G蛋白偶聯(lián)受體突變分析的生物信息學方法及其資源研究

管翠萍　石晶　周學章

摘要：G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）參與調(diào)節(jié)人體各種生理過程，它的突變及基因多態(tài)性與多種人類遺傳性疾病相關(guān)，其中50%以上的疾病突變是由功能性單核苷酸多態(tài)性構(gòu)成的。因此，建立基因多態(tài)性與疾病的相關(guān)性研究成為主要熱點之一。隨著生物信息技術(shù)的發(fā)展，各種機器學習方法、特征提取和數(shù)據(jù)庫資源的綜合利用，極大地方便了GPCR的突變研究。介紹了GPCR上以功能性單核苷酸多態(tài)性突變?yōu)橹鞯纳镄畔W研究方法和數(shù)據(jù)資源。

關(guān)鍵詞：G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）；突變；功能性單核苷酸多態(tài)性；生物信息

中圖分類號：Q51；Q-332 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）22-5342-04

G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）是人體內(nèi)最大的膜受體蛋白家族，參與調(diào)節(jié)各種生理過程，在信號識別和轉(zhuǎn)導中起著重要作用，同時它也是藥物開發(fā)史上最有價值的藥物靶標。GPCR的突變及其基因多態(tài)性將會引起功能失調(diào)導致各種疾病的產(chǎn)生， 例如視紫紅質(zhì)受體突變會引發(fā)夜盲癥和色素性視網(wǎng)膜炎[1]；鈣敏感受體突變會引發(fā)遺傳性鈣代謝紊亂，導致家族性低鈣血癥和低鈣尿高血鈣癥的產(chǎn)生[2]；GPR56受體N末端突變會導致大腦皮質(zhì)畸形（BFPP）[3]等。在GPCRs突變體與疾病的相關(guān)性研究中，值得一提的是，大多數(shù)與疾病相關(guān)的突變只發(fā)生在少數(shù)的幾類GPCRs中，例如加壓素類受體、鈣敏感受體、視紫紅質(zhì)類受體、促黃體生成素受體、促甲狀腺素受體和黑皮素受體MC2和MC4，在這幾類受體上包含了大多數(shù)的疾病突變位點[4]。另外，與GPCR相互偶聯(lián)的G蛋白發(fā)生突變后，同樣會引起信號通路異常，導致疾病的產(chǎn)生，例如低甲狀旁腺激素癥和青春期早熟等遺傳性疾病都與G蛋白α亞基的突變有關(guān)，β、γ亞基暫無疾病相關(guān)性報道。

1 GPCR突變及多態(tài)性研究

1.1 GPCR突變類型

編碼GPCR與G蛋白的基因發(fā)生突變后都有可能影響蛋白質(zhì)的功能，導致功能的失活或是激活，據(jù)此，相應(yīng)的突變也分為功能失活性突變和功能激活性突變兩種類型。GPCR的失活性突變主要包括各種錯義、無義、移碼突變等，它們使得正常的受體蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變（截短），阻止了激動劑綁定后所應(yīng)發(fā)生的信號反應(yīng)；與失活性突變不同，大多數(shù)激活性突變都是錯義突變，它使得維持受體處于非活化狀態(tài)的正常約束力受到破壞，在沒有激動劑的情況下受體仍然保持著與激動劑綁定的狀態(tài)，改變平衡向著受體激活狀態(tài)發(fā)展，最終導致不依賴于激動劑的信號反應(yīng)的產(chǎn)生[4，5]。與疾病相關(guān)的突變往往發(fā)生在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的保守區(qū)域或是功能位點上，在GPCR結(jié)構(gòu)中，跨膜螺旋區(qū)控制著受體激活狀態(tài)與非激活狀態(tài)之間的平衡，是相對保守的區(qū)域，因此突變位點也以跨膜螺旋區(qū)較為常見[6-8]。

