ClC-3氯通道在二甲雙胍抑制鼻咽癌細(xì)胞周期進(jìn)程中的作用*

葉 東， 李坤鈺， 蔡曉萍， 陳綺婷， 曾 志， 余小慧

(廣東藥科大學(xué) 1生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院， 2臨床醫(yī)學(xué)院， 廣東 廣州 510006； 3暨南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 廣東 廣州 510632)

鼻咽癌是在我國(guó)南方及東南亞地區(qū)具有較高發(fā)病率的一種惡性腫瘤，在我國(guó)尤其好發(fā)于廣東、廣西、湖南等地。由于鼻咽部比較隱蔽，多數(shù)鼻咽癌患者被診斷時(shí)已處于中晚期，惡性程度比較高且具有極強(qiáng)的侵襲能力，嚴(yán)重影響人民群眾的健康。二甲雙胍是目前全球應(yīng)用最廣泛的口服降糖藥之一，但近年的研究表明，其除了具有傳統(tǒng)的降血糖作用外，還具有抑制胃癌[1]、肺癌[2]和卵巢癌[3]等腫瘤發(fā)生和發(fā)展的作用，其在腫瘤的預(yù)防和治療中可能發(fā)揮重要作用。因此，探究二甲雙胍對(duì)鼻咽癌周期進(jìn)程的影響及作用機(jī)制將會(huì)為臨床鼻咽癌的治療提供相關(guān)參考。

二甲雙胍的抗腫瘤作用機(jī)制尚不明確。加拿大研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)“同源物動(dòng)力學(xué)”蛋白片段互補(bǔ)分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)二甲雙胍至少能影響包括相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)功能蛋白在內(nèi)的745種蛋白的活性[4]。這提示二甲雙胍的抗腫瘤作用可能與離子通道轉(zhuǎn)運(yùn)功能相關(guān)。正常的離子通道結(jié)構(gòu)和功能是細(xì)胞進(jìn)行生命活動(dòng)的基礎(chǔ)。氯離子通道普遍分布于各類(lèi)生物體的細(xì)胞中，其中ClC-3氯通道(又稱氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)體ClC-3或氯離子通道蛋白3，基因符號(hào)為CLCN3)作為容積敏感性氯電流通道蛋白廣泛表達(dá)[5-6]。研究表明ClC-3氯通道不僅僅只發(fā)揮離子通道的作用，還參與細(xì)胞周期調(diào)控等很多重要的生理活動(dòng)[7-9]。

我們前期研究顯示敲減ClC-3氯通道基因表達(dá)可使細(xì)胞停滯于G0/G1期進(jìn)而抑制鼻咽癌細(xì)胞周期進(jìn)程，提示ClC-3氯通道在鼻咽癌細(xì)胞周期進(jìn)程調(diào)控中起著重要作用[10]。而二甲雙胍對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的作用是否與ClC-3氯通道有關(guān)尚未見(jiàn)報(bào)道。據(jù)此，本研究以低分化鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞為研究對(duì)象，采用流式細(xì)胞術(shù)、Western blot、膜片鉗等實(shí)驗(yàn)方法，探討二甲雙胍對(duì)鼻咽癌細(xì)胞周期進(jìn)程的影響以及ClC-3氯離通道在其中的作用，以期為臨床治療鼻咽癌提供參考。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞

本研究中所用到的人低分化鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞由廣東醫(yī)科大學(xué)病理教研室惠贈(zèng)。

2 主要試劑

二甲雙胍購(gòu)于上海碧云天公司；RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染專(zhuān)用培養(yǎng)液Opti-MEMI購(gòu)于Gibco；CCK-8試劑盒購(gòu)自Dojindo；抗ClC-3抗體購(gòu)自Abcam；抗GAPDH抗體購(gòu)自博士德生物科技有限公司； HRP標(biāo)記的山羊抗兔 II 抗與山羊抗鼠 II 抗購(gòu)自ProteinTech Group；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM3000購(gòu)自Invitrogen。

3 主要方法

3.1鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞的培養(yǎng) 人低分化鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞用含有10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和1×105g/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液，在含5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每48 h進(jìn)行1次傳代。

3.2ClC-3氯通道基因高表達(dá)質(zhì)粒pEZ-M03-ClC-3轉(zhuǎn)染鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞 常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)CNE-2Z細(xì)胞；轉(zhuǎn)染前1天將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔板中，并用不含抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞；當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)融合度達(dá)到50%～60%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染；細(xì)胞轉(zhuǎn)染前各用100 μL Opti-MEMI培養(yǎng)液稀釋pEZ-M03-ClC-3質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM3000，將2者混勻成轉(zhuǎn)染復(fù)合體，在室溫下，靜置5～10 min；用無(wú)血清培養(yǎng)液將孔板中的細(xì)胞洗2～3次，并在每孔中加2 mL培養(yǎng)液；將以上制得的200 μL轉(zhuǎn)染復(fù)合體加到培養(yǎng)孔板中進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，在正常培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)。除pEZ-M03-ClC-3轉(zhuǎn)染組外，另外設(shè)置pEZ-M03空質(zhì)粒對(duì)照組。

