西瓜枯萎病抗性鑒定技術(shù)方案

閆聞 王喜慶 賈云鶴 付永凱 尤海波

摘? ? 要： 西瓜是我國重要的葫蘆科經(jīng)濟作物，西瓜枯萎病是真菌性土傳病害，在西瓜整個生長期均可發(fā)生，已嚴(yán)重影響到我國西瓜產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。筆者根據(jù)已有研究成果，對西瓜枯萎病的危害癥狀、病原菌分離鑒定及培養(yǎng)、人工接種鑒定技術(shù)、自然病圃鑒定等作了描述和規(guī)定，形成了適宜于西瓜枯萎病抗性鑒定的技術(shù)方案。

關(guān)鍵詞： 西瓜;枯萎病;人工接種;自然病圃;鑒定標(biāo)準(zhǔn);技術(shù)方案

中圖分類號：S651? 文獻標(biāo)志碼：B? 文章編號：1673-2871（2020）01-076-03

西瓜是一種重要的葫蘆科園藝作物，每年全球西瓜種植面積約350萬hm2，總產(chǎn)量約 10 000萬t[1]。我國是最大的西瓜生產(chǎn)和消費國，每年西瓜的種植面積約180萬hm2，總產(chǎn)量約 7 000 萬t（http：//faostat.fao.org）。西瓜在我國農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整和農(nóng)民增收中發(fā)揮著重要的作用。

西瓜枯萎病是由西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. niveum）侵染引起的一種在世界范圍內(nèi)廣泛發(fā)生的真菌土傳病害[2]，主要通過土壤傳播，也可由種子傳播，嚴(yán)重危害西瓜生產(chǎn)，導(dǎo)致西瓜產(chǎn)量嚴(yán)重下降甚至絕產(chǎn)[3]。目前，西瓜枯萎病菌有4個生理小種：生理小種0，1，2和3，不同的生理小種可通過特定的鑒別寄主鑒定[4]?？共∑贩N選育是防治枯萎病危害的經(jīng)濟有效的途徑?；诖?，筆者根據(jù)西瓜枯萎病的生物學(xué)特征，結(jié)合已有的研究基礎(chǔ)制定了西瓜枯萎病抗性鑒定技術(shù)方案，該方案經(jīng)多次應(yīng)用驗證，適合于西瓜枯萎病的抗性鑒定，為抗病種質(zhì)的篩選提供可靠的參考依據(jù)。

1 西瓜枯萎病病害癥狀

西瓜枯萎病在全生育期均可發(fā)病，在幼苗期發(fā)病較少，幼苗出土后，主要表現(xiàn)為莖基部變褐縊縮，子葉萎蔫下垂，幼苗猝倒，而后干枯死亡。多數(shù)病株從伸蔓期至果實膨大期發(fā)病，萎蔫枯萎是田間的典型癥狀，病株葉片自下而上逐漸萎蔫，似缺水狀，病情發(fā)展緩慢時，植株午間萎蔫，晚上逐漸恢復(fù)，幾次反復(fù)后病株不再恢復(fù)常態(tài)，萎蔫枯死，葉片不脫落，病情發(fā)展迅速時，葉片和莖蔓可突然由下而上全部萎蔫。病株的根部變褐腐爛，容易拔起，莖基部?？v裂，裂口處有褐色膠狀物，剖視病蔓基部，可見維管束變?yōu)楹稚?。在潮濕條件下，病部可產(chǎn)生白色或粉紅色霉?fàn)钗铩Ｔ趫F棵期，部分病株表現(xiàn)為植株生長緩慢、苗小、蔓細(xì)和葉瘦小發(fā)黃，莖部維管束變褐，雨后常出現(xiàn)裂莖，植株為畸形的小老苗[5-6]。

2 西瓜枯萎病病原菌的分離與鑒定

2.1 病原菌分離純化

采用組織分離法分離病原菌[7]。在西瓜枯萎病發(fā)生地塊，采集西瓜病株莖基部組織，2～3 cm，流水沖洗，用 75%乙醇消毒 30 s，用無菌水清洗 3～5 次，去除莖表皮，切成1～2 mm薄片，輕輕按壓貼于 PDA 培養(yǎng)基（馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉 15 g、蒸餾水 1 L）表面，25 ℃，恒溫條件下培養(yǎng) 3～5 d，長出真菌菌落后挑取邊緣菌絲再進一步純化。若無其它雜菌，擴繁后則可制備孢子懸浮液。

