加工番茄無離層突變及離區(qū)JOINTLESS基因序列分析

謝瑩+劉陽+潘素麗+陳宏宇+趙婷婷王傲雪

摘要：以加工番茄有離層品種09872和無離層品種08003為試驗(yàn)材料，分別提取基因組DNA及有離層品種09872的花梗離區(qū)總RNA，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增并測(cè)序，得到JOINTLESS基因序列（1286bp）、jointless（j）突變序列（347bp）及JOINTLESS基因表達(dá)序列（797bp）。采用生物學(xué)軟件對(duì)序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明，加工番茄的JOINTLESS基因編碼序列與普通栽培番茄品種相比，有2個(gè)堿基發(fā)生突變；jointless（j）突變是由JOINTLESS基因第1個(gè)外顯子的部分序列連同起始密碼子上游共939bp的堿基缺失所引起；JOINTLESS基因共編碼265個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)所得的蛋白質(zhì)整體表現(xiàn)為親水性。經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育分析得出，加工番茄JOINTLESS基因序列與矮牽牛中該基因序列相似性最高，與葡萄物種的相似性最低。

關(guān)鍵詞：加工番茄；離區(qū)；JOINTLESS基因；突變；序列分析

中圖分類號(hào)：S641.203文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1002-1302（2014）11-0030-04

加工番茄是普通番茄的一個(gè)栽培種[1]。隨著番茄加工產(chǎn)業(yè)的興起和快速發(fā)展，作為專門用于加工的番茄品種，以其果皮厚、耐儲(chǔ)運(yùn)、番茄紅素含量高以及矮化自封頂、免去整枝搭架的麻煩等特點(diǎn)而越來越受到人們的重視。番茄的落花落果特性嚴(yán)重影響番茄的產(chǎn)量。研究發(fā)現(xiàn)，無離層番茄品種不僅可以改善番茄生長(zhǎng)過程中外界環(huán)境引起的落花落果情況，保證番茄產(chǎn)量；而且可以提高機(jī)械收獲和后續(xù)加工效率，同時(shí)，可以減少運(yùn)輸過程中果柄對(duì)果實(shí)造成的機(jī)械損傷，對(duì)提高果實(shí)品質(zhì)也具有一定的意義。

目前，對(duì)番茄花梗離區(qū)的研究已成為熱點(diǎn)，并取得重要突破。番茄離區(qū)發(fā)育控制基因J（JOINTLESS）是MADS-box基因家族的一員，它的突變會(huì)引起番茄果柄或花柄離區(qū)的消失。1994年Wing等報(bào)道，通過構(gòu)建遺傳和物理圖譜，以TG523作探針，用Southen雜交，將J定位在番茄細(xì)菌人工染色體TY142不足50kb的片段內(nèi)[2]，并報(bào)道首次分離了與離區(qū)發(fā)育直接相關(guān)的基因J[3]。通過重組與反義抑制試驗(yàn)，肯定J是一個(gè)新的LeMADs-box基因，轉(zhuǎn)錄物表達(dá)的時(shí)空模式顯示，J在花柄離區(qū)發(fā)育中的特異性是轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)的，轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)試驗(yàn)證實(shí)番茄果實(shí)離區(qū)正是由這個(gè)基因控制的[4]。本試驗(yàn)通過對(duì)加工番茄無離層突變的原因及加工番茄中JOINTLESS基因序列進(jìn)行分析，從分子水平闡述無離層突變發(fā)生的原因，以期為無離層加工番茄品種的選育及應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1植物材料試驗(yàn)于2012年秋季在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝站進(jìn)行，有離層加工番茄品種09872和無離層加工番茄品種08003均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)番茄課題組提供，并于日光溫室內(nèi)進(jìn)行正常栽培管理。選取番茄植株幼嫩葉片，裝入1.5mL離心管內(nèi)，投入液氮中冷凍5min，于-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2載體與菌株pMD18-T購(gòu)于寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）；大腸桿菌（Escherichiacoli）感受態(tài)DH5α購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1JOINTLESS基因片段的克隆采用CTAB法分別提取有離層品種09872（J）和無離層品種08003（j）的基因組DNA。根據(jù)NCBI基因序列AF275345，用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物F：5′-ATAGGGTAGAGAGGTTTTTTCC-3′，R：5′-CGTAGGCTAAAAGGCGTAG-3′。PCR反應(yīng)體系為buffer（Mg2+）5μL、2.5mmol/LdNTP4μL、引物R2μL、引物F2μL、模板DNA1μL、5U/μLTaq1μL、ddH2O35μL。反應(yīng)條件為：94℃5min；94℃1min，55℃30s，72℃5min，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，經(jīng)生工生物工程（上海）股份有限公司DNA快速純化/回收試劑盒回收純化目的片段，并按原體系進(jìn)行二次擴(kuò)增；將二次擴(kuò)增的產(chǎn)物與pMD18-TVector載體重組連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，并選擇陽性克隆送生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.2.2花梗部JOINTLESS基因cDNA克隆取有離層品種09872（J）植株幼嫩的花梗區(qū)，采用Trizol法（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA（Promega公司的M-MLV），根據(jù)NCBI基因序列AF275345，用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物F：5′-TCCCTCTTTCTTCAACTCTC-3′，R：5′-ATCTCATGTATTCGTCCCATAG-3′。PCR獲得JOINTLESScDNA片段，PCR反應(yīng)體系為buffer（Mg2+）5μL、2.5mmol/LdNTP4μL、引物R2μL、引物F2μL、模板DNA1μL、5U/μLTaq1μL、ddH2O35μL。反應(yīng)條件為：94℃5min；94℃1min，55℃30s，72℃5min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。cDNA片段回收擴(kuò)增，T載體連接、陽性克隆篩選并測(cè)序。

