山藥多糖和大豆多肽對(duì)復(fù)合益生菌發(fā)酵特性的影響

陳則華，李文治，賴玉健，黃劍釗，黎攀，杜冰*

1. 無限極（中國）有限公司（廣州 510663）；2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院（廣州 510642）

益生元又稱雙歧因子，能夠促進(jìn)其體內(nèi)有益菌的代謝和增殖，改善宿主健康[1]。目前已經(jīng)開發(fā)的益生元種類有低聚糖[2]、多糖[3]、植物中草藥提取物[4]、蛋白質(zhì)水解物[5]和多元醇等，種類有限，開發(fā)更多類型的新型益生元?jiǎng)菰诒匦?。山藥多糖是從山藥里提取出來的一種多糖，由單糖基通過糖苷鍵連接而成的高分子聚糖。山藥多糖具有一定的生物活性，如具有抗氧化、維持腸道穩(wěn)態(tài)、免疫調(diào)節(jié)[6]、降血糖、保護(hù)肝臟等生理功能，易被機(jī)體消化、代謝，無毒副作用。有研究顯示，長(zhǎng)期灌胃山藥多糖可以促進(jìn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生長(zhǎng)性能和影響腸道菌群[7]，山藥低聚糖對(duì)青春雙歧桿菌和動(dòng)物雙歧桿菌的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用[8]。大豆多肽是大豆蛋白經(jīng)蛋白酶水解以后產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物，具有高營(yíng)養(yǎng)、易吸收、低抗原、不會(huì)引起過敏反應(yīng)等功能特性，還具有一定的抗氧化和調(diào)節(jié)免疫力等生理功能[9]。有研究表明，大豆蛋白中的水解產(chǎn)物[10]能夠促進(jìn)雙歧桿菌增殖，潘芬等[5]研究發(fā)現(xiàn)添加4 mg/mL的豌豆蛋白酶解產(chǎn)物能夠顯著促進(jìn)干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌等益生菌的生長(zhǎng)?？梢?，山藥多糖和大豆多肽均具有較好的生理功能，容易被機(jī)體吸收，都有抗氧化和提高免疫力等功能，具備成為潛在益生元的天然條件。

試驗(yàn)以山藥多糖、大豆多肽為研究對(duì)象，通過觀察復(fù)合益生菌生長(zhǎng)過程中活菌數(shù)、pH、總酸和短鏈脂肪酸4個(gè)指標(biāo)，并與傳統(tǒng)益生元菊粉作對(duì)比，來探討山藥多糖和大豆多肽作為新型益生元的可能性。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

山藥多糖（由廣州南北行中藥飲片有限公司山藥片提?。?；大豆多肽（由本實(shí)驗(yàn)室對(duì)市售大豆提?。?；菊粉（純度＞90%）：重慶驕王天然產(chǎn)物股份有限公司；鼠李糖乳桿菌R11（1 500億 CFU/g）、嗜酸乳桿菌R418（1 500億 CFU/g）和動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種B94（1 000億 CFU/g），拉曼公司，復(fù)配比例為1︰1︰1.5；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-25型pH計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；FA1104N電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；YXQ-LS-5OS型立式蒸汽滅菌器（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；SW-CJ-1D型單人凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；GHX-9270B-2隔熱式恒溫培養(yǎng)箱（上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；101-2S4電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱（上海迅能電熱設(shè)備有限公司）；Agilent 6890N高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）。

1.3 發(fā)酵培養(yǎng)基

腸道菌群發(fā)酵培養(yǎng)基（General Anaerobic Medium，GAM）配方：蛋白胨10 g，大豆胨3 g，消化血清粉13.5 g，酵母浸膏5 g，牛肉膏2.2 g，牛肝膏1.2 g，葡萄糖3 g，KH2PO42.5 g，NaCl 3 g，可溶性淀粉5 g，L-半胱胺酸鹽0.3 g，硫乙醇酸鈉0.3 g，瓊脂1.5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4，于110 ℃滅菌25 min。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 益生菌復(fù)合發(fā)酵

