胃癌組織中miR-133a-3p、miR-4317的表達(dá)及臨床意義

楊建華，牛廣旭，郭曉娟，王 靜

(河北省邯鄲市中心醫(yī)院病理科，河北邯鄲 056001)

胃癌是人類最常見的癌癥類型之一，是僅次于肺癌的第二大腫瘤死亡原因，每年新增胃癌患者達(dá)93.4萬例[1]，我國(guó)胃癌致死病例占全世界胃癌致死總數(shù)的40%左右[2]。不同胃癌患者的早期癥狀各不相同[3]，胃癌常在晚期診斷，伴有惡性增生和轉(zhuǎn)移[4]。盡管目前胃癌的化療和分子靶向治療取得了進(jìn)展，但對(duì)晚期胃癌患者的預(yù)后仍然不利，胃癌的5年生存率低于25%[5-6]。因此，尋找一種能夠在早期預(yù)測(cè)和術(shù)后預(yù)警胃癌患者生存的檢測(cè)指標(biāo)具有重要的臨床意義。微小RNA(miR)是一種長(zhǎng)度為19～24個(gè)核苷酸的單鏈非編碼RNA，它參與人類近1/3基因的表達(dá)調(diào)控，在發(fā)育時(shí)序的控制、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮著重要的作用[7]。miR-133a在食管癌[8]、膀胱癌[9]、結(jié)直腸癌[10]等多種腫瘤中存在異常表達(dá)，并在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、增殖、凋亡及藥物耐藥方面發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-133a在胃癌中表達(dá)也存在顯著異常，并抑制胃癌的發(fā)生、發(fā)展[11]；miR-133a-3p在胃癌的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，有研究報(bào)道m(xù)iR-133a-3p能夠抑制胃癌細(xì)胞SGC7901的增殖和遷移[12]。miR-4317位于18p 11.31，是一種新發(fā)現(xiàn)的miR，在黑色素瘤[13]和非小細(xì)胞肺癌[14]等多種腫瘤中均有異常表達(dá)。miR-133a-3p和miR-4317在胃癌患者中均表現(xiàn)為異常表達(dá)，并且二者與胃癌的發(fā)生和發(fā)展有著密切的關(guān)系，然而目前臨床上關(guān)于胃癌中miR-133a-3p和miR-4317的研究以及二者與胃癌患者的臨床特征間的關(guān)系研究較少。因此本研究主要通過分析miR-133a-3p和miR-4317在胃癌組織表達(dá)水平，探討二者與胃癌患者的預(yù)后、臨床特征的關(guān)系，為胃癌的預(yù)測(cè)和預(yù)后判定提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2010年4月到2012年3月入住本院的60例胃癌患者的胃癌組織標(biāo)本(非壞死部分)及其相應(yīng)的癌旁正常組織標(biāo)本(距離≥5 cm癌旁正常組織)。納入標(biāo)準(zhǔn)：病理學(xué)診斷為胃癌，采用手術(shù)切除(根治術(shù)或姑息性手術(shù))，患者術(shù)前未進(jìn)行任何放療和輔助治療，臨床資料及隨訪資料完整，簽署知情同意書；排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤，術(shù)前已接受抗腫瘤治療者，患全身感染性疾病、肝腎疾病者。本研究60例胃癌患者年齡21～75歲，<60歲患者33例，≥60歲患者27例；男性患者45例，女性患者15例；低分化患者28例，中高分化患者32例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者35例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者25例；浸潤(rùn)深度：黏膜下各層23例，漿膜層37例；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移44例，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移16例；TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期26例，Ⅲ+Ⅳ期34例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核同意。

1.2方法

1.2.1組織RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-qPCR)試驗(yàn) Trizol試劑(Takara公司)提取來自組織中的總RNA。反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司)對(duì)mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。RT-qPCR使用試劑盒SYBR Green PCR Kit(Takara公司)。反應(yīng)條件如下：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min，共45個(gè)循環(huán)。U6引物為miR-4317和miR-133a-3p內(nèi)源性對(duì)照。所用特異性引物序列如下：miR-133a-3p正向引物為5′-CGA GCC TTT GGT CCC CTT CAA C-3′，miR-133a-3p反向引物為5′-TCA ACT GCT GGT GTC GTG GAG TCG GC-3′；miR-4317正向引物為5′-ATC CAG TGC GTG TCG TG-3′，miR-4317反向引物為5′-TGC GT C ACA TTG CCA GG-3′；U6正向引物為5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′，U6反向引物為5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′；2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.2.2隨訪 采用電話或者門診復(fù)查的方式對(duì)患者進(jìn)行隨訪，每3個(gè)月隨訪1次，隨訪時(shí)間為確診后1～60個(gè)月，直至患者死亡或者截止隨訪時(shí)間。

