先天性白內(nèi)障一患病家系的突變基因篩查

王中英 劉善賀 鄭貴倩

[摘要]目的 對先天性藍(lán)點(diǎn)狀白內(nèi)障一患病家系進(jìn)行致病基因突變篩查，以探索其潛在遺傳學(xué)缺陷。方法 2017年9月收集黑龍江省一個(gè)先天性藍(lán)點(diǎn)狀白內(nèi)障家系，對該家系及正常對照者進(jìn)行詳細(xì)的病史采集及臨床相關(guān)檢查后，應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）測序法對其進(jìn)行白內(nèi)障熱點(diǎn)候選基因的突變檢測。結(jié)果 在該家系患者的GJA8基因發(fā)現(xiàn)了c.10T>C的雜合錯(cuò)義突變，導(dǎo)致第4位高度保守的色氨酸改變?yōu)榫彼幔╬.W4R），而家系內(nèi)正常成員及正常對照者中均未發(fā)現(xiàn)該突變。結(jié)論 GJA8基因c.10T>C點(diǎn)突變是該患病家系的潛在遺傳學(xué)病因，拓展了先天性白內(nèi)障GJA8基因突變譜。

[關(guān)鍵詞]先天性白內(nèi)障;GJA8基因;突變;縫隙連接蛋白

[中圖分類號(hào)] R776.1? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1674-4721（2020）2（b）-0004-04

[Abstract] Objective To screen mutation in pathogenic genes in a family with congenital blue dot cataract， so as to explore their potential genetic defects. Methods A congenital blue dot cataract family in Heilongjiang province was collected in September 2017. After detailed medical history collection and clinical examination of this family and normal controls， polymerase chain reaction （PCR） sequencing was used to detect the mutation of candidate genes in cataract hot spots. Results The heterozygous missense mutation of c.10T>C was found in the GJA8 gene of this family， which resulted in the change of the highly conserved tryptophan in the fourth position to arginine （p.W4R）， but the mutation was not found in the normal members of the family or the normal controls. Conclusion The GJA8 gene c.10T>C mutation is the potential genetic etiology of this family， which extends the GJA8 gene mutation spectrum of congenital cataract.

[Key words] Congenital cataract; GJA8 genes; Mutation; Connexin

先天性白內(nèi)障是一組由于晶狀體混濁且通常發(fā)生在出生時(shí)或兒童早期的疾病，是一種常見的視覺障礙性眼病，為全球兒童可治療性失明的首要原因[1-2]，據(jù)報(bào)道，其發(fā)病率在發(fā)展中國家明顯高于發(fā)達(dá)國家，約為其10倍[3]。晶狀體可表現(xiàn)有多種不同的混濁類型，如板層狀、核性、粉塵狀、藍(lán)點(diǎn)狀、花冠狀、極性等[4]。據(jù)報(bào)道，約50%的先天性白內(nèi)障與遺傳因素有關(guān)[5]，其主要有3種不同的遺傳方式：常染色體顯性遺傳（ADCC）、常染色體隱性遺傳（ARCC）及X連鎖隱性遺傳（XRCC），其中以ADCC最為常見。同時(shí)有研究證實(shí)，先天性白內(nèi)障具有明顯的遺傳異質(zhì)性[6]。直到今天，已有超過40多個(gè)致病候選位點(diǎn)（http：//omim.org/phenotypicSeries/PS116200）、200多個(gè)突變（https：//cat-map.wustl.edu/）被報(bào)道與先天性白內(nèi)障有關(guān)[7]。隨著高通量測序技術(shù)的迅猛發(fā)展，越來越多的基因及突變位點(diǎn)被鑒定出與先天性白內(nèi)障的發(fā)生相關(guān)，然而在這些突變位點(diǎn)中，大約50%位于編碼晶狀體蛋白的基因：CRYAA、CRYBA1/A3、CRYAB、CRYBA4、CRYBB1、CRYBB2、CRYGC、CRYGD和CRYGS[8]，1/4的突變來自于編碼晶狀體膜蛋白的基因GJA3和GJA8[9]。因而，這些基因被認(rèn)為是先天性白內(nèi)障的熱點(diǎn)致病基因。本研究對1例先天性藍(lán)點(diǎn)狀白內(nèi)障中國家系進(jìn)行熱點(diǎn)致病基因突變的進(jìn)行篩查研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

2017年9月收集黑龍江省一個(gè)先天性藍(lán)點(diǎn)狀白內(nèi)障家系，包括先證者、其家系內(nèi)其他2例已診斷明確的患者和2名與之有血緣關(guān)系的家系中正常成員。本研究首先對其進(jìn)行全面的體格檢查，排除其他眼部疾病及對其可能有影響的系統(tǒng)疾病。同時(shí)，從牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院眼科門診患者中隨機(jī)選取50份無白內(nèi)障的正常人外周血進(jìn)行對照。所有實(shí)驗(yàn)對象均采集外周靜脈血5 ml置于EDTA抗凝管中。本研究遵循《赫爾辛基宣言》，所有家系成員及對照者均知情同意。

