心臟收縮力調(diào)節(jié)對慢性心力衰竭兔心室肌電重構(gòu)的影響*

張飛飛， 趙士霞， 郝清卿， 李 榕， 李英肖， 黨 懿， 齊曉勇

(河北省人民醫(yī)院， 河北 石家莊 050051)

慢性心力衰竭(chronic heart failure, CHF)是各種心臟疾病的晚期階段，其患病率呈不斷升高趨勢，且具有較高的死亡率，死亡原因通常為惡性室性心律失常。慢性心力衰竭合并惡性心律失常的機制與心室肌電重構(gòu)密切相關(guān)，包括心肌細胞膜離子通道改變及細胞間縫隙連接的重構(gòu)[1]。心臟收縮力調(diào)節(jié)(cardiac contractility modulation, CCM)是在心肌組織絕對不應期內(nèi)給予的高強度電刺激，可通過調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)代謝，影響心肌細胞結(jié)構(gòu)蛋白、鈣轉(zhuǎn)運蛋白及胚胎基因蛋白的表達，增強心肌收縮力，改善心室結(jié)構(gòu)重構(gòu)，從而改善心臟功能[2]。心臟收縮力調(diào)節(jié)是一種新興的非藥物治療心衰技術(shù)，其對于心室肌電重構(gòu)的影響仍需進一步研究。本項工作應用升主動脈縮窄法建立兔慢性心力衰竭模型，測定心室電生理指標及Kv1.4，Kv4.3及縫隙連接蛋白43(connexin 43, Cx43)的表達水平，探討心臟收縮力調(diào)節(jié)對于該模型心室肌電生理重構(gòu)的影響。

材 料 和 方 法

1 實驗動物和材料

選用6月齡新西蘭大白兔30只作為實驗對象，體重2.5～3.5 kg，雌雄不限，由河北醫(yī)科大學動物實驗中心提供，均于河北省人民醫(yī)院臨研中心動物房飼養(yǎng)。采用MICROPACE EPS320心臟電生理刺激儀給予心臟收縮力調(diào)節(jié)；小兒用臨時起搏電極購自美敦力；應用FX-4010型12道自動分析心電圖機記錄體表心電圖；應用Philips IU22彩色超聲診斷儀(探頭為S4-2，MHz)測定心臟超聲各指標；抗Kv1.4、Kv4.3、Cx43和內(nèi)參照β-actin抗體均購自河北博海生物工程開發(fā)有限公司；生物素標記的山羊抗兔IgGⅡ抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

2 主要方法

2.1慢性心力衰竭動物模型的建立 3%戊巴比妥鈉溶液以1 mL/kg經(jīng)兔耳緣靜脈注射麻醉后，將兔仰臥位固定于動物手術(shù)臺上，備皮，于胸骨左緣2、3、4肋間區(qū)，打開胸腔，暴露心臟，于升主動脈根部遠端1.0 cm處游離升主動脈根部約4～5 mm，環(huán)扎升主動脈使其為原周長60%。術(shù)中將小兒用臨時起搏電極彎針端縫合于心外膜左室前壁，直針端通過皮下穿刺固定于頸部，關(guān)閉胸腔。術(shù)后常規(guī)給予青霉素1.6×106U肌肉注射3 d預防感染。術(shù)后12周動物出現(xiàn)食欲下降、精神差、呼吸急促等心衰癥狀同時行心臟超聲示左室射血分數(shù)≤40%視為模型制作成功。

2.2實驗分組 實驗動物隨機分為3組：假手術(shù)(sham)組僅開胸和固定電極；心衰(heart failure,HF)組開胸、環(huán)扎升主動脈、固定電極；HF+CCM組開胸、環(huán)扎升主動脈、固定電極，并于術(shù)后12周模型制作成功后給予4周CCM刺激。

2.3CCM刺激 暴露動物模型頸部電極直針端，通過體表心電圖R波觸發(fā)EPS320刺激儀發(fā)放CCM刺激，脈寬2 ms，電壓7 V，于R波感知后延遲30 ms發(fā)放，每天刺激6 h，連續(xù)刺激4周。

2.4電生理指標測定 記錄兔十二導聯(lián)心電圖，以Q波的起始點至T波終點測定QT間期，連續(xù)測定3個心動周期取平均值。測定不同導聯(lián)最長QT間期(QTmax)及最短QT間期(QTmin)，依據(jù)Bazett公式計算心率校正后的QT間期(QTc)，即QTc=QT/(R-R)1/2；采用電生理刺激儀以S1S2 程序遞減刺激法，以起搏閾值2倍為輸出電壓，測定250 ms基礎(chǔ)周長時的心室有效不應期(ventricular effective refrective period, VERP)，用S1S2間期遞減掃描，S1S2呈8∶1，步長10 ms，當S2不能引起心室激動時, 將此S2值增加10 ms，再次進行S1S2間期遞減掃描,步長2 ms,以S2激動心室的最長S1S2間期為VERP，重復測量3次。