2 結(jié) 果

2.1不同胃組織中miR-133a-3p與miR-4317的表達(dá) RT-qPCR試驗(yàn)結(jié)果顯示，胃癌組織中miR-133a-3p、miR-4317相對(duì)表達(dá)量均低于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 miR-133a-3p、miR-4317在不同胃組織中相對(duì)表達(dá)量比較

2.2胃癌組織中miR-133a-3p與miR-4317表達(dá)與患者臨床特征的關(guān)系 胃癌組織中miR-133a-3p表達(dá)水平與腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，而與患者年齡、性別、分化程度、浸潤(rùn)深度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無關(guān)(P>0.05)；miR-4317表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及腫瘤TNM分期有關(guān)(P<0.05)，而與患者年齡、性別、浸潤(rùn)深度、分化程度無關(guān)(P>0.05)。見表2。

表2 胃癌組織中miR-133a-3p和miR-4317表達(dá)與患者臨床特征的關(guān)系

圖1 miR-133a-3p與患者預(yù)后的Kaplan-Meier生存曲線

2.3miR-133a-3p和miR-4317表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 (1)miR-133a-3p表達(dá)對(duì)預(yù)后的影響：以miR-133a-3p中位數(shù)(0.34)為界，將胃癌患者分為miR-133a-3p高表達(dá)組(n=30)和miR-133a-3p低表達(dá)組(n=30)。Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果顯示，miR-133a-3p高表達(dá)組與低表達(dá)組術(shù)后5年生存率為26.67%(8/30)和20.00%(6/30)，術(shù)后生存時(shí)間為(27.57±2.55)個(gè)月和(20.80±2.30)個(gè)月，兩組之間生存率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log Rankχ2=17.920，P=0.001)，見圖1。(2)miR-4317表達(dá)對(duì)預(yù)后的影響：以miR-4317表達(dá)量中位數(shù)(0.49)為界，將胃癌患者分為miR-4317低表達(dá)組(n=30)和miR-4317高表達(dá)組(n=30)。Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果顯示，miR-4317高表達(dá)組與低表達(dá)組術(shù)后5年生存率為30.00%(9/30)和16.67%(5/30)，術(shù)后生存時(shí)間為(32.97±2.56)個(gè)月和(24.51±2.55)個(gè)月，兩組生存率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log Rankχ2=21.130，P=0.001)，見圖2。

圖2 miR-4317與患者預(yù)后的Kaplan-Meier生存曲線

3 討 論

胃癌是目前我國(guó)最為常見的惡性腫瘤之一，主要來自胃黏膜上皮的惡性腫瘤，手術(shù)切除是目前胃癌治療的主要手段，但是，由于胃癌在早期階段無明顯的臨床癥狀，因此，大多數(shù)患者確診時(shí)已經(jīng)處于癌癥晚期，所以預(yù)后較差[15]。在中國(guó)，胃癌仍然是一個(gè)沉重的負(fù)擔(dān)，對(duì)這種疾病沒有有效的治療方法，準(zhǔn)確預(yù)測(cè)胃癌患者的預(yù)后對(duì)于胃癌患者的治療是非常重要的。到目前為止，TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期等特征在臨床應(yīng)用中，對(duì)預(yù)測(cè)胃癌患者的預(yù)后，指導(dǎo)個(gè)體治療有重要意義[16]。然而，這些特征的應(yīng)用還不能夠滿足臨床需求。目前人們對(duì)miR的研究越來越多，研究認(rèn)為，一些miR具有預(yù)測(cè)胃癌和預(yù)后生物標(biāo)志物的潛力，例如miR-335-5p，miR-558和miR-145-5p[17-19]。因此尋找特異性的早期預(yù)測(cè)標(biāo)志物，能夠早期預(yù)測(cè)和術(shù)后預(yù)警胃癌患者生存的檢測(cè)指標(biāo)具有重要的臨床意義。