西瓜枯萎病菌孢子懸浮液制備方法：在固體培養(yǎng)基上挑取 1個 0.5 cm2 菌片放入200 mL PL培養(yǎng)基（配方為：1 000 mL 水，馬鈴薯 200 g，乳糖 20 g）中，于搖床中 25 ℃、110 r·min-1 培養(yǎng) 5～7 d，將菌液用滅菌的4層紗布過濾，用血球計數(shù)板記數(shù)并調(diào)整孢子濃度為5×106個·mL-1。

2.2 病原菌鑒定

形態(tài)學(xué)特征：病原菌在 PDA 培養(yǎng)基上呈白色菌絲、隨著生長中間呈粉紅色、淡紅色、淡紫色、紫紅色等，菌落圓形，菌絲絨毛狀（圖1-A）。大型分生孢子為鐮刀型，有 3～5個分隔，以3個分隔為主（圖1-B）[10];小型分生孢子，橢圓形，0～1個分隔，以無隔為主（圖1-C）;分生孢子梗短、生于菌絲側(cè)面，單生，無分枝;厚垣孢子頂生或間生，圓形，多為單獨生長，偶爾也對生或串生[8-10]。

分子生物學(xué)鑒定：將病原菌接種于PL液體培養(yǎng)基，在25 ℃、110 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)3～4 d，過濾收集菌絲體，按照真菌基因組DNA提取試劑盒提取病原菌DNA，用真菌通用引物ITS1/ITS4（ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG，ITS4：TCCT

CCGCTTATTGATATGC）對病原菌 rDNA 的 ITS 區(qū)域進行 PCR 擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收、測序，將該序列提交至 GenBank，通過 BLAST進行序列比對，分析待檢菌株與Fusarium oxysporum同源性[10]。

病原菌回接試驗：確保分離的菌是西瓜枯萎病病原菌，完成柯赫氏法則。

生理小種鑒定：西瓜枯萎病菌生理小種鑒定采用Sugar Baby（或 Black Diamond），Charleston Gray，Calhoun Gray 和 PI296341-FR 作為一套鑒別寄主，生理小種劃分標(biāo)準(zhǔn)見表 1[4]，接種鑒定技術(shù)詳見枯萎病苗期人工接種鑒定：

3 西瓜枯萎病苗期人工接種鑒定

3.1 接種方法

3.1.1 壯苗培養(yǎng) 西瓜種子消毒催芽，1.5 %次氯酸鈉溶液消毒20 min，中間翻動1次，消毒結(jié)束后用流水沖洗干凈，浸種12 h，用濕毛巾包好在30 ℃恒溫箱中催芽，當(dāng)80%以上的種子出芽時播種。在育苗盤中裝入滅菌的蛭石，澆透水，播種后用蛭石覆蓋，并蓋薄膜保溫保濕。出苗后白天溫度控制在24～28 ℃，夜溫在18 ℃度左右，防止徒長。

3.1.2 采用浸根法接種 孢子液浸根法接種，植株發(fā)病迅速、均勻，可縮短西瓜枯萎病的病程 [11-12] 。菌液的孢子濃度為5×106個·mL-1，待鑒定的不同西瓜種質(zhì)幼苗以 25～30 株幼苗為 1 組，重復(fù) 3 次，接種前按苗數(shù)準(zhǔn)備營養(yǎng)缽，裝入高溫滅菌的草炭土。播種后8～10 d，2片子葉平展時接種，接種在遮陰條件下進行，選取長勢一致的幼苗從蛭石中取出，根系輕度損傷，洗凈根部，在準(zhǔn)備好的孢子液中浸根15 min，保持根系全部浸入，中間搖動2～3次，防止孢子沉降。浸根接種后，幼苗移栽至營養(yǎng)缽中。

3.1.3 接種后的植株培養(yǎng) 接種后前3 d保持遮陰，溫度保持在24～30 ℃，3 d緩苗后撤掉遮陽網(wǎng)，剔除不正常的苗子，自然光照條件下培養(yǎng)。

3.2 鑒定標(biāo)準(zhǔn)

感病寄主在接種后5～10 d發(fā)病，記錄寄主的生長和發(fā)病狀況，接種后15～21 d，調(diào)查病情指數(shù)，植株被定為0～5級，接種后癥狀見圖2[13]： 0級，無癥狀;1級，晴天中午子葉萎蔫或部分子葉、真葉輕微萎蔫;2級， 1片真葉萎蔫或子葉較重萎蔫;3級，子葉及真葉萎蔫，阻礙發(fā)育;4級，整株萎蔫，60%以上枯死，心葉成活;5級，整株嚴(yán)重萎蔫并枯死[13]。