2.5心室肌組織Kv1.4、Kv4.3和Cx43 mRNA水平的測定 使用TRIzol(Invitrogen)試劑提取心室肌標本的總RNA，取5 μL RNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，取1 μg總NRA參照TIANScript RT KIT試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應條件為：70 ℃ 5 min，25 ℃ 10 min，42 ℃ 50 min，95 ℃ 5 min。PCR引物由博海生物工程開發(fā)有限公司合成，具體引物序列見表1。將獲得的cDNA按照實時熒光定量PCR試劑盒說明書擴增目的基因,PCR熱循環(huán)參數(shù)為：95 ℃ 15 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參照。反應結(jié)束后確認擴增曲線和熔解曲線。應用熒光定量PCR儀，采用2-ΔΔCt方法計算各目的基因的相對定量 (relative quantification, RQ)值,將RQ值用于統(tǒng)計分析。

2.6心室肌組織Kv1.4、Kv4.3和Cx43蛋白表達的測定 取100 mg心室肌組織標本，剪碎、離心，用BCA法測定蛋白濃度，經(jīng)非連續(xù)梯度SDS-PAGE分離蛋白，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上置于封閉液中，室溫溫育1 h，再加入Ⅰ抗，4 ℃搖床上過夜，應用洗液漂洗，再加入Ⅱ抗，室溫搖床上孵育1 h，然后用洗液漂洗。最后將顯色劑加入PVDF膜上，1 min后放入暗室曝光。定影后采用UVP分析儀器，對膠片進行掃描，系統(tǒng)自動生成每一個條帶灰度值。

表1 RT-qPCR的引物序列

3 統(tǒng)計學處理

運用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析處理數(shù)據(jù)。計量資料均采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 動物一般情況

30只新西蘭大白兔中，假手術(shù)組實驗動物全部存活，心衰組術(shù)中因分離環(huán)扎升主動脈過程中損傷分支動脈出現(xiàn)大出血死亡1只，心衰+CCM組中因開胸過程中損傷胸廓內(nèi)動脈發(fā)生大出血死亡1只。心衰組及心衰+CCM組中各存活9只且均滿足心衰標準。

2 電生理指標結(jié)果

實驗第12周末，與假手術(shù)組相比，心衰組和心衰+CCM組QTc顯著延長(P<0.05)；實驗第16周末，與心衰組相比，心衰+CCM組經(jīng)4周CCM刺激后QTc縮短(P<0.05)。實驗第16周末，與假手術(shù)組相比，心衰組和心衰+CCM組VERP顯著延長(P<0.05)；與心衰組相比，CCM顯著縮短心衰模型免VERP(P<0.05)。見表2。

表2 CCM對慢性心力衰竭兔QTc及VERP的影響

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsHF group.

3 心室肌組織Kv1.4、Kv4.3和Cx43 mRNA的表達

與假手術(shù)組相比，心衰組心肌組織中Kv1.4、Kv4.3和Cx43 mRNA水平顯著下降(P<0.05);與心衰組相比，CCM上調(diào)心衰兔心肌組織中Kv1.4、Kv4.3和Cx43 mRNA的水平(P<0.05),見圖1。

Figure 1.The mRNA levels of Kv1.4, Kv4.3 and Cx43 in ventricular myocardium. Mean±SD.*P<0.05vssham group;#P<0.05 HF group.

圖1 各組心室肌組織中Kv1.4、Kv4.3和Cx43的mRNA水平

4 心室肌組織Kv1.4、Kv4.3和Cx43蛋白的表達

與假手術(shù)組相比，心衰組心肌組織中Kv1.4、Kv4.3和Cx43 的蛋白表達顯著下降(P<0.05);與心衰組相比，CCM上調(diào)心衰兔心肌組織中Kv1.4、Kv4.3和Cx43蛋白的表達水平(P<0.05),見圖2。

討 論

慢性心力衰竭是心肌組織對多種致病因素失代償而出現(xiàn)的心臟結(jié)構(gòu)和(或)功能異常的臨床綜合征，易并發(fā)惡性室性心律失常，是導致死亡的主要原因。慢性心力衰竭時惡性室性心律失常發(fā)生的根本機制為心室肌電重構(gòu)，包括細胞膜離子通道和細胞間縫隙連接蛋白的改變，從而導致心室肌細胞復極延遲，動作電位時程延長及心室肌細胞間電傳導延遲或不均一性，最終出現(xiàn)心室肌復極離散度增加[3]?；趬毫ω摵稍黾邮锹孕牧λソ甙l(fā)生的重要原因，且新西蘭兔心室肌組織與人類心室肌組織具有相似的離子通道及縫隙連接蛋白表達，本研究應用升主動脈縮窄法建立慢性心力衰竭兔模型，模擬人類慢性心力衰竭時心室肌電生理重構(gòu)[4]。QTc反映全部心室肌細胞除極和復極過程的總時程，與心肌細胞電活動及室內(nèi)傳導等相關(guān)，QTc增大提示心室肌細胞異常激動、室內(nèi)傳導延遲，可用于評價心肌電活動狀態(tài)及惡性心律失常發(fā)生的風險[5-7]。本研究通過升主動脈縮窄法成功建立慢性心力衰竭動物模型，顯示實驗組中QTc較假手術(shù)組QTc明顯延長，提示存在心肌電重構(gòu)，其心律失常易感性增加。

Figure 2.The protein expression of Kv1.4, Kv4.3 and Cx43 in ventricular myocardium. Mean±SD.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsHF group.