miR是一類高度保守的非編碼RNA分子，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用，可以作為腫瘤分子的標(biāo)志物，在腫瘤的早期預(yù)測(cè)和治療過程以及患者的預(yù)后判斷中發(fā)揮重要的作用[7]。很多癌癥如肺癌、乳腺癌、前列腺癌等，腫瘤組織和正常組織對(duì)比，miR存在差異性表達(dá)[20-22]。miR-133序列首次在小鼠上被發(fā)現(xiàn)，人類基因組中有3個(gè)已知的miR-133：miR-133a-1、miR-133a-2和miR-133b[23]。有研究通過對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行miR-Nomes分析發(fā)現(xiàn)miR-133a家族在胃癌中表達(dá)均為下調(diào)趨勢(shì)，并且通過SGC-7901、MNK-45胃癌細(xì)胞系和原發(fā)胃癌組織進(jìn)行驗(yàn)證，證實(shí)了該結(jié)果，表明miR-133a在胃癌的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[24]；miR-133a-3p在胃癌中表現(xiàn)為異常表達(dá)，有研究證明miR-133a-3p能夠通過靶向調(diào)控Mcl-1和Bcl-xL促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡[25]。miR-4317位于18p11.31，是一種新發(fā)現(xiàn)的miR，目前，已有一些研究報(bào)道了miR-4317在幾種腫瘤中的表達(dá)模式和生物學(xué)功能[12-13]。在非小細(xì)胞肺癌中，miR-4317表現(xiàn)為低表達(dá)，同時(shí)miR-4317高表達(dá)與肺癌晚期臨床分期有關(guān)，具有較好的總體生存率，miR-4317表達(dá)可以通過靶向成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子9來抑制細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[13]。另一方面，在胃癌中，miR-4317表達(dá)也表現(xiàn)為下調(diào)，其高表達(dá)可以通過靶向ZNF 322來抑制人胃癌細(xì)胞的增殖[14]。

本文通過RT-qPCR驗(yàn)證miR-133a-3p和miR-4317在60例胃癌組織和對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織中表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于癌旁正常組織，miR-133a-3p和miR-4317在胃癌組織中表達(dá)均顯著下調(diào)。同時(shí)通過對(duì)胃癌患者的臨床特征進(jìn)行分析，結(jié)果顯示miR-133a-3p表達(dá)水平和TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，而與患者的年齡、性別以及分化程度、浸潤(rùn)深度和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無關(guān)。在胃癌組織中，當(dāng)miR-133a-3p表現(xiàn)低表達(dá)時(shí)，患者發(fā)生明顯淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，并且具有較晚的分期；以上結(jié)果表明miR-133a-3p在胃癌的發(fā)生和發(fā)展中主要發(fā)揮抑癌的作用，它的高表達(dá)與腫瘤的惡性程度有關(guān)。同時(shí)預(yù)后顯示，miR-133a-3p高表達(dá)的患者具有較好的預(yù)后和較高的術(shù)后生存率，可以作為判斷患者預(yù)后情況的一項(xiàng)指標(biāo)。miR-4317表達(dá)水平和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在有關(guān)，而與患者年齡、性別和浸潤(rùn)深度以及分化程度無關(guān)。miR-4317表達(dá)下調(diào)時(shí)，胃癌患者容易發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，并且發(fā)生明顯的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，腫瘤具有較晚的分期；表明miR-4317在胃癌的發(fā)生和發(fā)展中主要發(fā)揮抑癌功能，同樣它的高表達(dá)與腫瘤的惡性程度有關(guān)。同時(shí)預(yù)后顯示，miR-4317高表達(dá)的患者具有較好的預(yù)后和較高的術(shù)后生存率，可以作為判斷患者預(yù)后情況的一項(xiàng)指標(biāo)。

在胃癌的發(fā)生和發(fā)展過程中，miR-133a-3p和miR-4317可能發(fā)揮著癌基因的功能，miR-133a-3p和miR-4317的高表達(dá)能夠抑制胃癌的腫瘤形成和惡性進(jìn)展過程，且均與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。因此miR-133a-3p和miR-4317很可能作為胃癌預(yù)測(cè)和預(yù)后判斷的潛在靶點(diǎn)。

4 結(jié) 論

本研究表明，miR-133a-3p和miR-4317在胃癌中的表達(dá)均明顯下調(diào)，并與胃癌的進(jìn)展和預(yù)后不良有關(guān)，提示其可能作為胃癌預(yù)測(cè)的潛在生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。