適配子快速檢測炎性指標(biāo)C反應(yīng)蛋白的免疫傳感器*

孟凡達，呂衍民，孫雪梅，孫曉艷

(山東第一醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，山東濟南 250062)

適配子又稱適體、適配體[1-5]，指的是通過體外篩選技術(shù)——指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術(shù)(SELEX)，從含有大量序列的隨機DNA或者RNA文庫中篩選出的能與蛋白質(zhì)或其他小分子物質(zhì)等靶標(biāo)特異結(jié)合的短鏈分子。適配子與靶分子的結(jié)合方式與抗原-抗體的結(jié)合相似，但是適配子相對于抗原-抗體的結(jié)合又具有親和力強、特異性高、靶分子廣、容易修飾、合成廉價、穩(wěn)定性好的優(yōu)點。適配子空間構(gòu)象的形成是有效識別靶分子的關(guān)鍵，適配子構(gòu)象的形成主要受離子強度、特殊離子(Ca2+、Mg2+)等方面影響[6-8]。C反應(yīng)蛋白(CRP)是體內(nèi)炎性標(biāo)志物之一，在健康人血清中水平極低，在炎癥急性期、惡性腫瘤、局部缺血、組織損傷等患者的血清中，CRP水平急劇增加[9-13]。目前，CRP已被視為心血管疾病的獨立危險因子，并且成為心臟疾病診斷及預(yù)后的主要標(biāo)志物之一。傳統(tǒng)的CRP檢測方法都是以抗原抗體的特異性反應(yīng)為基礎(chǔ)的，如酶聯(lián)免疫吸附法、膠體金法、比濁法等。利用雙抗體夾心法進行CRP檢測時，標(biāo)記抗體的制備往往十分煩瑣，不僅增加了檢測的成本，而且抗體的修飾會在一定程度上影響抗體的表位，降低對抗原的特異性識別。筆者建立了一種基于硅片表面的可視化免疫檢測原理的適配子快速檢測CRP免疫傳感器[14]，本方法具有檢測時間短、操作簡便的優(yōu)點，并且大大降低了CRP的檢測成本，方法的靈敏度和準(zhǔn)確性都可以滿足臨床的檢測需要。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 光學(xué)顯微鏡為Olympus公司產(chǎn)品，GeSim Nano-Plotter型超微量點樣儀為德國GeSim公司產(chǎn)品。CRP捕獲抗體、CRP抗原為杭州啟泰生物科技有限公司產(chǎn)品；吐溫-20購自北京欣經(jīng)科生物科技有限公司；鏈霉親和素磁顆粒(500 nm)購自東莞博識科技有限公司；硅片(5.00 mm×8.00 mm×0.75 mm)購自北京大學(xué)微電子系；戊二醛購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；小牛血清購自北京欣經(jīng)科生物科技有限公司；海藻糖購自日本林原公司；其他未提及試劑均為分析純；實驗用水均為超純水。5′端生物素標(biāo)記適配子，序列為5′-生物素-GGC AGG AAG ACA AAC ATA TAA TTG AGA TCG TTT GAT GAC TTT GTA AGA GTG TGG AAT GGT CTG TGG TGC TGT-3′[15]，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2緩沖溶液、稀釋液等溶液的配制 (1)磷酸鹽緩沖液(PBS)的配制:稱取磷酸二氫鉀0.24 g，磷酸氫二鈉1.44 g，氯化鈉 7.90 g，氯化鉀0.22 g，用超純水溶解，以0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.4后用水稀釋至1 000 mL。(2)Tris緩沖溶液的配制:稱取Tris 6.05 g，氯化鈉7.90 g，氯化鉀0.22 g，用超純水溶解，以0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)至所需pH后用水稀釋至1 000 mL。(3)碳酸鹽緩沖液的配制:稱取無水碳酸鈉1.59 g，碳酸氫鈉2.93 g，用超純水溶解，以0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至9.60后用水稀釋至1 000 mL。(4)CRP標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:用小牛血清將CRP抗原標(biāo)準(zhǔn)品配制成所需水平待用。(5)適配子溶液的配制:用相應(yīng)稀釋液將5′端生物素標(biāo)記適配子稀釋至所需水平備用。(6)捕獲抗體稀釋液的配制:海藻糖1 g，使用pH 9.60碳酸鹽緩沖液溶解至10 mL。