1.2.3生物信息學(xué)分析測(cè)序結(jié)果利用NCBI數(shù)據(jù)庫Blast軟件進(jìn)行比對(duì)分析，利用DNAMAN5.0軟件進(jìn)行同源性及蛋白相似性分析，采用NCBI的ProteinConservationDomain程序分析蛋白質(zhì)氨基酸結(jié)構(gòu)。采用Protscale工具對(duì)JOINTLESS編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物疏水性和親水性進(jìn)行分析，使用Sopma分析JOINTLESS編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)，利用Phyre對(duì)加工番茄JOINTLESS基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，使用DNAMAN5.0軟件對(duì)JOINTLESS基因編碼產(chǎn)物進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

2結(jié)果與分析

2.1加工番茄無離層突變分析

本試驗(yàn)采用CTAB法提取有離層品種09874與無離層品種08003的基因組DNA，用同一對(duì)引物對(duì)基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。由圖1、圖2可見，所得DNA片段長(zhǎng)度相差1000bp左右?？梢姡瑹o離層品種（j）在此段內(nèi)必有一段基因缺失，其缺失片段的長(zhǎng)度為1000bp左右。

測(cè)序獲得加工番茄有離層品種的JOINTLESS基因片段序列長(zhǎng)為1286bp，無離層品種的突變序列只有347bp，這2個(gè)序列經(jīng)Blast比對(duì)發(fā)現(xiàn)，無離層品種的JOINTLESS基因從第150位到第1089位共939bp的堿基發(fā)生缺失（圖3）。將JOINTLESS基因與其cDNA序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，JOINTLESS基因的起始密碼子位于JOINTLESS基因的第816位堿基（圖4），而這一表達(dá)起始位置恰好位于無離層品種缺失的部分。因此，加工番茄無離層品種的突變，是由JOINTLESS基因第1個(gè)外顯子的部分序列連同起始密碼子上游共939bp的堿基缺失所引起的。

2.2加工番茄JOINTLESS基因cDNA序列的生物信息學(xué)分析

2.2.1JOINTLESScDNA序列比對(duì)分析經(jīng)DNAMAN5.0軟件分析，測(cè)序得出的加工番茄JOINTLESS基因cDNA序列與GenBank提交的cDNA序列的同源性高達(dá)99.75%（圖5），蛋白序列（AF275345）相似性為97.75%。加工番茄JOINTLESS基因共編碼265個(gè)氨基酸，其cDNA序列并沒有發(fā)生插入與缺失，只是個(gè)別堿基發(fā)生突變，這些突變并沒有使其保守結(jié)構(gòu)域發(fā)生變化。