以菊粉為對(duì)照，在葡萄糖的腸道菌群發(fā)酵培養(yǎng)液（GAM）中，分別加入0.5%，1%，1.5%，2%濃度的山藥多糖和大豆多肽；并按照106CFU/mL接種量，接入含有鼠李糖乳桿菌R11、嗜酸乳桿菌R418和動(dòng)物乳雙歧桿菌B94三種復(fù)合益生菌，于37 ℃厭氧發(fā)酵24 h。

1.4.2 復(fù)合益生菌活菌數(shù)的測(cè)定

采用平板計(jì)數(shù)法[11]測(cè)定發(fā)酵液菌落數(shù)。

1.4.3 復(fù)合益生菌發(fā)酵液pH的測(cè)定

采用pH計(jì)測(cè)定發(fā)酵液的pH。

1.4.4 復(fù)合益生菌產(chǎn)生總酸和短鏈脂肪酸含量測(cè)定

采用電位滴定法[12]測(cè)定發(fā)酵液中的總酸含量；同時(shí)，選取1%添加濃度的發(fā)酵液用0.22 μm濾膜過濾，采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定發(fā)酵液中乳酸、乙酸的含量。HPLC測(cè)定短鏈脂肪酸含量的方法：色譜柱，HP-INNOWAX（19091N-133）；毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 mm）；檢測(cè)器，離子化火焰檢測(cè)器；載氣N2，流速20 mL/min；檢測(cè)器溫度270℃；氣化室溫度250 ℃。升溫程序：120 ℃→10 ℃/min→220 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 益生元對(duì)復(fù)合益生菌增殖能力的影響

由圖1可知，在培養(yǎng)24 h后，相對(duì)于空白對(duì)照（即益生元添加濃度為0），3種不同的益生元均可以提高益生菌的活菌數(shù)，其中添加了菊粉對(duì)益生菌的增殖作用最優(yōu)，山藥多糖次之，大豆多肽較弱，而且每種益生元對(duì)于提高益生菌活菌數(shù)所需要的添加濃度和規(guī)律性不盡相同。對(duì)于山藥多糖，隨著添加濃度的增加，促進(jìn)復(fù)合益生菌增殖的能力呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，當(dāng)添加濃度為2.0%時(shí)，促進(jìn)益生菌增殖效果最優(yōu)。有研究[7]報(bào)導(dǎo)，高劑量組的山藥多糖喂養(yǎng)小鼠促進(jìn)腸道內(nèi)乳酸桿菌、雙歧桿菌增殖的效果比中劑量組和低劑量組的好，與此次試驗(yàn)結(jié)果相似。對(duì)于大豆多肽，則呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)添加濃度為0.5%時(shí)，促進(jìn)復(fù)合益生菌增殖效果最優(yōu)。而傳統(tǒng)益生元菊粉，已有大量報(bào)導(dǎo)其具有促進(jìn)益生菌增殖的功效，此次試驗(yàn)中除了最低濃度的添加量外，其余組均能促進(jìn)益生菌增殖。

圖1 不同濃度益生元對(duì)復(fù)合益生菌活菌數(shù)的影響

2.2 益生元對(duì)復(fù)合益生菌pH的影響

由圖2可知，當(dāng)發(fā)酵24 h后，添加3種不同的益生元均能降低發(fā)酵液的pH，其中菊粉對(duì)pH的降低效果最佳，山藥多糖次之，大豆多肽較弱，而且隨著益生元濃度的增加，3種發(fā)酵液的pH均呈現(xiàn)先下降再上升的趨勢(shì)，當(dāng)添加濃度為1.0%時(shí)降低的效果最優(yōu)。

圖2 不同濃度益生元對(duì)復(fù)合益生菌pH的影響

2.3 益生元對(duì)復(fù)合益生菌產(chǎn)酸能力的影響

由圖3可知，發(fā)酵液培養(yǎng)24 h后，3種益生元均能提高復(fù)合益生菌的總酸含量，其中菊粉提高的效果最佳，大豆多肽次之，山藥多糖較弱。當(dāng)添加濃度為1.0%時(shí)，對(duì)復(fù)合益生菌產(chǎn)酸的效果最好。