1.2 GPCR與功能性單核苷酸多態(tài)性

單核苷酸多態(tài)性是基因組中存在的一種數(shù)量非常豐富的變異形式，占人類基因組中遺傳多態(tài)性的90%以上，其中的非同義單核苷酸多態(tài)性（Non-synonymous SNPs，nsSNPs），也稱為錯義SNP，會引起氨基酸序列的改變，有些改變直接影響到了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能，從而增加了疾病的易感性[9]。這些nsSNPs往往都與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)形成中的重要殘基和功能位點緊密相關(guān)[10，11]，因此也被稱為功能性SNP，或者是有害nsSNP。據(jù)報道，每個人身上大約存在24 000～40 000個nsSNPs位點[12]，其中引起人類遺傳性疾病的突變中， 50%以上都是由nsSNPs構(gòu)成的[13]。例如，β2-AR腎上腺素基因發(fā)現(xiàn)有17個SNPs位點，其中的一些功能性SNPs分別與心臟病、心血管疾病以及哮喘的發(fā)生有關(guān)[14，15]；GPR10受體啟動子區(qū)域的多態(tài)性與肥胖和糖尿病有關(guān)[16]；GPCR40基因多態(tài)性與胰島素分泌和β細胞功能下降有關(guān)[17，18]。所以，在GPCRs的突變位點研究中，又以具有功能作用的nsSNPs備受藥物設(shè)計者的關(guān)注。這些SNPs可能是人類基因組中疾病易感基因的遺傳標記，甚至是直接影響癌癥、心臟病、糖尿病與其他常見病的易感性基因位點。

1.3 生物信息學方法預(yù)測功能性SNPs

目前，利用生物信息學方法對GPCR進行的突變分析還是以其中的功能性SNPs預(yù)測為主，由于已知的GPCRs的三維結(jié)構(gòu)特征有限，所以一些根據(jù)氨基酸變異影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)來預(yù)測nsSNP致病性的方法是不適用于GPCRs研究的，因此，各種基于序列的分類特征逐漸被應(yīng)用到GPCRs上致病性SNPs的預(yù)測。Miller等[19]指出，疾病相關(guān)的SNP與中性SNP相比，在保守性、替換類型及頻率、化學性質(zhì)變化等存在顯著差異。Balasubramanian等[6]結(jié)合氨基酸的理化性質(zhì)、進化信息和替代矩陣值3個方面的序列特征，建立logistic回歸模型對GPCR上的SNPs與疾病潛在的相關(guān)性進行分析，預(yù)測準確率為89%，最后得到了115個可能與疾病相關(guān)的SNPs位點。Xue等[20]在此基礎(chǔ)上，進一步考慮了GPCRs序列和結(jié)構(gòu)的特征，并優(yōu)化特征屬性集，確定了6個特征：保守性、BLoSUM62矩陣值、疏水性變化、突變位置、相對溶劑可及性和掩埋電荷，利用決策樹方法對功能性SNPs進行預(yù)測，準確率為91%，并總結(jié)出30條規(guī)則來區(qū)分功能性突變和非功能性突變。

現(xiàn)已報道的關(guān)于GPCRs上功能性SNPs的預(yù)測研究還很有限，而研究比較多的關(guān)于功能性與非功能性SNPs的區(qū)分方法其實也可以借鑒到GPCRs的研究上，例如張青青[21]通過隨機森林的方法結(jié)合變異位點的保守性、野生型氨基酸與突變后氨基酸理化性質(zhì)的差異、氨基酸替換頻率在致病組與中性組之間的差異、 突變位點周圍的殘基組成和突變位點之間的協(xié)同作用來預(yù)測nsSNPs的致病性。 Jiang等[22]在3個理化性質(zhì)（分子量、PI值、疏水性）的基礎(chǔ)上提取了26組特征，利用MSRV（Multiple selection rule voting）方法預(yù)測nsSNPs的有害性等。此外，也有根據(jù)不同算法開發(fā)的分析軟件用來預(yù)測SNPs與疾病的相關(guān)性，例如SIFT[23]、PolyPhen[24]、SNAP[25]、MSRV[22]、LRT[26]、PolyPhen-2[27]、MutationTaster[28]、KGGSeq[29]、SInBaD[30]、GERP[31]、 PhyloP[32]和SNPranker 2.0[33]等。這些軟件基本都具備友好的使用界面，使用者一般需要提交蛋白質(zhì)序列或是蛋白質(zhì)ID號，替換的氨基酸、替換位置、染色體或者序列比對信息等，按正確格式提交后，軟件就可自行運行然后顯示預(yù)測結(jié)果，一般都會以分值形式給出，分值范圍基本在0～1之間，分值越接近1的，表明該SNP與疾病的相關(guān)性越大，反之越小。

