的肝胰腺組織形態(tài)的影響注：(a)撲草凈處理0 d組；(b)撲草凈處理2 d組；(c)撲草凈處理4 d組，管壁細(xì)胞壞死()或缺失()；(d)撲草凈處理6 d組，間質(zhì)內(nèi)可見較多鄰近組織脫落的細(xì)胞()偶見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)()。Fig. 1 Effect of prometryn stress on hepatopancreas morphology of Penaeus vannameiNote: (a) 0 d group of prometryn treatment; (b) 2 d group of prometryn treatment; (c) 4 d group of prometryn treatment, and the wall cells were necrotic () or absent (); (d) 6 d group of prometryn treatment, and more cells from adjacent tissues were observed in the interstitium () and occasionally inflammatory cell infiltration was observed ().

2.2.1.2 腸道組織病理變化

圖2(a)所示，組織中黏膜層上皮細(xì)胞排列緊密，呈柱狀，形態(tài)正常，上皮細(xì)胞內(nèi)側(cè)可見幾丁質(zhì)層，上皮外側(cè)可見結(jié)締組織層及肌層，組織整體未見明顯異常。撲草凈處理2 d組(圖2(b))腸道組織的黏膜層上皮完整，上皮細(xì)胞排列緊密，腸腔內(nèi)可見少量脫落的上皮樣細(xì)胞，與0 d相比基本無(wú)異常；撲草凈處理4 d組(圖2(c))，黏膜層局部上皮缺失，腸腔內(nèi)明顯可見大量脫落的上皮細(xì)胞，較多上皮細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)疏松淡染；撲草凈處理6 d組(圖2(d))，黏膜層大量上皮細(xì)胞脫落入管腔，較多上皮細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)呈空泡狀。

圖2 撲草凈脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦的腸道組織形態(tài)的影響注：(a)撲草凈處理0 d組；(b)撲草凈處理2 d組，少量上皮細(xì)胞脫落()；(c)撲草凈處理4 d組，上皮缺失()，腸腔內(nèi)有脫落的上皮細(xì)胞()，上皮細(xì)胞胞質(zhì)疏松()；(d)撲草凈處理6 d組，上皮細(xì)胞大量脫落入管腔()，胞質(zhì)呈空泡狀()。Fig. 2 Effect of prometryn stress on gut morphology of Penaeus vannameiNote: (a) 0 d group of prometryn treatment; (b) 2 d group of prometryn treatment, a small number of epithelial cells were shed (); (c) 4 d group of prometryn treatment, epithelial deletion (), detached epithelial cells () in the lumen, and loose cytoplasm of epithelial cells (); (d) 6 d group of prometryn treatment, epithelial cells were shed into lumen (), and cytoplasm was vacuolized ().

2.2.2 辛硫磷對(duì)凡納濱對(duì)蝦的組織病理學(xué)變化

2.2.2.1 肝胰腺組織病理變化

辛硫磷脅迫凡納濱對(duì)蝦0 d的肝胰腺組織結(jié)構(gòu)如圖3(a)所示，肝胰腺中肝管排列緊密，肝管壁由單層柱狀細(xì)胞組成，主要為分泌細(xì)胞和吸收細(xì)胞，分泌細(xì)胞內(nèi)可見大小不等的液泡，小管間隙有少量結(jié)締組織及毛細(xì)血管，組織未見明顯異常。與辛硫磷處理0 d相比，2 d組(圖3(b))肝管排列緊密，少量管壁細(xì)胞脫離基底膜，并可見管壁斷裂，管壁細(xì)胞脫落。辛硫磷處理4 d組(圖3(c))，肝管排列緊密，少量管壁細(xì)胞脫落入管腔，較多管壁上皮細(xì)胞脫離基底膜，部分管壁細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)疏松淡染。辛硫磷處理6 d組(圖3(d))，局部肝管排列疏松，間質(zhì)增寬，少量管壁上皮細(xì)胞脫離基底膜，少量管壁不完整，細(xì)胞缺失，少量管壁細(xì)胞脫落入管腔。

2.2.2.2 腸道組織病理變化

如圖4(a)所示，組織中黏膜層上皮細(xì)胞排列緊密，呈柱狀，形態(tài)正常，上皮細(xì)胞內(nèi)側(cè)可見幾丁質(zhì)層，上皮外側(cè)可見結(jié)締組織層及肌層，組織整體未見明顯異常。與辛硫磷處理0 d相比，2 d組(圖4(b))組織黏膜層少量上皮細(xì)胞脫落，上皮細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)呈空泡狀；辛硫磷處理4 d組(圖4(c))，組織局部黏膜上皮細(xì)胞缺失，腸腔內(nèi)可見少量脫落的上皮細(xì)胞，上皮細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)空泡狀。辛硫磷處理6 d組(圖4(d))，腸組織大面積溶解，局部可見上皮細(xì)胞脫落。