1.2方法

1.2.1提取基因組DNA? 使用血液DNA提取試劑盒（TIANamp Blood DNA Kit，Tiangen Biltech）進(jìn)行提取和純化所有外周靜脈血基因組DNA;使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)來檢測樣本DNA純度及其濃度后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2設(shè)計(jì)候選基因特異性引物? 依據(jù)已報(bào)道的先天性白內(nèi)障突變基因的篩查情況，本研究選取以往研究關(guān)注的熱點(diǎn)致病基因及設(shè)計(jì)的引物序列[10]，所設(shè)計(jì)的引物覆蓋熱點(diǎn)基因的全部外顯子區(qū)。

1.2.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）測序分析? 按SYBRR Green PCR Master Mix（TakaRa生物工程公司提供）試劑盒制備實(shí)時(shí)定量PCR的反應(yīng)體系，將合格有效的產(chǎn)物送到上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行純化及DNA序列測定。測序結(jié)果使用在線blast軟件進(jìn)行分析，與美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫發(fā)布的基因堿基序列（參考基因組：NG_016242.1;轉(zhuǎn)錄本mRNA序列版本號(hào)NM_005267.4）進(jìn)行比對，以尋找堿基序列的改變。并查閱篩查GJA8，c.10T>C在ESP等各大數(shù)據(jù)庫中的頻率信息以排除多態(tài)位點(diǎn)。每個(gè)樣本重復(fù)并正反向測序3遍，如發(fā)現(xiàn)有堿基序列的改變并排除了該堿基是單核苷酸多態(tài)性的可能后，再將該位點(diǎn)與其余全部成員進(jìn)行對比，以確定該堿基序列的改變在該家系中是否與該疾病是共分離的。

1.2.4突變生物功能預(yù)測? 利用PolyPhen生物信息學(xué)軟件（http：//genetics.bwh.harvard.edu/pph/）對氨基酸的改變對蛋白質(zhì)功能及空間構(gòu)象的影響進(jìn)行預(yù)測。利用Misc Protein Analysis軟件（https：//fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_www.cgi？rm=misc1）對突變氨基酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)和疏水性改變進(jìn)行預(yù)測。利用NCBI-Protein https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/？term=GJA8獲得不同物種GJA8的氨基酸序列，采用MegAlign軟件進(jìn)行不同物種的保守性分析。

2結(jié)果

2.1該家系的臨床表現(xiàn)

先天性白內(nèi)障家系圖如圖1所示，經(jīng)系譜分析其遺傳方式為常染色體顯性遺傳;先證者眼前部檢查圖如圖2所示，為晶狀體藍(lán)色點(diǎn)狀混濁表型;家系中其他患病成員如其母親及其外婆均已行白內(nèi)障手術(shù)治療，無圖片提供。

2.2基因突變

PCR測序分析該家系GJA8基因測序圖如圖3（封三）所示，結(jié)果顯示，先證者及家系患者的GJA8基因發(fā)現(xiàn)了c.10T>C的雜合錯(cuò)義突變;家系內(nèi)正常成員及正常對照者中未發(fā)現(xiàn)雙峰樣的雜合突變。GJA8氨基酸序列的多序列對比圖如圖4（封三）所示，比對數(shù)據(jù)顯示，在許多物種中位于第4個(gè)氨基酸位置的色氨酸為高度保守序列，黑色矩形框所示。

2.3突變預(yù)測結(jié)果

PolyPhen生物信息學(xué)軟件的預(yù)測結(jié)果如圖5（封三）所示，Cx50-W4R得分為1.00，提示該突變可能為有意義的突變。Misc Protein Analysis軟件預(yù)測結(jié)果如圖6（封四）所示，結(jié)果顯示，先證者及家系患者p.W4R突變改變了氨基酸鏈的正常二級(jí)結(jié)構(gòu)，多增加了一個(gè)“轉(zhuǎn)角”結(jié)構(gòu)，如紅色矩形框所示。突變氨基酸的疏水性預(yù)測圖如圖7（封四）所示，結(jié)果顯示，先證者及家系患者蛋白質(zhì)的疏水性明顯降低，影響其跨膜結(jié)構(gòu)和溶解度，進(jìn)而改變蛋白質(zhì)的功能和自我聚集[11]，如紅色矩形框所示。

3討論

已有研究表明，人類第一個(gè)定位于常染色體上的疾病是遺傳性先天性白內(nèi)障，其致病基因位點(diǎn)突變會(huì)導(dǎo)致先天性白內(nèi)障的發(fā)生。本研究在對一例先天性藍(lán)點(diǎn)狀白內(nèi)障患病家系進(jìn)行致病基因突變篩查時(shí)，發(fā)現(xiàn)了GJA8基因的c.10T>C的雜合錯(cuò)義突變，導(dǎo)致第4位高度保守的色氨酸改變?yōu)榫彼幔╬.W4R），從而揭示了該家系的遺傳學(xué)缺陷。