2 GPCR突變及多態(tài)性研究的數(shù)據(jù)庫資源

隨著GPCR研究的發(fā)展，相應(yīng)的數(shù)據(jù)資源也在不斷地補充和完善中，從最早的GPCRDB，到后來各種專業(yè)數(shù)據(jù)庫的出現(xiàn)，例如gpDB、tGRAP、GPCRNaVa等，為GPCR各個方面的研究提供了數(shù)據(jù)資源，有關(guān)GPCR突變及多態(tài)性研究的相關(guān)數(shù)據(jù)資源，如表1所示。

2.1 GPCRDB

GPCRDB（G Protein-Coupled Receptors Database）仍是目前最被廣泛使用的G蛋白偶聯(lián)受體數(shù)據(jù)庫，它包含了多個物種的GPCR序列、配體結(jié)合、結(jié)構(gòu)和突變信息，以及一些通過多序列比對或是同源建模等計算方法得到的結(jié)果。其中還整合了tinyGRAP、GPCR-OKB和GPCRNaVa中的數(shù)據(jù)資源。目前最新版本2012.03.26包括來自2 098個物種的40 185條GPCR序列信息和8 235個突變信息，另外還提供了在線分析工具MutationPredicter來預(yù)測點突變的影響效果。

2.2 tGRAP

tGRAP（G Protein-Coupled Receptors Mutant Database）早期叫tinyGRAP，是專門關(guān)于GPCR突變信息的數(shù)據(jù)庫。里面所有的數(shù)據(jù)均取自于研究文獻并進行人工注釋， 最新版本包含來自26個物種的1 940條蛋白序列的突變信息，每條序列上都含有多個突變位點，并有相關(guān)的文獻注釋。可以通過物種、突變位置或突變類型（插入、替換、刪除）等信息進行搜索，同時也可以查找一些關(guān)于試驗方面的信息（例如受體修飾位點、第二信使、G蛋白、質(zhì)粒等）和相應(yīng)的文獻報道。

2.3 GPCRNaVaDB

GPCRNaVa（Natural Variants in Human G Protein-Coupled Receptors）是關(guān)于人類GPCR自然多變體信息的數(shù)據(jù)庫，這些多變體包括罕見的突變和常見的多態(tài)性，它們對人類表型有不同的影響，從中性到與疾病相關(guān)。GPCRNaVa整合了UniProt/SwissProt、IUPHAR、GPCRDB、dbSNP、OMIM、HGMD、tGRAP等一些在線數(shù)據(jù)庫、研究文獻以及病人信息來注釋人類GPCRs上的自然多變體，每一條多變體信息包括其在DNA和蛋白質(zhì)序列上的定位，涉及到的核苷酸和相應(yīng)的氨基酸、等位基因頻率，與疾病的關(guān)聯(lián)性以及相關(guān)公共數(shù)據(jù)庫和研究文獻的鏈接。

2.4 SNPdb

單核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫（Database of Single Nuleotide Polymorphisms）收集的遺傳多態(tài)性數(shù)據(jù)包括單核苷酸多態(tài)性（SNPs）、刪除/插入多態(tài)性（DIPs）、短串聯(lián)重復序列（STRs）和后移的元素插入4種類型的數(shù)據(jù)信息。每條記錄都包括有突變點附近的DNA序列信息、檢測該突變點的試驗條件、出現(xiàn)該突變?nèi)后w的特征描述， 以及群體或個人基因分型得到的頻率信息。該數(shù)據(jù)最新版本（2012年6月）里面收錄了人類GPCR上的snp數(shù)據(jù)共5 313個，其中nsSNP有508個。