3.3CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 取96孔板，設(shè)置6組，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞種板后將96孔板置于含5% CO2、37 ℃的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h使細(xì)胞貼壁后，每孔加入100 μL含有不同濃度的二甲雙胍培養(yǎng)液，濃度依次為0、0.625、1.25、2.5、5、10和20 mmol/L，加藥后繼續(xù)放置于含5% CO2、37 ℃的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，每孔加入100 μL含有10% CCK-8的培養(yǎng)液，在含5% CO2、37 ℃的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光孵育30 min后取出，在酶標(biāo)儀上測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處吸光度(A)值。

3.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布 收集6孔培養(yǎng)板各孔的原始培養(yǎng)液作好標(biāo)記。再用0.25%胰酶消化細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，分別收集細(xì)胞于含有原培養(yǎng)液的15 mL離心管中，常溫下1 000 r/min 離心5 min，小心棄掉上清液后于離心管中加入1 mL預(yù)冷過(guò)的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞，將細(xì)胞依次分裝于1.5 mL EP管中，然后在低速冷凍離心機(jī)中4 ℃、1 000 r/min 離心5 min，棄掉上清液并加入1 mL預(yù)冷過(guò)的75%冰乙醇固定細(xì)胞，輕柔吹打均勻，放在4 ℃冰箱中保存過(guò)夜。用細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒處理樣品。將樣品在低速冷凍離心機(jī)中4 ℃、1 000 r/min離心5 min，棄上清液。再用1 mL PBS緩沖液洗滌細(xì)胞，同樣在低速冷凍離心機(jī)中4 ℃、1 000 r/min離心5 min，小心棄去上清液。往樣品中加入100 μL RNase A 37 ℃水浴孵育30 min，再加入400 μL PI染料染色均勻，4 ℃避光30 min。用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞中DNA含量，用軟件分析各時(shí)相細(xì)胞百分率。

3.5全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄細(xì)胞氯電流 按照常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)CNE-2Z細(xì)胞，消化后輕輕吹打制成單個(gè)細(xì)胞懸液；將細(xì)胞懸液滴到已消毒且直徑為22 mm的圓形玻片上(100～200 μL/片)，放置培養(yǎng)皿內(nèi)，并在37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)0.5～1 h，即等到細(xì)胞貼壁后方可開(kāi)始后面的實(shí)驗(yàn)；拉制玻璃微電極；電鍍電極銀絲；充灌微電極內(nèi)液；形成高阻抗封接,此時(shí)便可得到細(xì)胞貼附式膜片鉗模式；建立記錄系統(tǒng)；測(cè)定細(xì)胞膜電容；全細(xì)胞記錄形成、測(cè)定電容之后，繼續(xù)用等滲灌流液灌流，記錄全細(xì)胞氯電流；當(dāng)此氯電流達(dá)到峰值并趨于平穩(wěn)后，改用高滲灌流液進(jìn)行灌流，直到氯電流達(dá)到峰值并趨于平穩(wěn)(20～30 min)；再換低滲灌流液，待到最小值并趨于平穩(wěn)(5～10 min)，記錄氯電流。

3.6Western blot檢測(cè)ClC-3蛋白的表達(dá) 使用6孔培養(yǎng)板進(jìn)行CNE-2Z細(xì)胞種板待貼壁后，加入10 mmol/L濃度的二甲雙胍，同時(shí)設(shè)置不加藥空白對(duì)照組。放置于5% CO2、37 ℃的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞總蛋白并進(jìn)行BCA蛋白定量，然后95 ℃加熱3～5 min進(jìn)行變性；用10%的SDS- PAGE進(jìn)行蛋白分離后采用半干法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜；5%脫脂奶粉室溫下孵育封閉1～1.5 h后加入用抗體稀釋液稀釋的Ⅰ抗4 ℃孵育過(guò)夜；用TBST漂洗，每次5～10 min，洗滌3次；加入HRP標(biāo)記的Ⅱ抗，在室溫下孵育1 h后用TBST漂洗 5～10 min，洗滌3次；采用ECL化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯影；采用圖像分析軟件Image J進(jìn)行圖像分析。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次以上，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 二甲雙胍抑制鼻咽癌細(xì)胞的活力