2.4 不同益生元對(duì)復(fù)合益生菌短鏈脂肪酸產(chǎn)生量的影響

試驗(yàn)還分析了總酸中短鏈脂肪酸的產(chǎn)生量，高效液相色譜（HPLC）檢出圖譜如圖4所示。

選取添加量為1.0%的益生元的發(fā)酵液檢測(cè)，測(cè)定乳酸和丁酸的含量。由圖5可知，添加山藥多糖、大豆多肽和菊粉均能使復(fù)合益生菌產(chǎn)生較多的乳酸和乙酸，其中添加山藥多糖、大豆多肽益生元的發(fā)酵液產(chǎn)乳酸量比菊粉的高，分別高1.71和1.83倍，但略比空白對(duì)照低；添加山藥多糖和大豆多肽的發(fā)酵液產(chǎn)乙酸量比添加相同量菊粉和空白組的都高，分別達(dá)0.049和0.083 g/100 g。

圖3 不同濃度益生元對(duì)復(fù)合益生菌產(chǎn)生總酸能力的影響

圖4 乳酸（A）和乙酸（B）的HPLC檢出圖

圖5 不同益生元對(duì)復(fù)合益生菌產(chǎn)短鏈脂肪酸含量的影響

3 討論

短鏈脂肪酸是腸道微生物發(fā)酵未消化的碳水化合物如纖維多糖和寡聚糖等益生元而產(chǎn)生的主要代謝產(chǎn)物，包括乳酸、乙酸、丙酸、丁酸等有機(jī)脂肪酸[13]，對(duì)宿主腸屏障功能的維護(hù)有重要作用。短鏈脂肪酸在體內(nèi)參與眾多不同器官的代謝，每種脂肪酸都有特定的功效。乳酸可降低腸道內(nèi)環(huán)境的pH，對(duì)腸道致病菌如沙門氏菌（Salmonella）、大腸埃希氏菌（Escherichia coli）等有抑制作用，還能促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，調(diào)節(jié)腸道菌群的平衡[14]。乙酸是發(fā)酵膳食纖維的主要代謝產(chǎn)物[15]，可以通過血液作用于全身多個(gè)器官和組織，經(jīng)過肝臟代謝吸收利用，為底物氧化、脂質(zhì)合成和肝細(xì)胞代謝提供充足的能量[16]。然而，不同種類的益生元促進(jìn)益生菌產(chǎn)生的短鏈脂肪酸的種類和含量存在顯著差別。Satoh等[17]指出，不同的益生元促進(jìn)益生菌產(chǎn)生乳酸含量不一樣，低聚半乳糖、大豆低聚糖等促進(jìn)雙歧桿菌產(chǎn)生乳酸的量比低聚木糖、低聚乳果糖等益生元的高。

有研究報(bào)道：菊粉是目前研究最深、應(yīng)用最廣的益生元，它可以促進(jìn)短鏈脂肪酸丁酸的產(chǎn)生[18]，丁酸鹽可以選擇性誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞的死亡[19]，從而具備維護(hù)腸道健康、改善腸道微生態(tài)的功效。此次試驗(yàn)中，在添加了山藥多糖和大豆多肽后，都能促進(jìn)復(fù)合益生菌產(chǎn)酸量，雖然總酸的產(chǎn)生量沒有傳統(tǒng)益生元菊粉高，但是產(chǎn)生的乳酸和乙酸含量都比菊粉高，說明山藥多糖和大豆多肽在促進(jìn)短鏈脂肪酸的產(chǎn)生中具有較大的優(yōu)勢(shì)。短鏈脂肪酸在機(jī)體內(nèi)的代謝吸收作用對(duì)人體產(chǎn)生重大的作用，目前已有大量的研究[20]報(bào)導(dǎo)了短鏈脂肪酸的代謝通路和功效。

4 結(jié)論

山藥多糖和大豆多肽均能促進(jìn)復(fù)合益生菌的生長(zhǎng)并提高其短鏈脂肪酸的產(chǎn)生，說明其具備進(jìn)一步為開發(fā)新型益生元的潛在優(yōu)勢(shì)。