1.3免疫反應(yīng)基本原理 適配子快速檢測CRP免疫傳感器基本操作過程見圖1，步驟如下。(1)硅片表面功能化處理：使用等離子清洗機處理硅片表面后，用APTES溶液浸泡硅片10 min，氮氣吹干，使用戊二醛溶液處理硅片表面，從而在硅片表面形成活性醛基，用于固定捕獲抗體。(2)捕獲抗體的固定：使用超微量點樣儀在硅片表面點上50 μg/mL CRP捕獲抗體，37 ℃反應(yīng)30 min后，使用BSA溶液封閉非點樣區(qū)，芯片4 ℃儲存?zhèn)溆谩?3)CRP抗原的反應(yīng)：將待測抗原溶液15 μL滴加到硅片表面，37 ℃反應(yīng)3 min，形成捕獲抗體-抗原復(fù)合物，使用磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)清洗除去殘留樣本。(4)生物素標(biāo)記適配子反應(yīng)：將適配子溶液15 μL滴加到硅片表面，37 ℃反應(yīng)5 min，形成捕獲抗體-抗原-適配子的夾心結(jié)構(gòu)，PBST清洗除去表面溶液。(5)親和素磁顆粒反應(yīng)：將親和素磁顆粒溶液15 μL滴加到硅片表面，37 ℃反應(yīng)3 min，在硅片表面形成捕獲抗體-抗原-適配子-磁顆粒的結(jié)構(gòu)，使用PBST清洗除去殘留樣本。(6)結(jié)果處理：使用顯微鏡對反應(yīng)區(qū)域拍照，并使用軟件對表面磁顆粒進行計數(shù)，反應(yīng)區(qū)的磁顆粒數(shù)量與抗原的水平呈正相關(guān)。

圖1 適配子檢測CRP示意圖

2 結(jié) 果

2.1檢測技術(shù)的建立與條件優(yōu)化

2.1.1離子強度的優(yōu)化 分別使用含0、100、300 mmol/L NaCl的Tris緩沖液作為生物素標(biāo)記適配子的稀釋溶液，分別檢測0、20、1 000 ng/mL的CRP。隨著NaCl水平的改變，適配子作為標(biāo)記檢測CRP時的反應(yīng)強度并沒有發(fā)生明顯的改變，見圖2A，說明在0～300 mmol/L的NaCl水平范圍內(nèi)，NaCl水平的改變不會明顯影響該適配子在筆者建立的基于硅片表面的靜態(tài)免疫反應(yīng)條件下對CRP的有效識別。

2.1.2Ca2+和Mg2+的影響 分別使用加入CaCl2(10 mmol/L)、MgCl2(1 mmol/L)及兩者均添加的Tris緩沖液作為適配子的稀釋溶液，分別檢測0、20、1 000 ng/mL的CRP。見圖2B，相對于不加入Ca2+、Mg2+，在緩沖溶液中加入Ca2+、Mg2+后，適配子檢測CRP時的反應(yīng)強度要略高于沒有加入Ca2+、Mg2+時的反應(yīng)強度。這說明單獨的Ca2+、Mg2+確實都能夠?qū)m配子的空間構(gòu)象產(chǎn)生一定的影響，從而提高了反應(yīng)強度，但這種影響并不是特別明顯。在同時加入Ca2+、Mg2+后，檢測的反應(yīng)強度相對于單獨加入Ca2+、Mg2+也相對較高，說明Ca2+、Mg2+同時存在時，適配子的空間構(gòu)象更有利于在基于硅片表面的靜態(tài)免疫實驗中對CRP抗原進行有效識別。

2.1.3適配子水平的優(yōu)化 在CRP水平為0、20、1 000 ng/mL的條件下，考察適配子水平對檢測結(jié)果的影響。見圖3，當(dāng)適配子水平達到6 μg/mL時，磁顆粒數(shù)目不再隨適配子水平的增加而增加，說明反應(yīng)已經(jīng)達到飽和狀態(tài)。后續(xù)實驗中，確定適配子水平為6 μg/mL。