2.5 SNPdbe

SNPdbe（SNP Database of Effects）數(shù)據(jù)庫是以預(yù)測為主的關(guān)于錯義SNP（nsSNP）功能注釋的數(shù)據(jù)庫。目前， 大多數(shù)的多態(tài)性都缺少關(guān)于功能方面影響的試驗注釋。SNPdbe數(shù)據(jù)庫包含了dbSNP和

1 000個基因組當中的nsSNP信息以及Uniprot和PMD中的多變體信息，利用SNAP和SIFT算法進一步整合PMD，OMIM和UniProt數(shù)據(jù)庫中關(guān)于功能、結(jié)構(gòu)以及與疾病關(guān)聯(lián)性的信息來預(yù)測nsSNP，即單氨基酸替換（SAAS）對蛋白質(zhì)功能的影響。該數(shù)據(jù)庫包括130多萬個可引起單氨基酸替換的非同義SNP信息。研究人員可以通過組織名稱、序列以及突變ID號來進行搜索，根據(jù)預(yù)測結(jié)果來進一步設(shè)計和優(yōu)化試驗方案。

3 展望

G蛋白偶聯(lián)受體作為近幾年的“明星分子”一直是國內(nèi)外研究的熱點，利用生物信息學技術(shù)進行的相關(guān)研究主要集中在對受體的識別、分類、結(jié)構(gòu)預(yù)測、 功能域分析、配體結(jié)合、與G蛋白的特異性偶聯(lián)等方面，在GPCR的突變研究中，仍以試驗為主，通過點突變或是SNP檢測技術(shù)進行疾病相關(guān)性分析。目前，隨著各類突變信息數(shù)據(jù)庫的出現(xiàn)以及分析軟件的開發(fā)應(yīng)用，借助生物信息學手段進行GPCR上功能性SNPs的研究可以為GPCR突變與疾病易感性研究開拓新的思路，同時也可有效地提高試驗效率。另外，隨著結(jié)構(gòu)測定技術(shù)的發(fā)展，GPCR結(jié)構(gòu)信息的加入，可以更好地提高預(yù)測準確率。通過預(yù)測與試驗相結(jié)合的方法才能有效深入地了解GPCR突變的致病機理。

參考文獻：

[1] NEIDHARDT J， BARTHELMES D， FARAHMAND F， et al. Different amino acid substitutions at the same position in rhodopsin lead to distinct phenotypes[J]. Invest Ophthaimol Vis Sci， 2006， 47（4）：1630-1635.

[2] EGBUNA O I， BROWN E M. Hypercalcaemic and hypocalcaemic conditions due to calcium-sensing receptor mutations[J]. Best Pract Res Clin Rheumatol， 2008， 22（1）：129-148.

[3] LUO R， JIN Z H， DENG Y Y， et al. Disease-associated mutations prevent GPR56-collagen III interaction[J]. Plos One， 2012， 7（1）：e29818.

[4] SPIEGEL A M， WEINSTEIN L S. Inherited diseases involving G proteins and G protein-coupled receptors[J]. Annu Rev Med， 2004， 55：27-39.

[5] WAHLESTEDT C， BROOKES A J， MOTTAGUI-TABAR S. Lower rate of genomic variation identified in the trans-membrane domain of monoamine sub-class of Human G-protein coupled receptors： the Human GPCR-DB database[J]. Bmc Genomics， 2004， 5：91.

[6] BALASUBRAMANIAN S， XIA Y， FREINKMAN E， et al. Sequence variation in G-protein-coupled receptors： analysis of single nucleotide polymorphisms[J]. Nucleic Acids Res，2005，33：1710-1721.