2.2.2加工番茄JOINTLESS基因編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析通過NCBI的ProteinConservationDomain程序（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）對(duì)加工番茄JOINTLESS全長(zhǎng)cDNA序列編碼的265個(gè)氨基酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明，加工番茄JOINTLESS基因編碼產(chǎn)物屬于MADS基因家族typeⅡ類型中的一員（圖6），其蛋白分子質(zhì)量為30.43ku，等電點(diǎn)為7.38794。

2.2.3JOINTLESS編碼蛋白質(zhì)的疏水性和親水性分析用Protscale工具（http：//www.expasy.ch/tools/protscale.html）對(duì)加工番茄JOINTLESS基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物疏水性和親水性進(jìn)行分析，依據(jù)氨基酸分值越低親水性越強(qiáng)、分值越高疏水性越強(qiáng)的規(guī)律，由圖7可以看出，整個(gè)蛋白質(zhì)中疏水性最大值是2.144，最小值為-3.200，在整個(gè)肽鏈中親水性氨基酸大量分布其中，整體表現(xiàn)為親水性。

2.2.4JOINTLESS編碼蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析用Sopma（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html）對(duì)JOINTLESS編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，JOINTLESS的二級(jí)結(jié)構(gòu)中53.21%為α螺旋結(jié)構(gòu)，32.83%為不規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，10.19%為β折疊結(jié)構(gòu)，3.77%為β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)（圖8）。

2.2.5JOINTLESS編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物的三級(jí)結(jié)構(gòu)分析利用Phyre的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)功能（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre/）對(duì)加工番茄JOINTLESS基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，并利用Rasmol軟件對(duì)三級(jí)結(jié)構(gòu)圖形化分析。由圖9可見，JOINTLESS的蛋白質(zhì)產(chǎn)物含有50個(gè)氫鍵，3個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)，2個(gè)β折疊結(jié)構(gòu)和8個(gè)轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。

2.3加工番茄JOINTLESS編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物的系統(tǒng)發(fā)育分析

由圖10可見，加工番茄JOINTLESS基因與矮牽牛中該基因序列相似性最高，與葡萄物種的相似性最低。

3結(jié)論與討論

對(duì)加工番茄無離層品種的jointless突變分析可知，突變是由JOINTLESS基因第1個(gè)外顯子的部分序列連同起始密碼子上游共939bp的堿基缺失所引起的，這個(gè)片段的缺失會(huì)直接導(dǎo)致其丟失啟動(dòng)子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)喪失轉(zhuǎn)錄功能從而不能形成功能蛋白。Mao等也在番茄自然突變體j中發(fā)現(xiàn)，由于啟動(dòng)子區(qū)段的一段DNA缺失引起J轉(zhuǎn)錄發(fā)生變化，導(dǎo)致翻譯的蛋白失去功能，最終使番茄的花柄離區(qū)發(fā)育受到影響，不能形成正常的離區(qū)[4]。

JOINTLESS基因?qū)儆贛ADS-box基因家族，酵母雙雜交表明，JOINTLESS蛋白可以與一系列MADS-box蛋白形成蛋白復(fù)合物[5]，這說明J作為MADS-box家族的一員，在高等

植物MADS-box基因?qū)χ参锘虻恼{(diào)控中，大多數(shù)以形成復(fù)合體來調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，篩選與J互作的蛋白，同時(shí)，JOINTLESS作為調(diào)控因子，其功能并不是單一控制離區(qū)的發(fā)育和形成。在番茄中J對(duì)于花序分生組織特異性和每個(gè)花序分生組織花原基的保守性是必需的，這一新功能的發(fā)現(xiàn)也許會(huì)為進(jìn)一步研究J甚至是整個(gè)MADS-box基因家族調(diào)控花的發(fā)育機(jī)制提供新的思路。

另外，對(duì)加工番茄有離層品種JOINTLESS基因的cDNA序列分析可知，與普通栽培品種相比，加工番茄JOINTLESS基因的保守結(jié)構(gòu)域并沒有發(fā)生變化，而且基因序列也沒有發(fā)生插入與缺失，只是2個(gè)堿基不同，這可能是同物種不同品種間特有的差異所導(dǎo)致，但也不排除在PCR擴(kuò)增時(shí)堿基發(fā)生錯(cuò)配的可能。