圖2 各組心室肌組織中Kv1.4、Kv4.3和Cx43的蛋白表達

瞬時外向鉀電流(transient outward potassium current，Ito)是心室肌細胞復極中的主要外向電流，形成心室肌細胞動作電位l期。Kv4.3和Kv1.4是Ito通道α亞單位的重要編碼基因[8]。既往研究證實慢性心力衰竭時心室肌細胞Kv4.3和Kv1.4表達水平下降，Ito密度下降，心室肌細胞動作電位時程和VERP延長。此外Kv4.3和Kv1.4尚可通過影響L型鈣通道、鈉鈣交換體的活性狀態(tài)，調(diào)節(jié)興奮收縮偶聯(lián)過程、心肌收縮性及參與心肌細胞整個復極過程[9-10]。本研究結(jié)果與既往的研究相似，心衰兔心室肌組織Kv4.3和Kv1.4表達水平下降，VERP明顯延長。

縫隙連接蛋白廣泛參與心肌細胞間電、化學信號通路傳導?？p隙連接介導的心電沖動是維持正常心電功能的重要保障，Cx43為心室肌細胞的主要連接蛋白，相鄰心肌細胞之間的電耦聯(lián)即由Cx43所組成的縫隙連接通道主導[11]。Cx43的異常表達可參與房性及室性心律失常的發(fā)生及維持[12-13]，后續(xù)有基礎(chǔ)研究表明慢性心力衰竭的心室肌組織可出現(xiàn)Cx43的表達數(shù)量、分布方式和功能發(fā)生改變，即縫隙連接重構(gòu)，對心室肌電重構(gòu)產(chǎn)生了明顯影響[14]。本研究結(jié)果與既往研究的相似，心衰兔心室肌組織Cx43表達水平下降。Cx43表達下降不僅影響心室肌細胞的傳導性，且在Cx43表達較低的區(qū)域心肌組織跨壁離散度增大，導致心室肌不同部位的傳導時間和復極時間離散度增加，這與惡性室性心律失常和心源性猝死發(fā)生密切相關(guān)。

心臟收縮力調(diào)節(jié)為新興的非藥物治療心衰方法。Sabbah等[15]首次報道CCM動物實驗結(jié)果，2001年P(guān)appone等[16]率先將其應用于人體研究。目前研究證實CCM可通過調(diào)節(jié)肌漿網(wǎng)鈣ATP酶、鈉鈣交換蛋白-1、受磷蛋白、雷尼丁受體、細胞骨架蛋白、基質(zhì)金屬蛋白、P38絲裂原激活蛋白激酶等的表達或磷酸化水平，增強心肌收縮力，改善心肌重構(gòu)[17]。國內(nèi)亦有研究應用膜片鉗技術(shù)證實CCM可影響豚鼠心肌細胞膜鈉鈣交換電流和L型鈣通道電流[18]。2016 ESC急慢性心力衰竭診斷與治療指南中推薦在選擇性心衰患者可應用CCM治療[19]。CCM對于心衰心肌電生理重構(gòu)的影響較少報道，Winter等[20]指出CCM可增加健康兔離體乳頭肌細胞Iks電流，縮短動作電位時程，有可能出現(xiàn)增加心律失常風險，但后續(xù)臨床研究報道CCM可降低慢性心力衰竭患者死亡率，可能部分獲益與減少惡性室性心律失常的發(fā)作[21]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)CCM可通過TGFβ信號通路改善慢性心力衰竭兔心肌結(jié)構(gòu)重構(gòu)，且研究表明心衰兔心肌組織心電重構(gòu)與結(jié)構(gòu)重構(gòu)密切關(guān)聯(lián)[22]。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示慢性心力衰竭兔心室肌Kv1.4、Kv4.3和Cx43的表達下降可能是其電重構(gòu)的機制，心臟收縮力調(diào)節(jié)可能調(diào)節(jié)以上基因的表達，縮短心室肌有效不應期，降低QTc離散度，改善慢性心力衰竭兔心室肌電重構(gòu)，為心臟收縮力調(diào)節(jié)的臨床應用提供了實驗基礎(chǔ)。后續(xù)仍需進一步應用膜片鉗技術(shù)檢測離子通道功能學上的變化。