[7] TAO Y X. Inactivating mutations of G protein-coupled receptors and diseases： structure-function insights and therapeutic implications[J]. Pharmacol Ther， 2006，111：949-973.

[8] LEE A， RANA B K， SCHIFFER H H， et al. Distribution analysis of non-synonymous polymorphisms within the G - protein-coupled receptor gene family[J]. Genomics， 2003，81：245-248.

[9] SCHAEFER C， BROMBERG Y， ACHTEN D， et al. Disease-related mutations predicted to impact protein function[J]. Bmc Genomics，2012，13（S4）：S11.

[10] GONG S， BLUNDELL T L. Structural and functional restraints on the occurrence of single amino acid variations in human proteins[J]. Plos One，2010， 5（2）：e9186.

[11] SUNYAEV S， RAMENSKY V， BORK P. Towards a structural basis of human non- synonymous single nucleotide polymorphisms[J].Trends Genet， 2000，16（5）：198-200.

[12] KRAWCZAK M， BALL E， FENTON I， et al. Human gene mutation database-a biomedical information and research resource[J]. Human Mutation， 2000，15（1）： 45-51.

[13] NG P C， HENIKOFF S. Predicting the effects of amino acid substitutions on protein function[J]. Annual Revew of Genomicxs and Human Genetics， 2006， 7：61-80.

[14] FORLEO C， RESTA N， SORRENTINO S， et al. Association of beta-adrenergic receptor polymorphisms and progression to heart failure in patients with idiopathic dilated cardiomyopathy[J]. Am J Med， 2004，117（7）：451-458.

[15] RHONDALYN C M， GLENN A H， LEWIS C B， et al. Polymorphisms of the beta adrenergic receptor predict left ventricular remodeling following acute myocardial infarction[J]. Cardiovascular Drugs and Therapy， 2011， 25（3）：251-258.

[16] 鄭 升，駱天紅，趙 萸，等.G-蛋白偶聯(lián)受體10多態(tài)性與肥胖和2型糖尿病相關(guān)性的研究[A].全國首屆代謝綜合征的基礎(chǔ)與臨床專題學術(shù)會議.全國首屆代謝綜合征的基礎(chǔ)與臨床專題學術(shù)會議論文匯編[C].北京：中華醫(yī)學會內(nèi)分泌學會，2004.

[17] OGAWA T， HIROSE H， MIYASHITA K， et al. GPR40 gene Arg211His polymorphism may contribute to the variation of insulin secretory capacity in Japanese men[J]. Metabolism， 2005，54（3）：296-299.

[18] WALKER C G， GOFF L， BLUCK L J， et al. Variation in the FFAR1 gene modifies BMI body composition and beta-cell function in overweight subjects： an exploratory analysis[J]. Plos One， 2011， 6（4）：e19146.

[19] MILLER M P， KUMAR S. Understanding human disease mutations through the use of interspecific genetic variation[J]. Hum Mol Genet， 2001，10（21）：2319-2328.

[20] XUE D， YIN J， TAN M， et al. Prediction of functional nonsynonymous single nucleotide polymorphisms in human G-protein-coupled receptors[J].J Hum Genet，2008，53（5）：379-389.

[21] 張青青.nsSNP位點表型預(yù)測的生物信息學研究[D]. 南京：東南大學，2008.

[22] JIANG R， YANG H， ZHOU L， et al. Sequence-based prioritization of nonsynonymous single nucleotide polymorphisms for the study of disease mutations[J]. American Journal of Human Genetics， 2007，81（2）：346-360.

[23] NG P C， HENIKOFF S. SIFT： Predicting amino acid changes that affect protein function[J]. Nucleic Acids Res， 2003，31（13）：3812-3814.

[24] RAMENSKY V， BORK P， SUNYAEV S. Human non-synonymous SNPs： server and survey[J]. Nucleic Acids Res， 2002， 30（17）：3894-3900.

[25] BROMBERG Y， ROST B. SNAP： predict effect of non-synonymous polymorphisms on function[J]. Nucleic Acids Research， 2007，35（11）：3823-3835.