總之，加工番茄的JOINTLESS基因編碼序列與普通栽培番茄品種的相比，發(fā)生2個(gè)堿基的突變，而jointless（j）突變則是由JOINTLESS基因第1個(gè)外顯子的部分序列連同起始密碼子上游共939bp的堿基缺失所引起；JONINTLESS基因共編碼265個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)所得的蛋白質(zhì)整體表現(xiàn)為親水性；經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育分析得出，加工番茄JOINTLESS基因序列與矮牽牛中該基因序列相似性最高，與葡萄物種的相似性最低。

參考文獻(xiàn)：

[1]蔣先明.蔬菜栽培學(xué)各論[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1999：17-21.

[2]WingRA，ZhangHB，TanksleySD.Map-basedcloningincropplants.Tomatoasamodelsystem：Ⅰ.Geneticandphysicalmappingofjointless[J].MolGenGenet，1994，242（6）：681-688.

[3]ZhangHB，MartinGB，TanksleySD，etal.Map-basedcloningincropplants：tomatoasamodelsystemⅡ.Isolationandcharacterizationofasetofoverlappingyeastartificialchromosomesencompassingthejointlesslocus[J].MolGenGenet，1994，244（6）：613-621.

[4]MaoL，BegumD，ChuangHW，etal.JointlessisaMADS-boxgenecontrollingtomatoflowerabscissionzonedevelopment[J].Nature，2000，406（6798）：910-913.

[5]LesebergCH，EisslerCL，WangX，etal.InteractionstudyofMADS-domainproteinsintomato[J].JournalofExperimentalBotany，2008，59（8）：2253-2265.

2結(jié)果與分析

2.1加工番茄無離層突變分析

本試驗(yàn)采用CTAB法提取有離層品種09874與無離層品種08003的基因組DNA，用同一對(duì)引物對(duì)基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。由圖1、圖2可見，所得DNA片段長(zhǎng)度相差1000bp左右?？梢姡瑹o離層品種（j）在此段內(nèi)必有一段基因缺失，其缺失片段的長(zhǎng)度為1000bp左右。

測(cè)序獲得加工番茄有離層品種的JOINTLESS基因片段序列長(zhǎng)為1286bp，無離層品種的突變序列只有347bp，這2個(gè)序列經(jīng)Blast比對(duì)發(fā)現(xiàn)，無離層品種的JOINTLESS基因從第150位到第1089位共939bp的堿基發(fā)生缺失（圖3）。將JOINTLESS基因與其cDNA序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，JOINTLESS基因的起始密碼子位于JOINTLESS基因的第816位堿基（圖4），而這一表達(dá)起始位置恰好位于無離層品種缺失的部分。因此，加工番茄無離層品種的突變，是由JOINTLESS基因第1個(gè)外顯子的部分序列連同起始密碼子上游共939bp的堿基缺失所引起的。

2.2加工番茄JOINTLESS基因cDNA序列的生物信息學(xué)分析

2.2.1JOINTLESScDNA序列比對(duì)分析經(jīng)DNAMAN5.0軟件分析，測(cè)序得出的加工番茄JOINTLESS基因cDNA序列與GenBank提交的cDNA序列的同源性高達(dá)99.75%（圖5），蛋白序列（AF275345）相似性為97.75%。加工番茄JOINTLESS基因共編碼265個(gè)氨基酸，其cDNA序列并沒有發(fā)生插入與缺失，只是個(gè)別堿基發(fā)生突變，這些突變并沒有使其保守結(jié)構(gòu)域發(fā)生變化。

2.2.2加工番茄JOINTLESS基因編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析通過NCBI的ProteinConservationDomain程序（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）對(duì)加工番茄JOINTLESS全長(zhǎng)cDNA序列編碼的265個(gè)氨基酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明，加工番茄JOINTLESS基因編碼產(chǎn)物屬于MADS基因家族typeⅡ類型中的一員（圖6），其蛋白分子質(zhì)量為30.43ku，等電點(diǎn)為7.38794。