縫隙連接蛋白（connexin，Cx）是重要的細(xì)胞膜蛋白，對于細(xì)胞間的信號(hào)傳導(dǎo)，轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)能量和代謝產(chǎn)物等具有重要的作用[12]。晶狀體是一種無血管結(jié)構(gòu)，其主要依靠Cx43、Cx46和Cx50介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊來維持晶狀體的穩(wěn)態(tài)和透明度[13]。Cx50蛋白在晶狀體上皮細(xì)胞和晶狀體纖維細(xì)胞內(nèi)皆有表達(dá)[11]，由GJA8基因進(jìn)行編碼，其主要功能是在細(xì)胞間運(yùn)輸離子及小分子物質(zhì)。Cx50蛋白經(jīng)過了4次的跨膜，形成了一個(gè)胞質(zhì)內(nèi)環(huán)、兩個(gè)細(xì)胞外環(huán)（E1、E2）以及位于該胞質(zhì)內(nèi)的C-末端和N-末端，相鄰的細(xì)胞外環(huán)之間通過相互作用形成連接子，相鄰兩個(gè)細(xì)胞間的連接子再通過相互連接構(gòu)成細(xì)胞間的縫隙連接通道。本研究通過測序及序列對比分析發(fā)現(xiàn)GJA8基因的c.10T>C的雜合錯(cuò)義突變，導(dǎo)致第4位高度保守的色氨酸改變?yōu)榫彼幔╬.W4R），并發(fā)現(xiàn)該突變體位于胞質(zhì)內(nèi)的N-末端。Oh等[14]通過研究發(fā)現(xiàn)Cx N-末端可以影響跨界電壓依賴性門控的靈敏性。Musa等[15]的實(shí)驗(yàn)也說明了Cx N-末端可能形成一個(gè)關(guān)鍵的細(xì)胞質(zhì)成孔區(qū)域，作為跨界電壓依賴的受體被細(xì)胞內(nèi)多胺封閉和阻斷。另外，還有研究表明，N-末端在滲透性方面也發(fā)揮著關(guān)鍵作用[16]。所以在本研究中，筆者認(rèn)為該突變體可能改變N-末端結(jié)構(gòu)，影響其發(fā)揮正常的功能作用。據(jù)報(bào)道，主要定位于細(xì)胞質(zhì)中的Cx50 R23T突變體會(huì)破壞縫隙連接的電導(dǎo)，影響細(xì)胞間的通訊，這可能是因?yàn)閹д姾傻木彼幔≧）轉(zhuǎn)變?yōu)椴粠щ姾傻臉O性氨基酸蘇氨酸（T）[17]。因此，筆者懷疑Cx50 W4R也可能是由于不帶電荷的極性氨基酸精氨酸（W）被帶正電荷的氨基酸（R）取代造成的。Cx50分布結(jié)果表明，Cx50 W4R影響Cx50在亞細(xì)胞中的分布和轉(zhuǎn)運(yùn)到質(zhì)膜，從而不能形成正常的半通道。因此，功能失調(diào)性縫隙連接可能是Cx50突變體導(dǎo)致白內(nèi)障的一種可能機(jī)制.

此外，Zhang等[18]通過靶向外顯子測序發(fā)現(xiàn)GJA8基因的c.10T>A的雜合錯(cuò)義突變也會(huì)導(dǎo)致第4位高度保守的色氨酸改變?yōu)榫彼幔╬.W4R），這與本實(shí)驗(yàn)研究的主要不同之處在于突變堿基的不同，但結(jié)果都為導(dǎo)致了同樣的氨基酸改變，并進(jìn)一步促進(jìn)了白內(nèi)障的發(fā)生。這種變異符合致病變異分級(jí)中的同一密碼子改變導(dǎo)致相同氨基酸改變這一標(biāo)準(zhǔn)[19]，并且本研究通過PolyPhen預(yù)測分析結(jié)果顯示該氨基酸與致病性變異有關(guān)，因此，進(jìn)一步提示該致病基因突變?yōu)閺?qiáng)致病性突變，為該家系的遺傳學(xué)致病原因之一。但這是否與不同的白內(nèi)障表型相關(guān)聯(lián)，還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，GJA8基因發(fā)生c.10T>C的雜合錯(cuò)義突變，導(dǎo)致第4位高度保守的色氨酸改變?yōu)榫彼幔╬.W4R）。該突變拓展了先天性白內(nèi)障GJA8基因突變譜，促進(jìn)了先天性白內(nèi)障的研究進(jìn)展，為研究尋找基因治療靶點(diǎn)提供了新的方向。

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（收稿日期：2019-08-14? 本文編輯：任秀蘭）