CCN1在脂多糖誘導(dǎo)急性肺損傷中的表達(dá)調(diào)控和在炎癥反應(yīng)中的作用*

董 年， 王蓓蓓▲， 宋晨劍， 陳俊杰， 陳成水△， 石 林

(1溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科， 浙江 溫州 325000; 2復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科， 上海 200000)

富半胱氨酸蛋白61(cysteine-rich protein 61，CYR61/CCN1)是即刻早期基因(immediate-early gene)編碼的一種分泌型基質(zhì)蛋白[1]，屬于CCN家族成員之一，與胚肺發(fā)育中的氣管生成和上皮成熟相關(guān)[2]。近年來逐漸認(rèn)識(shí)到CCN1作為一種分泌型基質(zhì)蛋白不僅參與生理發(fā)育過程，而且作為即刻早期蛋白參與不同肺部疾病的發(fā)生發(fā)展與轉(zhuǎn)歸[3]。作為一種新近認(rèn)識(shí)的炎癥調(diào)節(jié)因子，細(xì)菌毒素、缺血缺氧和機(jī)械牽拉等不同病理?xiàng)l件刺激皆可以調(diào)控CCN1的快速時(shí)相表達(dá)，異常表達(dá)的CCN1又能以自分泌或旁分泌的方式參與炎癥反應(yīng)、損傷后修復(fù)等病理生理過程[4]。Dolinay等[5]報(bào)道，即刻表達(dá)的CCN1可作為機(jī)械通氣相關(guān)肺損傷的一種敏感性生物標(biāo)志物，Perkowski等[6]同樣揭示了高氧相關(guān)肺損傷中存在即刻表達(dá)的CCN1，然而目前關(guān)于CCN1在急性肺損傷中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制和多效性的生物功能仍亟待闡明。本研究擬在觀察CCN1在正常肺組織中的表達(dá)定位和在脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)誘導(dǎo)肺損傷小鼠肺組織中表達(dá)變化的基礎(chǔ)上，探討LPS調(diào)控CCN1表達(dá)的分子機(jī)制和CCN1在LPS誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)表達(dá)中的作用，以CCN1為切入點(diǎn)深入揭示急性肺損傷的發(fā)病機(jī)制和尋找潛在的診治靶點(diǎn)。

材 料 和 方 法

1 材料和儀器

6～8周20 g左右SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)公司，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK(京)2016-0011。氣道上皮細(xì)胞16HBE購自上海中科院細(xì)胞庫。RPMI-1640培養(yǎng)液和胎牛血清購自Gibco；ERK1/2抑制劑PD98059、JNK抑制劑SP600125、P38抑制劑SB202190和PI3K抑制劑LY294002購自Sigma；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、預(yù)染蛋白Marker和ECL 發(fā)光液購自Thermo；抗CCN1和GAPDH抗體購自Santa Cruz；重組CCN1蛋白購自PeproTech；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa；TRIzol購自Invitrogen;CCN1-siRNA購自上海吉瑪公司。RT-qPCR引物由上海生工生物工程公司設(shè)計(jì)合成，見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1動(dòng)物模型復(fù)制 選取6～8周20 g左右SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠，麻醉后以靜脈留置針經(jīng)口氣管插管，接1 mL針筒后以水柱隨呼吸上下浮動(dòng)作為插管成功標(biāo)志。將LPS溶解于生理鹽水中，造模組根據(jù)4 mg/kg的劑量給予LPS氣道滴入，空白組給予等量的生理鹽水氣道滴入，造模成功4 h后麻醉處理動(dòng)物獲取肺組織。

2.2免疫組化染色 處死動(dòng)物后獲取肺臟組織石蠟切片，常規(guī)使用二甲苯脫蠟，雙氧水處理去除內(nèi)源性過氧化物酶，檸檬酸抗原組織抗原修復(fù)液處理切片修復(fù)抗原。常規(guī)血清封閉， I 抗4 ℃孵育過夜、II 抗室溫孵育60 min，PBS清洗后使用DAB顯色，以PBS代替 I 抗作為空白對(duì)照，中性樹脂封片后顯微鏡進(jìn)行攝片。

2.3免疫熒光染色 獲取生長(zhǎng)狀況良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的16HBE細(xì)胞，玻璃爬片事先置于24孔板，24孔板每孔接種5×104個(gè)細(xì)胞，待次日細(xì)胞貼壁后4%多聚甲醛固定15 min，0.1% GEPAL穿孔破膜10 min，1% BSA封閉1 h，I抗4 ℃孵育過夜，II抗室溫孵育0.5 h，DAPI染核5 min，封片激光共聚焦顯微鏡觀察。