2.2.3JOINTLESS編碼蛋白質(zhì)的疏水性和親水性分析用Protscale工具（http：//www.expasy.ch/tools/protscale.html）對(duì)加工番茄JOINTLESS基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物疏水性和親水性進(jìn)行分析，依據(jù)氨基酸分值越低親水性越強(qiáng)、分值越高疏水性越強(qiáng)的規(guī)律，由圖7可以看出，整個(gè)蛋白質(zhì)中疏水性最大值是2.144，最小值為-3.200，在整個(gè)肽鏈中親水性氨基酸大量分布其中，整體表現(xiàn)為親水性。

2.2.4JOINTLESS編碼蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析用Sopma（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html）對(duì)JOINTLESS編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，JOINTLESS的二級(jí)結(jié)構(gòu)中53.21%為α螺旋結(jié)構(gòu)，32.83%為不規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，10.19%為β折疊結(jié)構(gòu)，3.77%為β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)（圖8）。

2.2.5JOINTLESS編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物的三級(jí)結(jié)構(gòu)分析利用Phyre的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)功能（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre/）對(duì)加工番茄JOINTLESS基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，并利用Rasmol軟件對(duì)三級(jí)結(jié)構(gòu)圖形化分析。由圖9可見，JOINTLESS的蛋白質(zhì)產(chǎn)物含有50個(gè)氫鍵，3個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)，2個(gè)β折疊結(jié)構(gòu)和8個(gè)轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。

2.3加工番茄JOINTLESS編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物的系統(tǒng)發(fā)育分析

由圖10可見，加工番茄JOINTLESS基因與矮牽牛中該基因序列相似性最高，與葡萄物種的相似性最低。

3結(jié)論與討論

對(duì)加工番茄無離層品種的jointless突變分析可知，突變是由JOINTLESS基因第1個(gè)外顯子的部分序列連同起始密碼子上游共939bp的堿基缺失所引起的，這個(gè)片段的缺失會(huì)直接導(dǎo)致其丟失啟動(dòng)子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)喪失轉(zhuǎn)錄功能從而不能形成功能蛋白。Mao等也在番茄自然突變體j中發(fā)現(xiàn)，由于啟動(dòng)子區(qū)段的一段DNA缺失引起J轉(zhuǎn)錄發(fā)生變化，導(dǎo)致翻譯的蛋白失去功能，最終使番茄的花柄離區(qū)發(fā)育受到影響，不能形成正常的離區(qū)[4]。

JOINTLESS基因?qū)儆贛ADS-box基因家族，酵母雙雜交表明，JOINTLESS蛋白可以與一系列MADS-box蛋白形成蛋白復(fù)合物[5]，這說明J作為MADS-box家族的一員，在高等

植物MADS-box基因?qū)χ参锘虻恼{(diào)控中，大多數(shù)以形成復(fù)合體來調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，篩選與J互作的蛋白，同時(shí)，JOINTLESS作為調(diào)控因子，其功能并不是單一控制離區(qū)的發(fā)育和形成。在番茄中J對(duì)于花序分生組織特異性和每個(gè)花序分生組織花原基的保守性是必需的，這一新功能的發(fā)現(xiàn)也許會(huì)為進(jìn)一步研究J甚至是整個(gè)MADS-box基因家族調(diào)控花的發(fā)育機(jī)制提供新的思路。

另外，對(duì)加工番茄有離層品種JOINTLESS基因的cDNA序列分析可知，與普通栽培品種相比，加工番茄JOINTLESS基因的保守結(jié)構(gòu)域并沒有發(fā)生變化，而且基因序列也沒有發(fā)生插入與缺失，只是2個(gè)堿基不同，這可能是同物種不同品種間特有的差異所導(dǎo)致，但也不排除在PCR擴(kuò)增時(shí)堿基發(fā)生錯(cuò)配的可能。

總之，加工番茄的JOINTLESS基因編碼序列與普通栽培番茄品種的相比，發(fā)生2個(gè)堿基的突變，而jointless（j）突變則是由JOINTLESS基因第1個(gè)外顯子的部分序列連同起始密碼子上游共939bp的堿基缺失所引起；JONINTLESS基因共編碼265個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)所得的蛋白質(zhì)整體表現(xiàn)為親水性；經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育分析得出，加工番茄JOINTLESS基因序列與矮牽牛中該基因序列相似性最高，與葡萄物種的相似性最低。

參考文獻(xiàn)：

[1]蔣先明.蔬菜栽培學(xué)各論[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1999：17-21.