注：A為不同NaCl水平的緩沖體系；B為不同特殊離子存在的緩沖體系。

圖2不同緩沖體系適配子檢測CRP的情況

圖3 不同適配子水平檢測CRP結(jié)果

2.1.4捕獲抗體穩(wěn)定性 包被在芯片上的捕獲抗體的穩(wěn)定性會影響檢測方法的精密度及準(zhǔn)確性?？疾炝税缓貌东@抗體的芯片在37 ℃放置一定時間后對CRP檢測的影響，CRP的水平為0、20、1 000 ng/mL。見圖4，在37 ℃放置7 d后，捕獲抗體仍能保持很高的反應(yīng)活性。

圖4 捕獲抗體在37 ℃放置一定時間后對檢測穩(wěn)定性的影響

2.2性能評價

2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線 在已經(jīng)設(shè)定好的反應(yīng)條件下，建立CRP在10～5 000 ng/mL檢測的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，見圖5。標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)大于0.99，說明線性關(guān)系良好，可以用于臨床樣本的定量檢測。以空白溶液測定值的3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差確定方法的最低檢出限，該方法的最低檢出限為0.5 ng/mL。

圖5 CRP檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.2特異性 當(dāng)CRP為20 ng/mL時，在血清中添加50 μg/mL的CEA和50 μg/mL的AFP，見圖6，其他抗原的加入并沒有影響CRP的檢測，說明適配子用于該檢測方法的特異性良好。

圖6 方法的特異性試驗

2.2.3回收率和精密度 考察了該檢測方法在CRP水平為10、50、1 000 ng/mL時的批內(nèi)及批間精密度[以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)表示]。如表1所示，平均回收率為96.8%～101.2%，批內(nèi)變異系數(shù)及批間變異系數(shù)均小于15%，說明此方法檢測CRP具有良好的精密度和重現(xiàn)性。

表1 血清中CRP檢測的回收率、批內(nèi)和批間精密度(n=4)

3 討 論

適配子快速檢測炎性指標(biāo)CRP免疫傳感器將免疫測定技術(shù)與生物傳感技術(shù)相結(jié)合，使用適配子取代標(biāo)記抗體，通過可視化的方法進行結(jié)果呈現(xiàn)，能夠綜合多方面的優(yōu)勢，具有高靈敏度、高特異性，操作簡便、快速的特點。利用適配子取代標(biāo)記抗體，能夠避免標(biāo)記抗體修飾過程中對抗體特異性的影響，而且適配子更易合成及儲存，有助于降低免疫檢測方法的成本，提高檢測的穩(wěn)定性。

為了使免疫傳感器的性能達到最佳，本文對檢測條件進行了優(yōu)化，結(jié)果表明，適配子溶液離子強度對檢測結(jié)果影響不明顯；Ca2+、Mg2+同時存在時，免疫傳感器檢測結(jié)果最佳；當(dāng)適配子水平達到6 μg/mL時，免疫反應(yīng)達到飽和；加急反應(yīng)顯示修飾好捕獲抗體的芯片在37 ℃放置7 d仍能保持很高的反應(yīng)性。在最優(yōu)的反應(yīng)條件下，該免疫傳感器在15 min內(nèi)即可獲得檢測結(jié)果，最低檢出限為0.5 ng/mL，檢測范圍為10～5 000 ng/mL，靈敏度高，特異性強。本方法平均回收率為96.8%～101.2%，批內(nèi)變異系數(shù)及批間變異系數(shù)均小于15%，呈現(xiàn)出良好的精密度和重現(xiàn)性。免疫傳感器的下一步研究可以使用適配子取代捕獲抗體，從而進一步降低檢測成本；與微流體技術(shù)相結(jié)合，將檢測方法集成為微流體芯片，使用一步法檢測CRP，從而更適用于臨床的快速檢測。

4 結(jié) 論

本研究使用適配子代替標(biāo)記抗體，建立了基于硅片表面可視化免疫檢測方法快速檢測CRP的方法。本方法利用可大量廉價合成的適配子代替昂貴的抗體，大大降低了檢測的成本，而且不會出現(xiàn)抗體在制作過程中批間活性不一致的現(xiàn)象。本方法中CRP的檢測范圍及檢出限能夠滿足一定的臨床需求，而且檢測簡便、快速。并且本方法在醫(yī)學(xué)檢測的其他領(lǐng)域也具有巨大的應(yīng)用價值。