2.4RT-qPCR 獲取生長(zhǎng)狀況良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的16HBE細(xì)胞，按照TRIzol說明書提取細(xì)胞總RNA，分光光度法測(cè)定計(jì)算提取的總RNA含量及濃度。取總RNA 2 μg反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以適量cDNA為模板進(jìn)行real-time PCR。PCR條件為:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。結(jié)果以GAPDH為內(nèi)參照，針對(duì)目的基因進(jìn)行相對(duì)定量。

2.5Western blot實(shí)驗(yàn) 獲取生長(zhǎng)狀況良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的16HBE細(xì)胞，細(xì)胞裂解液RIPA裂解細(xì)胞提取蛋白，使用BCA測(cè)定蛋白濃度。獲取取蛋白樣品30 μg蛋白至SDS-PAGE，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫下封閉2 h， I 抗4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜3次,每次10 min，II抗室溫孵育1.5 h，TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影，凝膠成像系統(tǒng)攝像分析條帶灰度值。

2.6siRNA轉(zhuǎn)染 獲取生長(zhǎng)狀況良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的16HBE細(xì)胞,計(jì)數(shù)4×105個(gè)16HBE細(xì)胞接種于6孔板，每孔添加2 mL無抗生素的1640培養(yǎng)基，根據(jù)每孔8 μL的劑量獲取siRNA/每孔4 μL的劑量獲取Lipofectamine 2000分別添加入200 μL Opti-MEMⅠreduced serum medium比例稀釋，將siRNA-Lipofectamine 2000混合后室溫靜置20 min，然后添加入每孔，6 h后轉(zhuǎn)換為含血清RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中涉及的siRNA序列見表1。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 CCN1在氣道上皮中的定位與表達(dá)

為探討CCN1的組織定位情況，獲取正常C57BL/6小鼠肺組織進(jìn)行免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)CCN1主要表達(dá)于小鼠氣道上皮細(xì)胞，見圖1A。同時(shí)對(duì)16HBE細(xì)胞進(jìn)行CCN1免疫熒光染色也發(fā)現(xiàn)，氣道上皮16HBE細(xì)胞可明顯表達(dá)CCN1，且主要定位于胞漿，見圖1B。

Figure 1.The location and expression of CCN1 in the bronchial epithelium. A: the location and expression of CCN1 in bronchial epithelial cells from normal lung tissue of mice detected by immunohistochemical (IHC) staining; B: immunofluoescence analysis of CCN1 in bronchial epithelial cells.

圖1 CCN1在氣道上皮中的定位與表達(dá)

2 LPS誘導(dǎo)氣道上皮CCN1的表達(dá)升高

使用LPS氣道滴入構(gòu)建C57BL/6小鼠急性肺損傷體內(nèi)模型，獲取造模組肺組織后進(jìn)行CCN1免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)造模組氣道上皮CCN1的表達(dá)強(qiáng)度相對(duì)于正常對(duì)照組升高，見圖2A。使用LPS刺激16HBE細(xì)胞，分別利用RT-qPCR和Western blot對(duì)細(xì)胞中CCN1的mRNA和蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CCN1表達(dá)水平呈LPS刺激濃度依賴性升高，其中以1 mg/L濃度刺激最為明顯(P<0.05)，見圖2B、C。

Figure 2.LPS up-regulated the expression of CCN1 in the bronchial epithelial cells. A: the expression of CCN1 in the lung tissues of the mice exposed to LPS was measured by immunohistochemical staining; B: the mRNA expression of CCN1 was measured by RT-qPCR; C: the protein expression of CCN1 was determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsvehicle group.

圖2 LPS誘導(dǎo)氣道上皮CCN1的表達(dá)升高

3 ERK1/2、JNK、P38和PI3K信號(hào)傳導(dǎo)途徑參與LPS誘導(dǎo)的CCN1表達(dá)

分別使用不同濃度的P38、JNK、ERK1/2和PI3K信號(hào)通路特異性抑制劑預(yù)處理16HBE細(xì)胞2 h，然后加入LPS共培養(yǎng)4 h，通過Western blot檢測(cè)CCN1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)不同濃度的ERK1/2、JNK、P38和PI3K抑制劑均可以部分逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的CCN1表達(dá)升高，并呈一定的抑制劑濃度依賴性(P<0.05或P<0.01)，見圖3。