[26] CHUN S， FAY J C. Identification of deleterious mutations within three human genomes[J]. Genome Research， 2009， 19（9）：1553-1561.

[27] ADZHUBEI I A， SCHMIDT S， PESHKIN L， et al. A method and server for predicting damaging missense mutations[J]. Nature Methods， 2010，7（4）：248-249.

[28] SCHWARZ J M， R？魻DELSPERGER C， SCHUELKE M， et al. Mutation taster evaluates disease-causing potential of sequence alterations[J]. Nature Methods， 2010， 7（8）：575-576.

[29] LI M X， GUI H S， KWAN J S H， et al. A comprehensive frame work for prioritizing variants in exome sequencing studies of Mendelian diseases[J]. Nucleic Acids Research， 2012， 40（7）：e53.

[30] KJONG-VAN L， TING C. Exploring functional variant discovery in non-coding regions with SInBaD[J]. Nucleic Acids Research， 2013， 41（1）：e7.

[31] COOPER G M， GOODE D L， NG S B， et al. Single-nucleotide evolutionary constraint scores highlight disease-causing mutations[J]. Nature Methods， 2010， 7（4）：250-251.

[32] SIEPEL A， POLLARD K， HAUSSLER D. New methods for detecting lineage-specific selection[A]. Proceedings of the 10th International Conference on Research in Computational Molecular Biology[C]. 2006， 190-205.

[33] MERELLI I， CALABRIA A， COZZI P， et al. SNPranker 2.0： a gene-centric data mining tool for diseases associated SNP prioritization in GWAS[J]. BMC Bioinformatics， 2013， 14（1）：S9.

[34] HORN F， BETTLER E， OLIVEIRA L， et al. GPCRDB： an information system for G-protein coupled receptors[J]. Nucleic Acids Res， 2003， 31（1）： 294-297.

[35] BEUKERS M W，KRISTIANSEN I，IJZERMAN A P， et al. TinyGRAP database： a bioinformatics tool to mine G protein-coupled receptor mutant data[J]. Trends Pharmacol Sci， 1999， 20（12）：475-477.

[36] KAZIUS J， WURDINGER K， ITERSON M V， et al. GPCR NaVa database： natural variants in human g protein-coupled receptors[J]. Human Mutation， 2008， 29（1）：39-44.

[37] HARMAR A J，HILLS R A，ROSSER E M， et al. IUPHAR-DB： the IUPHAR database of G protein-coupled receptors and ion channels[J].Nucleic Acids Res，2009，1（37）：680-685.

[38] SHERRY S T， WARD M H， KHOLODOV M，et al. DbSNP： the NCBI database of genetic variation[J]. Nucleic Acids Research， 2001， 29（1）：308-311.

[39] SCHAEFER C， MEIER A， ROST B， et al. SNPdbe： constructing an nsSNP functional impacts database[J]. Bioinformatics， 2012， 28（4）：601-602.

[40] LIU X， JIAN X， BOERWINKLE E. dbNSFP： a lightweight database of human nonsynonymous SNPs and their functional predictions[J]. Human Mutation， 2011， 32（8）：894-899.

[41] HAMOSH A， SCOTT A F， AMBERGER J S， et al. Online mendelian inheritance in man （OMIM）， a knowledgebase of human genes and genetic disorders[J]. Nucleic Acids Research， 2005， 33：514-517.

[42] STENSON P D， BALL E V， MORT M， et al. Human gene mutation database （HGMD）： 2003 update[J]. Human Mutation， 2003， 21（6）：577-581.

[43] FREDMAN D， SIEGFRIED M， YUAN Y P， et al. HGVbase：a human sequence variation database emphasizing data quality and a broad spectrum of data sources[J]. Nucleic Acids Research， 2002， 30（1）：387-391.

[44] CLARKE L，ZHENG-BRADLEY X，SMITH R，et al.1000 Genomes project consortium. The 1000 genomes project： data management and community access[J]. Nat Methods，2012，9（5）：459-462.