在CNE-2Z細(xì)胞加入含有濃度依次為0、0.625、

1.25、2.5、5、10和20 mmol/L的二甲雙胍培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，通過(guò)CCK-8法檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞的活力，結(jié)果顯示5 mmol/L、10 mmol/L和20 mmol/L濃度的二甲雙胍都可有效抑制鼻咽癌細(xì)胞的活力，見(jiàn)圖1。結(jié)合不同濃度二甲雙胍對(duì)鼻咽癌細(xì)胞活力的影響，我們?cè)诤罄m(xù)研究中將采用10 mmol/L的濃度作為二甲雙胍的加藥濃度。

Figure 1.Metformin inhibited the viability of nasopharyngeal carcinoma cells at 5, 10 and 20 mmol/L. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 mmol/L group.

圖1 二甲雙胍抑制鼻咽癌細(xì)胞的活力

2 二甲雙胍阻抑鼻咽癌細(xì)胞周期停滯在G0/G1期

加入10 mmol/L的二甲雙胍處理CNE-2Z細(xì)胞48 h后，收集細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)二甲雙胍加藥組和空白對(duì)照組的細(xì)胞周期分布，結(jié)果如圖2所示。正常培養(yǎng)48 h的空白對(duì)照組CNE-2Z細(xì)胞的G0/G1期細(xì)胞所占的百分率為(56.9±2.8)%，S期細(xì)胞所占的百分率為(32.1±1.7)%，G2/M期細(xì)胞所占的百分率為(11.0±1.1)%；而在二甲雙胍加藥組，G0/G1期細(xì)胞所占百分率顯著提高到(69.9±3.0)%，S期細(xì)胞所占百分率下降到(23.5±1.5)%，G2/M期細(xì)胞所占百分率減少到(6.5±1.5)%。結(jié)果表明二甲雙胍可阻抑鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞的周期，使其停滯在G0/G1期。

Figure 2.Arrest of CNE-2Z cells at G0/G1phases by metformin. The cell cycle distribution was analyzed by flow cytometry in the control cells and the cells treated with metformin at 10 mmol/L for 48 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖2 二甲雙胍阻抑鼻咽癌細(xì)胞周期于G0/G1期

3 二甲雙胍抑制鼻咽癌細(xì)胞的氯電流

在CNE-2Z細(xì)胞加入10 mmol/L的二甲雙胍培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，通過(guò)膜片鉗分別檢測(cè)二甲雙胍加藥組和空白對(duì)照組的細(xì)胞在等滲溶液和低滲溶液中的全細(xì)胞氯電流，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10 mmol/L的二甲雙胍作用48 h后可使鼻咽癌細(xì)胞的氯電流明顯降低，見(jiàn)圖3，表明二甲雙胍可阻抑鼻咽癌細(xì)胞的氯電流。

Figure 3.Inhibition of hypotonicity-activated Cl-currents by metformin in the CNE-2Z cells Hypo: hypotonic perfusion liquid; Hyper: hypertonic perfusion liquid. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖3 二甲雙胍抑制鼻咽癌細(xì)胞氯電流

4 二甲雙胍抑制ClC-3氯通道蛋白的表達(dá)

在CNE-2Z細(xì)胞加入10 mmol/L的二甲雙胍培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞提取總蛋白，通過(guò)Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞ClC-3氯通道蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10 mmol/L濃度的二甲雙胍加藥作用48 h后，鼻咽癌細(xì)胞ClC4-3氯通道蛋白的表達(dá)水平明顯受到抑制，見(jiàn)圖4。

Figure 4.Inhibition of ClC-3 protein expression by metformin in the CNE-2Z cells. The protein levels of ClC-3 and the control GAPDH were determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖4 二甲雙胍抑制ClC-3氯通道蛋白的表達(dá)

5 ClC-3氯通道蛋白高表達(dá)可逆轉(zhuǎn)二甲雙胍對(duì)CNE-2Z細(xì)胞周期分布的影響

構(gòu)建質(zhì)粒pEZ-M03-ClC-3并轉(zhuǎn)染鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞后，Western blot檢測(cè)顯示質(zhì)粒pEZ-M03-ClC-3轉(zhuǎn)染后的鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞中ClC-3氯通道蛋白高表達(dá)，見(jiàn)圖5。細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示，PEZ-MO3-ClC-3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的G0/G1期細(xì)胞比率明顯低于二甲雙胍單獨(dú)處理組，表明ClC-3氯通道蛋白高表達(dá)可逆轉(zhuǎn)二甲雙胍對(duì)CNE-2Z細(xì)胞周期分布的影響，見(jiàn)圖6。

Figure 5.Over-expression of ClC-3 protein expression by pEZ-M03-ClC-3 plasmid transfection in the CNE-2Z cells. The protein levels of ClC-3 and the control GAPDH were determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖5 pEZ-M03-ClC-3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞ClC-3氯通道蛋白高表達(dá)

Figure 6.ClC-3 chloride channel protein over-expression reversed the effect of metformin on the cell cycle distribution of the CNE-2Z cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmetformin group.