抗性分級，以病株率進行評價：病株率≤20%為高抗：病株率21%～50%為中抗;病株率51%～80%為輕抗;病株率>80%為感病 [4] 。

病情指數(shù)=（∑（各級株數(shù)×發(fā)病級數(shù)）/總株數(shù)）×最高病級×100。

病株率/%=發(fā)病植株之和（株）/調(diào)查總株數(shù)（株）×100。

4 西瓜枯萎病自然病圃鑒定

自然病圃為西瓜連作地，土壤中西瓜枯萎病菌數(shù)量在1×104～1×105 cfu·g-1。待鑒定西瓜種質(zhì)常規(guī)方法育苗，2葉1心定植于病圃大棚內(nèi)，10株1組，設(shè)3 次重復(fù)，植株伸蔓后開始進行發(fā)病率統(tǒng)計，直至收瓜后結(jié)束調(diào)查。調(diào)查時，按照0～3級病情分級標(biāo)準(zhǔn)，逐株記錄發(fā)病情況，其中0級：健株，長勢良好無病癥;l 級：病株葉片自下而上逐漸萎蔫，似缺水狀，中午更為明顯，早晚尚能恢復(fù);2級：病株葉片萎蔫，不能再恢復(fù)正常;3級：整株葉片呈發(fā)黃枯萎下垂，不能再恢復(fù)正常，葉片枯黃至全株死亡。病情指數(shù)和發(fā)病率計算公式、抗性分級標(biāo)準(zhǔn)同3.2。

5 小 結(jié)

苗期人工接種結(jié)合自然病圃鑒定結(jié)果，可全面的分析待鑒定西瓜種質(zhì)對枯萎病的抗性情況，有助于枯萎病抗性種質(zhì)資源的篩選和新品種抗病性評價。

本文所述技術(shù)方案對西瓜枯萎病的病害癥狀和病原菌的鑒定方法進行了詳細(xì)描述，同時對苗期接種和自然病圃鑒定方法及抗病鑒定指標(biāo)進行系統(tǒng)性規(guī)范。該技術(shù)方案的制定，將為枯萎病抗性種質(zhì)資源的篩選和新品種抗病性評價提供技術(shù)指導(dǎo)。

參考文獻

[1] XIE X， HUANG C， CAI Z， et al. Targeted acquisition of Fusarium oxysporum f. sp. niveum toxin-deficient mutant and its effects on watermelon Fusarium wilt[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2019， 67， 8536-8547.

[2] 魏君革，孫海燕，李偉，等. 西瓜枯萎病菌侵染西瓜根莖部的組織病理學(xué)觀察[J]. 植物保護， 2014， 40（3）：37-41.

[3] REN Y， JIAO D， GONG G， et al. Genetic analysis and chromosome mapping of resistance to Fusarium oxysporum f. sp. niveum （FON） race 1 and race 2 in watermelon （Citrullus lanatus L.） [J]. Molecular Breeding， 2015， 35：183.

[4] 耿麗華，郭紹貴，呂桂云，等. 西瓜枯萎病菌生理小種鑒定技術(shù)體系的建立和驗證[J]. 中國蔬菜，2010， 20：52-56.

[5] 王建明，鄭經(jīng)武，賀運春. 西瓜枯萎病田間癥狀類型及侵染來源的研究[J]. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1992，12（4）：352-354.

[6] 陳澤南，梁少華，楚簫，等. 西瓜主要病害的識別和綜合防治方法[J]. 中國瓜菜，2019， 32（5）：76-77.

[7] 方中達. 植病研究方法[M]. 3版.北京： 中國農(nóng)業(yè)出版社， 1998： 122-127.

[8] 吉加兵. 西瓜枯萎病菌的形態(tài)及生物學(xué)特性研究初報[J]. 中國西瓜甜瓜，1992，5（2）： 33-36.

[9] 吳學(xué)宏， 韓魯明， 陳倩， 等. 西瓜種傳鐮刀菌形態(tài)和分子鑒定及其對種子發(fā)芽的影響[J]. 植物病理學(xué)報， 2009，39（2）： 118-124.

[10] 耿麗華，宮國義，宋順華，等. 西瓜種傳枯萎病病原菌鑒定及其防控方法[J].植物保護學(xué)報，2019，46（2）：330-336.

[11] 李曉慧，梁慎，常高正，等. 西瓜枯萎病苗期抗性鑒定及抗源篩選[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，46（17）：91-94.

[12] 王喜慶，賈云鶴，尤海波. 黑龍江省西瓜枯萎病菌生理小種鑒定及抗病鑒定方法篩選[J]. 北方園藝，2013（2）：103-107.

[13] MERU G， MCGREGOR C. Genotyping by sequencing for SNP discovery and genetic mapping of resistance to race 1 of Fusarium oxysporum in watermelon[J]. Scientia Horticulturae， 2016， 209：31-40.