[2]WingRA，ZhangHB，TanksleySD.Map-basedcloningincropplants.Tomatoasamodelsystem：Ⅰ.Geneticandphysicalmappingofjointless[J].MolGenGenet，1994，242（6）：681-688.

[3]ZhangHB，MartinGB，TanksleySD，etal.Map-basedcloningincropplants：tomatoasamodelsystemⅡ.Isolationandcharacterizationofasetofoverlappingyeastartificialchromosomesencompassingthejointlesslocus[J].MolGenGenet，1994，244（6）：613-621.

[4]MaoL，BegumD，ChuangHW，etal.JointlessisaMADS-boxgenecontrollingtomatoflowerabscissionzonedevelopment[J].Nature，2000，406（6798）：910-913.

[5]LesebergCH，EisslerCL，WangX，etal.InteractionstudyofMADS-domainproteinsintomato[J].JournalofExperimentalBotany，2008，59（8）：2253-2265.

2結(jié)果與分析

2.1加工番茄無離層突變分析

本試驗(yàn)采用CTAB法提取有離層品種09874與無離層品種08003的基因組DNA，用同一對(duì)引物對(duì)基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。由圖1、圖2可見，所得DNA片段長(zhǎng)度相差1000bp左右。可見，無離層品種（j）在此段內(nèi)必有一段基因缺失，其缺失片段的長(zhǎng)度為1000bp左右。

測(cè)序獲得加工番茄有離層品種的JOINTLESS基因片段序列長(zhǎng)為1286bp，無離層品種的突變序列只有347bp，這2個(gè)序列經(jīng)Blast比對(duì)發(fā)現(xiàn)，無離層品種的JOINTLESS基因從第150位到第1089位共939bp的堿基發(fā)生缺失（圖3）。將JOINTLESS基因與其cDNA序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，JOINTLESS基因的起始密碼子位于JOINTLESS基因的第816位堿基（圖4），而這一表達(dá)起始位置恰好位于無離層品種缺失的部分。因此，加工番茄無離層品種的突變，是由JOINTLESS基因第1個(gè)外顯子的部分序列連同起始密碼子上游共939bp的堿基缺失所引起的。

2.2加工番茄JOINTLESS基因cDNA序列的生物信息學(xué)分析

2.2.1JOINTLESScDNA序列比對(duì)分析經(jīng)DNAMAN5.0軟件分析，測(cè)序得出的加工番茄JOINTLESS基因cDNA序列與GenBank提交的cDNA序列的同源性高達(dá)99.75%（圖5），蛋白序列（AF275345）相似性為97.75%。加工番茄JOINTLESS基因共編碼265個(gè)氨基酸，其cDNA序列并沒有發(fā)生插入與缺失，只是個(gè)別堿基發(fā)生突變，這些突變并沒有使其保守結(jié)構(gòu)域發(fā)生變化。

2.2.2加工番茄JOINTLESS基因編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析通過NCBI的ProteinConservationDomain程序（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）對(duì)加工番茄JOINTLESS全長(zhǎng)cDNA序列編碼的265個(gè)氨基酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明，加工番茄JOINTLESS基因編碼產(chǎn)物屬于MADS基因家族typeⅡ類型中的一員（圖6），其蛋白分子質(zhì)量為30.43ku，等電點(diǎn)為7.38794。

2.2.3JOINTLESS編碼蛋白質(zhì)的疏水性和親水性分析用Protscale工具（http：//www.expasy.ch/tools/protscale.html）對(duì)加工番茄JOINTLESS基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物疏水性和親水性進(jìn)行分析，依據(jù)氨基酸分值越低親水性越強(qiáng)、分值越高疏水性越強(qiáng)的規(guī)律，由圖7可以看出，整個(gè)蛋白質(zhì)中疏水性最大值是2.144，最小值為-3.200，在整個(gè)肽鏈中親水性氨基酸大量分布其中，整體表現(xiàn)為親水性。

2.2.4JOINTLESS編碼蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析用Sopma（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html）對(duì)JOINTLESS編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，JOINTLESS的二級(jí)結(jié)構(gòu)中53.21%為α螺旋結(jié)構(gòu)，32.83%為不規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，10.19%為β折疊結(jié)構(gòu)，3.77%為β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)（圖8）。