圖4 辛硫磷脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦的腸道組織形態(tài)的影響注：(a)辛硫磷處理0 d組；(b)辛硫磷處理2 d組，上皮細(xì)胞脫落()胞質(zhì)呈空泡狀()；(c)辛硫磷處理4 d組，上皮細(xì)胞缺失()，腸腔內(nèi)有脫落的上皮細(xì)胞()，胞質(zhì)空泡狀()；(d)辛硫磷處理6 d組，腸組織大面積溶解()，局部可見上皮細(xì)胞脫落()。Fig. 4 Effect of phoxim stress on gut morphology of Penaeus vannameiNote: (a) 0 d group of phoxim treatment group; (b) 2 d group of phoxim treatment group, the epithelial cells were exfoliated () and the cytoplasm was vacuolar (); (c) 4 d group of phoxim treatment group, epithelial cells were absent (), epithelial cells were shed in the lumen (), and cytoplasmic vacuoles () were observed; (d) 6 d group of phoxim treatment group, large area of intestinal tissue was dissolved (), and epithelial cells were shed locally ().

2.2.3 亞甲基藍(lán)對(duì)凡納濱對(duì)蝦的組織病理學(xué)變化

2.2.3.1 肝胰腺組織病理變化

亞甲基藍(lán)脅迫凡納濱對(duì)蝦0 d的肝胰腺組織結(jié)構(gòu)如圖5(a)所示，肝胰腺中肝管排列緊密，肝管壁由單層柱狀細(xì)胞組成，主要為分泌細(xì)胞和吸收細(xì)胞，分泌細(xì)胞內(nèi)可見大小不等的液泡，小管間隙有少量結(jié)締組織及毛細(xì)血管，組織未見明顯異常。與亞甲基藍(lán)處理0 d相比，2 d組(圖5(b))少量肝管上皮變薄，管腔擴(kuò)大，液泡破裂，偶見管壁斷裂，少量管壁細(xì)胞脫落；亞甲基藍(lán)處理4 d組(圖5(c))，組織內(nèi)肝管排列疏松，部分肝管結(jié)構(gòu)破壞，不完整，細(xì)胞缺失，并可見管壁細(xì)胞脫離基底膜，少量管壁細(xì)胞壞死，胞核固縮深染或碎裂溶解；亞甲基藍(lán)處理6 d組(圖5(d))，小范圍肝管排列疏松，間隙增寬，少量肝管結(jié)構(gòu)不完整，管壁細(xì)胞缺失，并可見細(xì)胞脫落。

2.2.3.2 腸道組織病理變化

如圖6(a)所示，組織中黏膜層上皮細(xì)胞排列緊密，呈柱狀，形態(tài)正常，上皮細(xì)胞內(nèi)側(cè)可見幾丁質(zhì)層，上皮外側(cè)可見結(jié)締組織層及肌層，組織整體未見明顯異常。與亞甲基藍(lán)處理0 d相比，2 d組(圖6(b))腸組織，黏膜層為單層柱狀上皮，上皮向腸腔內(nèi)突起形成皺襞，黏膜下結(jié)締組織中可見較多毛細(xì)血管，結(jié)締組織外為肌層，腸腔內(nèi)可見少量脫落的細(xì)胞；亞甲基藍(lán)處理4 d組(圖6(c))，腸組織大面積溶解，大量上皮細(xì)胞消失，腸腔內(nèi)可見少量脫落的上皮細(xì)胞；亞甲基藍(lán)處理6 d組(圖6(d))，黏膜層上皮完全喪失，腸腔內(nèi)可見少量脫落的上皮細(xì)胞。

3 討論(Discussion)

3.1 撲草凈對(duì)凡納濱對(duì)蝦的急性毒性效應(yīng)

撲草凈對(duì)水生環(huán)境和生物都有一定的影響，不僅能夠直接對(duì)水生生物產(chǎn)生毒性，還可以通過(guò)對(duì)水體中的藻類、水草類的清除作用間接影響水生動(dòng)物生長(zhǎng)。據(jù)有關(guān)報(bào)道，2019年上旬，為控制青苔爆發(fā)，多家漁藥企業(yè)推出殺青苔的藥物，殺青苔的同時(shí)導(dǎo)致人工種植的水草大面積死亡，養(yǎng)殖蝦蟹大量死亡，這種除青苔的藥物主要成分就是撲草凈[17]。撲草凈對(duì)魚類也有很大影響，長(zhǎng)期暴露在撲草凈中的鯉魚免疫指標(biāo)超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽還原酶(GR)的活性有一定變化[18]。撲草凈對(duì)虹鱒魚的急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，96 h-LC50為2.9 mg·L-1[19]，屬于高毒藥物。在本實(shí)驗(yàn)中得到撲草凈對(duì)凡納濱對(duì)蝦的安全濃度為0.211 mg·L-1，是高度藥物，需謹(jǐn)慎使用。在研究中，使用了撲草凈的商品化制劑，其他成分沒有相關(guān)毒性作用研究結(jié)果，不能排除聯(lián)合毒性作用的可能。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，暴露在撲草凈試液中的凡納濱對(duì)蝦的肝胰腺組織隨著暴露時(shí)間的增長(zhǎng)，損傷越來(lái)嚴(yán)重。在暴露4 d和6 d后肝胰腺出現(xiàn)了少量小管結(jié)構(gòu)破壞、管壁細(xì)胞缺失等癥狀。撲草凈對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道組織也有一定的影響，隨著暴露時(shí)間的增長(zhǎng)，腸道粘膜層的上皮細(xì)胞溶解量增多，胞質(zhì)呈空泡狀。在水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中直接投入撲草凈、稻蝦養(yǎng)殖中用撲草凈清除稻田中的雜草可能導(dǎo)致?lián)洳輧魵埩?，這都可能對(duì)凡納濱對(duì)蝦健康產(chǎn)生影響。