圖6ClC-3氯通道基因高表達(dá)可逆轉(zhuǎn)二甲雙胍對(duì)CNE-2Z細(xì)胞周期分布的影響

討 論

在用二甲雙胍治療糖尿病的過(guò)程中，研究發(fā)現(xiàn)其具有抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展的作用，但是二甲雙胍的抗腫瘤作用機(jī)制尚不明確。最新研究顯示二甲雙胍能影響包括轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在內(nèi)的745種蛋白的活性[4]，其抗腫瘤作用可能與離子通道轉(zhuǎn)運(yùn)功能密不可分。氯通道在周期進(jìn)程和周期分布的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[11-13]。ClC-3氯離子通道蛋白的表達(dá)和分布是呈現(xiàn)細(xì)胞周期依賴性的[14]，提示ClC-3可能參與細(xì)胞周期調(diào)控。在鼻咽癌細(xì)胞中，cyclin D1可調(diào)節(jié)ClC-3氯離子通道蛋白的表達(dá)與活性[15]。我們前期研究顯示沉默ClC-3氯通道基因表達(dá)可使細(xì)胞停滯于G0/G1期進(jìn)而抑制鼻咽癌周期進(jìn)程，提示ClC-3氯通道在鼻咽癌周期進(jìn)程和周期調(diào)控中起著重要作用[10]。

由此本研究提出3個(gè)關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題：(1)二甲雙胍是否可以抑制鼻咽癌細(xì)胞周期進(jìn)程？(2)二甲雙胍是否影響鼻咽癌細(xì)胞ClC-3氯通道功能和蛋白表達(dá)？(3)二甲雙胍是否通過(guò)抑制ClC-3氯通道功能和蛋白的表達(dá)使細(xì)胞周期停滯？

首先，我們證明了二甲雙胍是通過(guò)阻抑鼻咽癌細(xì)胞周期使其停滯在G0/G1期從而抑制鼻咽癌周期進(jìn)程的：本研究結(jié)果顯示二甲雙胍使鼻咽癌細(xì)胞處在G0/G1期的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)明顯高于非加藥空白對(duì)照組，G0/G1期細(xì)胞增加，S期和G2/M期細(xì)胞減少，這提示二甲雙胍是影響細(xì)胞周期從G0/G1期進(jìn)入S期的重要因素之一。其次，我們證明了二甲雙胍作用于鼻咽癌細(xì)胞后，可以影響鼻咽癌細(xì)胞的氯通道功能和蛋白表達(dá)：本研究結(jié)果顯示二甲雙胍抑制鼻咽癌細(xì)胞細(xì)胞氯電流和ClC-3氯通道蛋白的表達(dá)。最后，我們證明了二甲雙胍是通過(guò)抑制ClC-3氯通道蛋白的表達(dá)使細(xì)胞周期停滯從而抑制鼻咽癌細(xì)胞周期進(jìn)程的：本研究結(jié)果顯示，二甲雙胍組G0/G1期細(xì)胞所占的百分率明顯高于非加藥空白對(duì)照組，二甲雙胍可阻抑鼻咽癌細(xì)胞周期使其停滯在G0/G1期;高表達(dá)ClC-3氯通道蛋白的質(zhì)粒pEZ-M03-ClC-3轉(zhuǎn)染鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞后，二甲雙胍對(duì)鼻咽癌細(xì)胞周期的影響被逆轉(zhuǎn)。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)ClC-3氯通道蛋白可以通過(guò)影響相關(guān)周期蛋白cyclin D1、CDK4/CDK6、p21和p27的表達(dá)來(lái)調(diào)控細(xì)胞周期[10]。二甲雙胍抑制鼻咽癌細(xì)胞ClC-3氯通道蛋白的表達(dá)后，可能影響了CDK4/CDK6、P21/27等相關(guān)周期蛋白的合成和活性，進(jìn)而影響細(xì)胞周期從G0/G1期通過(guò)進(jìn)入S期，具體的機(jī)制需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，二甲雙胍通過(guò)抑制鼻咽癌細(xì)胞ClC-3氯通道蛋白的表達(dá)和氯通道功能使細(xì)胞周期停滯于G0/G1期，從而抑制鼻咽癌細(xì)胞的周期進(jìn)程