2.2.5JOINTLESS編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物的三級(jí)結(jié)構(gòu)分析利用Phyre的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)功能（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre/）對(duì)加工番茄JOINTLESS基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，并利用Rasmol軟件對(duì)三級(jí)結(jié)構(gòu)圖形化分析。由圖9可見，JOINTLESS的蛋白質(zhì)產(chǎn)物含有50個(gè)氫鍵，3個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)，2個(gè)β折疊結(jié)構(gòu)和8個(gè)轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。

2.3加工番茄JOINTLESS編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物的系統(tǒng)發(fā)育分析

由圖10可見，加工番茄JOINTLESS基因與矮牽牛中該基因序列相似性最高，與葡萄物種的相似性最低。

3結(jié)論與討論

對(duì)加工番茄無離層品種的jointless突變分析可知，突變是由JOINTLESS基因第1個(gè)外顯子的部分序列連同起始密碼子上游共939bp的堿基缺失所引起的，這個(gè)片段的缺失會(huì)直接導(dǎo)致其丟失啟動(dòng)子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)喪失轉(zhuǎn)錄功能從而不能形成功能蛋白。Mao等也在番茄自然突變體j中發(fā)現(xiàn)，由于啟動(dòng)子區(qū)段的一段DNA缺失引起J轉(zhuǎn)錄發(fā)生變化，導(dǎo)致翻譯的蛋白失去功能，最終使番茄的花柄離區(qū)發(fā)育受到影響，不能形成正常的離區(qū)[4]。

JOINTLESS基因?qū)儆贛ADS-box基因家族，酵母雙雜交表明，JOINTLESS蛋白可以與一系列MADS-box蛋白形成蛋白復(fù)合物[5]，這說明J作為MADS-box家族的一員，在高等

植物MADS-box基因?qū)χ参锘虻恼{(diào)控中，大多數(shù)以形成復(fù)合體來調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，篩選與J互作的蛋白，同時(shí)，JOINTLESS作為調(diào)控因子，其功能并不是單一控制離區(qū)的發(fā)育和形成。在番茄中J對(duì)于花序分生組織特異性和每個(gè)花序分生組織花原基的保守性是必需的，這一新功能的發(fā)現(xiàn)也許會(huì)為進(jìn)一步研究J甚至是整個(gè)MADS-box基因家族調(diào)控花的發(fā)育機(jī)制提供新的思路。

另外，對(duì)加工番茄有離層品種JOINTLESS基因的cDNA序列分析可知，與普通栽培品種相比，加工番茄JOINTLESS基因的保守結(jié)構(gòu)域并沒有發(fā)生變化，而且基因序列也沒有發(fā)生插入與缺失，只是2個(gè)堿基不同，這可能是同物種不同品種間特有的差異所導(dǎo)致，但也不排除在PCR擴(kuò)增時(shí)堿基發(fā)生錯(cuò)配的可能。

總之，加工番茄的JOINTLESS基因編碼序列與普通栽培番茄品種的相比，發(fā)生2個(gè)堿基的突變，而jointless（j）突變則是由JOINTLESS基因第1個(gè)外顯子的部分序列連同起始密碼子上游共939bp的堿基缺失所引起；JONINTLESS基因共編碼265個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)所得的蛋白質(zhì)整體表現(xiàn)為親水性；經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育分析得出，加工番茄JOINTLESS基因序列與矮牽牛中該基因序列相似性最高，與葡萄物種的相似性最低。

參考文獻(xiàn)：

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[3]ZhangHB，MartinGB，TanksleySD，etal.Map-basedcloningincropplants：tomatoasamodelsystemⅡ.Isolationandcharacterizationofasetofoverlappingyeastartificialchromosomesencompassingthejointlesslocus[J].MolGenGenet，1994，244（6）：613-621.

[4]MaoL，BegumD，ChuangHW，etal.JointlessisaMADS-boxgenecontrollingtomatoflowerabscissionzonedevelopment[J].Nature，2000，406（6798）：910-913.

[5]LesebergCH，EisslerCL，WangX，etal.InteractionstudyofMADS-domainproteinsintomato[J].JournalofExperimentalBotany，2008，59（8）：2253-2265.