3.2 辛硫磷對(duì)凡納濱對(duì)蝦的急性毒性效應(yīng)

辛硫磷是目前廣泛使用、高效和低毒的有機(jī)磷制劑，盡管有相關(guān)研究證明其對(duì)水生動(dòng)物有一定的毒性，但水產(chǎn)養(yǎng)殖中常被用來(lái)防治寄生蟲類[20]。辛硫磷對(duì)斑馬魚的毒性實(shí)驗(yàn)表明，撲草凈對(duì)斑馬魚胚胎、幼魚和成魚的48 h-LC50是45.72(28.79～129.4)、1.27(0.94～1.89)和1.38(0.97～2.91) mg·L-1；96 h-LC50是26.48(18.33～45.53)、0.89(0.61～1.18)和1.01(0.77～1.45) mg·L-1，屬于中高毒藥物[21]。在實(shí)驗(yàn)中，辛硫磷對(duì)凡納濱對(duì)蝦的24 h-LC50和48 h-LC50為6.32 μg·L-1和1.03 μg·L-1，安全濃度為0.0083 μg·L-1，表明凡納濱對(duì)蝦對(duì)辛硫磷極為敏感。研究實(shí)驗(yàn)中，使用了辛硫磷乳油商品制劑，所以并不排除其他成分與辛硫磷產(chǎn)生聯(lián)合毒性的可能。

觀察經(jīng)過(guò)一定濃度的辛硫磷處理后的凡納濱對(duì)蝦肝胰腺組織可知，凡納濱對(duì)蝦肝胰腺組織的損傷與辛硫磷濃度和暴露時(shí)間有緊密的關(guān)聯(lián)，在暴露4 d和6 d后的肝胰腺組織有肝管排列疏松，間質(zhì)增寬，少量管壁上皮細(xì)胞脫離基底膜，少量管壁不完整，細(xì)胞缺失，少量管壁細(xì)胞脫落入管腔等現(xiàn)象；腸道組織也出現(xiàn)了大面積溶解，局部可見上皮細(xì)胞脫落等不良現(xiàn)象。辛硫磷對(duì)魚蝦都有很強(qiáng)的毒性，且對(duì)蝦的毒性要比魚類更強(qiáng)，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)謹(jǐn)慎使用辛硫磷，以免造成不必要的損失。

3.3 亞甲基藍(lán)對(duì)凡納濱對(duì)蝦的毒性效應(yīng)

亞甲基藍(lán)是一種抗菌藥物，和孔雀石綠和結(jié)晶紫一樣，可以用于治療魚類的腐皮病等[22]，近年來(lái)也被用于治療對(duì)蝦纖毛蟲病和黑鰓。但是由于亞甲基藍(lán)可能會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生危害，所以在美國(guó)和日本等國(guó)家已經(jīng)被禁用，在中國(guó)還沒有相關(guān)的明確規(guī)定。亞甲基藍(lán)對(duì)鳑鲏?mèng)~幼魚的安全濃度為0.96 mg·L-1[23]，屬于高毒藥物；亞甲基藍(lán)對(duì)團(tuán)頭魴的安全濃度是8.84 mg·L-1[24]。亞甲基藍(lán)對(duì)凡納濱對(duì)蝦溞狀幼體、糠蝦和仔蝦的安全濃度分別為0.025、0.029和0.073 mg·L-1[25]，亞甲基藍(lán)對(duì)凡納濱對(duì)蝦的安全濃度隨著蝦體成長(zhǎng)而增大，本實(shí)驗(yàn)得到幼蝦的安全濃度是0.935 mg·L-1。

隨著暴露時(shí)間增長(zhǎng)，凡納濱對(duì)蝦肝胰腺和腸道組織都出現(xiàn)了更嚴(yán)重的病變。在暴露4 d和6 d后可以看出肝胰腺組織的部分肝管結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞缺失，少量管壁細(xì)胞壞死，胞核固縮深染或碎裂溶解；在暴露6 d后，腸道組織黏膜層上皮完全喪失，腸腔內(nèi)可見少量脫落的上皮細(xì)胞。亞甲基藍(lán)對(duì)凡納濱對(duì)蝦的毒性機(jī)制尚未有相關(guān)的研究成果，但從組織切片結(jié)果來(lái)看，對(duì)肝胰腺組織和腸道都有一定的損傷，所以在養(yǎng)殖過(guò)程中還需謹(jǐn)慎使用。