4 CCN1參與LPS誘導(dǎo)的炎癥介質(zhì)IL-6、IL-8、TGF-β和VEGF的mRNA合成

使用重組CCN1蛋白刺激16HBE細(xì)胞，RT-qPCR檢測(cè)炎癥介質(zhì)IL-6、IL-8、TGF-β和VEGF的mRNA水平，發(fā)現(xiàn)重組CCN1蛋白可以促進(jìn)炎癥介質(zhì)IL-6、IL-8、TGF-β和VEGF的mRNA表達(dá)水平升高，其中IL-6和IL-8在1 h、TGF-β和VEGF在0.5 h升高最為明顯(P<0.05)，見圖4A～D。使用siRNA轉(zhuǎn)染16HBE細(xì)胞后，RT-qPCR檢測(cè)CCN1的mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)相較于scrambled siRNA組，CCN1-siRNA可以顯著降低16HBE細(xì)胞CCN1的mRNA表達(dá)(P<0.05)，見圖4E。使用LPS刺激siRNA干預(yù)的16HBE細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)CCN1-siRNA組IL-6、TGF-β和VEGF的mRNA升高幅度相對(duì)于scrambled siRNA組明顯降低(P<0.05)，而IL-8的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖4F。

討 論

炎癥瀑布反應(yīng)是肺損傷發(fā)病的核心環(huán)節(jié)，涉及免疫細(xì)胞/結(jié)構(gòu)細(xì)胞、促炎介質(zhì)/抗炎介質(zhì)的細(xì)胞-介質(zhì)網(wǎng)絡(luò)失衡，尋找炎癥瀑布中的關(guān)鍵介質(zhì)是診治的關(guān)鍵所在[7]。本研究聚焦即刻早期蛋白CCN1的表達(dá)定位和表達(dá)調(diào)控，與Moon等[8]報(bào)道相似，本研究通過免疫組化染色進(jìn)一步揭示了CCN1在正常肺組織中以氣道上皮細(xì)胞表達(dá)為主，免疫熒光染色同樣發(fā)現(xiàn)CCN1作為分泌型基質(zhì)蛋白主要定位胞漿，據(jù)此推測(cè)生理表達(dá)水平的CCN1具有維持氣道上皮正常生理功能的必要性。固有結(jié)構(gòu)細(xì)胞氣道上皮細(xì)胞在損傷狀況下可以扮演啟動(dòng)細(xì)胞的角色，即經(jīng)分泌炎癥介質(zhì)起始擴(kuò)大初始的炎癥反應(yīng)[9]。針對(duì)肺損傷時(shí)肺組織的免疫組化染色發(fā)現(xiàn)造模組氣道上皮CCN1的表達(dá)強(qiáng)度相較正常組明顯升高，考慮到研究使用的是氣道滴注LPS制造肺損傷模型，LPS率先作用氣道上皮促發(fā)氣道局部炎癥，據(jù)此推測(cè)氣道上皮即刻表達(dá)的CCN1可能在氣道局部炎癥和失控的炎癥瀑布轉(zhuǎn)化中發(fā)揮了重要的調(diào)控角色?；谝陨戏螕p傷時(shí)氣道上皮即刻表達(dá)的CCN1實(shí)驗(yàn)結(jié)果，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)圍繞氣道上皮來源CCN1的表達(dá)調(diào)控和炎癥反應(yīng)。為了驗(yàn)證以上體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，使用LPS體外刺激氣道上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)CCN1的mRNA和蛋白表達(dá)升高。越來越多的研究表明CCN1作為即刻早期蛋白其表達(dá)廣泛接受細(xì)菌毒素、炎癥介質(zhì)等的調(diào)控，其中調(diào)控機(jī)制涉及活性氧簇、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和P38 MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路等[10-11]。綜合我們之前在MAPK和PI3K信號(hào)通路在炎癥反應(yīng)中的作用積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)[12]，以及MAPK和PI3K信號(hào)傳導(dǎo)通路是LPS與TLR4配體-受體結(jié)合后常見的信號(hào)傳導(dǎo)通路[13-14]，利用特異性ERK1/2、JNK、P38和PI3K信號(hào)傳導(dǎo)途徑抑制劑預(yù)先處理，發(fā)現(xiàn)ERK1/2、JNK、P38和PI3K信號(hào)傳導(dǎo)通路參與介導(dǎo)LPS誘導(dǎo)的CCN1表達(dá)。考慮到在疾病狀態(tài)下CCN1的即刻表達(dá)特性，CCN1可能類似于應(yīng)激蛋白，其表達(dá)接受廣泛性的調(diào)控[15]。

Figure 3.The roles of ERK1/2, JNK, P38 and PI3K signaling pathways in CCN1 up-regulation. A: bronchial epithelial 16HBE cells were pretreated with ERK1/2 inhibitor PD98059 (PD) for 2 h before LPS stimulation for 4 h; B: the 16HBE cells were pretreated with JNK inhibitor SP600125 (SP) for 2 h before LPS stimulation; C: the 16HBE cells were pretreated with P38 inhibitor SB202190 (SB) for 2 h before LPS stimulation; D: the 16HBE cells were pretreated with PI3K inhibitor LY294002 (LY) for 2 h before LPS stimulation. The CCN1 expression was measured by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsvehicle group;+P<0.05,++P<0.01vsLPS group.

圖3 ERK1/2、JNK、P38和PI3K信號(hào)傳導(dǎo)途徑參與LPS誘導(dǎo)CCN1的表達(dá)

目前針對(duì)CCN1在肺損傷中多效性的功能仍待深入明確。張燕等[16]研究報(bào)道在機(jī)械通氣相關(guān)肺損傷中，異常表達(dá)的CCN1可以誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞的過早凋亡，然而有研究報(bào)道在高氧相關(guān)性肺損傷中，過高表達(dá)的CCN1可以逆轉(zhuǎn)肺泡上皮細(xì)胞的壞死[17]。之前的綜述總結(jié)CCN1是一個(gè)多效性炎癥介質(zhì)，其多效性具有微環(huán)境調(diào)控性、組織細(xì)胞特異性[18]。本研究擬探討氣道上皮分泌的CCN1在氣道上皮炎癥反應(yīng)中的作用，氣道上皮分泌的CCN1可以自分泌或旁分泌的方式發(fā)揮作用，利用重組CCN1蛋白刺激模擬CCN1的自分泌，發(fā)現(xiàn)CCN1刺激可以調(diào)控IL-6、IL-8、TGF-β和VEGF的表達(dá)，說明即刻表達(dá)的CCN1可以起始?xì)獾姥装Y反應(yīng)的自我擴(kuò)大過程。利用siRNA干擾技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)干擾CCN1的表達(dá)可以明顯降低氣道上皮細(xì)胞在LPS刺激下的炎癥反應(yīng)程度，結(jié)合Moon等[19]研究報(bào)道CCN1的表達(dá)分泌可以擴(kuò)大香煙提取物誘導(dǎo)IL-8的水平，說明CCN1是一個(gè)炎癥調(diào)節(jié)因子，在炎癥的起始和擴(kuò)大中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。至于即刻表達(dá)的CCN1是如何參與調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)需要后續(xù)更加深入的研究。

Figure 4.The role of CCN1 in LPS-induced inflammatory response. Bronchial epithelial 16HBE cells were treated with recombinant CCN1 at 1 mg/L for different time. The mRNA expression of IL-6 (A), IL-8 (B), TGF-β (C) and VEGF (D) was mea-sured by RT-qPCR. E: the silencing efficiency of CCN1-siRNA; F: the mRNA expression of IL-6, IL-8, TGF-β and VEGF after transcription with scrambled siRNA or CCN1-siRNA upon stimulation with LPS for 4 h was measured by RT-qPCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsscrambled siRNA.

圖4 CCN1參與LPS誘導(dǎo)的炎癥介質(zhì)IL-6、IL-8、TGF-β和VEGF的mRNA合成

本研究雖然初步揭示了氣道上皮來源的CCN1在表達(dá)調(diào)控和在炎癥反應(yīng)中的作用，然而尚存著較多的不足之處。首先，研究圍繞著氣道上皮細(xì)胞進(jìn)行，在研究層次上稍顯單一，不同來源的CCN1以及旁分泌的作用形式是后續(xù)的研究方向之一；其次，在研究深度上無論是使用特異性抑制劑或是siRNA干擾，說服力仍然欠缺，需要更多方位來說明CCN1的調(diào)控機(jī)制，目前已成功構(gòu)建出氣道上皮條件性CCN1敲除動(dòng)物模型[20]；最后，本研究?jī)H僅選取了一個(gè)氣道上皮細(xì)胞16HBE，考慮到實(shí)驗(yàn)的可靠性，以后勢(shì)必要在多種氣道上皮細(xì)胞系甚至在原代培養(yǎng)氣道上皮細(xì)胞中進(jìn)行驗(yàn)證。

總而言之，本研究初步探討了CCN1在氣道上皮的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，闡明了CCN1是一個(gè)炎癥調(diào)節(jié)因子參與氣道上皮的炎癥反應(yīng)，以CCN1為切入點(diǎn)揭示了急性肺損傷新的發(fā)病機(jī)制和未來潛在的診治靶點(diǎn)。