雷公藤紅素誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤H929細胞凋亡*

柯 波， 萬才水▲， 李安娜， 劉婷婷, 鄧秀英， 孔春芳， 金成豪△

(1南昌大學(xué)附屬人民醫(yī)院血液內(nèi)科， 2江西省血液腫瘤細胞生物學(xué)重點實驗室， 江西 南昌 330006)

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一種常見的惡性血液腫瘤，是血液系統(tǒng)第2位常見惡性腫瘤，發(fā)病率有逐年上升的趨勢[1]。MM大約占血液惡性腫瘤中10%，好發(fā)于老年人，其中位發(fā)病年齡為69歲[2]，主要表現(xiàn)為骨髓中漿細胞惡性增生，導(dǎo)致骨破壞、骨髓造血衰竭和多個器官組織損傷。MM至今仍無法治愈，并且復(fù)發(fā)和耐藥仍不可避免，存在復(fù)發(fā)率高、藥物耐受和疾病進展等臨床問題，這提示MM細胞具有生物學(xué)異質(zhì)性，可能存在一小部分細胞耐藥并導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。

雷公藤紅素(celastrol)是傳統(tǒng)中藥雷公藤中的一種單體，又名南蛇藤素，是從雷公藤屬及南蛇藤屬植物中分離出的五環(huán)三萜類色素，具有較強的抗炎、免疫抑制、抑制血管形成[3]以及抗腫瘤等藥理活性[4]。雷公藤紅素可以通過抑制NF-κB和STAT3的持續(xù)活化，下調(diào)細胞增殖和抗凋亡基因的表達，從而抑制多發(fā)性骨髓瘤細胞株的增殖，聯(lián)合沙利度胺和硼替佐米可增強對細胞凋亡的誘導(dǎo)作用[5]。本研究通過雷公藤紅素處理人多發(fā)性骨髓瘤H929細胞，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡和線粒體膜電位，彗星電泳實驗檢測DNA損傷，探討雷公藤紅素對H929細胞凋亡的誘導(dǎo)作用和分子機制。

材 料 和 方 法

1 實驗材料

H929細胞株購于南京凱基公司，由本實驗室傳代和保存。雷公藤紅素購于上海源葉公司；胎牛血清購于杭州四季青公司；RPMI-1640培養(yǎng)基和青鏈霉素購于北京索萊寶公司；CCK8試劑盒購于AbMole；羅丹明123熒光染料和彗星法DNA損傷檢測試劑盒購于南京凱基公司；caspase-9抑制劑Z-LE(OMe)HD(OMe)-FMK購于南京凱基公司；annexin V-PE/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒購于BD；兔抗人GAPDH、P53、XIAP、BAX、cytochrome C、COX IV、caspase-8和cleaved caspase-3抗體及羊抗兔HRP標(biāo)記的II抗購于Abcam；抗體稀釋液和封閉液購于上海碧云天公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購于CST。倒置光學(xué)顯微鏡購于OLYMPUS；CO2細胞恒溫培養(yǎng)箱購于日本三洋公司；RT6100 酶標(biāo)儀購于深圳雷杜公司；垂直電泳槽和轉(zhuǎn)移電泳槽購于Bio-Rad；FACSCalibur流式細胞儀購于BD。

2 實驗方法

2.1細胞系及細胞培養(yǎng) H929細胞株用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液懸浮培養(yǎng)，待細胞生長至對數(shù)期，用新鮮培養(yǎng)液懸浮細胞，并鋪種于細胞培養(yǎng)板用于后續(xù)實驗。

2.2CCK8法檢測細胞活力抑制率 選取對數(shù)生長期的H929細胞并用10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液懸浮，細胞計數(shù)后調(diào)整細胞密度至1×109/L，加入0.5、1、5和10 mg/L的雷公藤紅素(DMSO溶解)，對照組加入等體積DMSO，置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h和48 h，加入CCK8孵育2 h后檢測A450，比較不同濃度雷公藤紅素對H929細胞的抑制率，每組設(shè)置3個復(fù)孔。細胞活力抑制率(%)=(1-實驗組A值均值/對照組A值均值)×100%。

2.3流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長期的H929細胞，按1×109/L的細胞密度接種于12孔細胞培養(yǎng)板中，分組加入不同濃度的雷公藤紅素(1 mg/L和5 mg/L)，37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集細胞并用PBS溶液清洗1次，加入預(yù)冷的1×binding buffer并懸浮細胞，調(diào)整細胞密度，取0.2 mL細胞懸液并加入5 μL annexin V-PE和10 μL 7-AAD，室溫避光孵育15 min后加入0.3 mL 預(yù)冷的1×binding buffer混勻，用流式細胞儀上機檢測。

2.4細胞線粒體膜電位的檢測 取對數(shù)生長期的H929細胞，按1×109/L的細胞密度接種于12孔細胞培養(yǎng)板中，分組加入不同濃度的雷公藤紅素(1、5和10 mg/L)，37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集細胞并用PBS溶液清洗1次，加入羅丹明123使終濃度為10 mg/L，37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)避光孵育20 min后，用培養(yǎng)基清洗2次，繼續(xù)培養(yǎng)60 min后，用流式細胞儀上機檢測。

2.5彗星電泳實驗檢測DNA損傷 取對數(shù)生長期的H929細胞，按5×108個/L的細胞密度接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，按實驗分為對照組和1、5 和10 mg/L的雷公藤紅素處理組，37 ℃、5% CO2細胞24 h后，收集細胞并用PBS制成單細胞懸液，取10 μL 細胞懸液加入到75 μL 0.7% 低熔點瓊脂糖凝膠中，混勻后鋪第2層膠。按照彗星實驗DNA檢測試劑盒說明書進行鋪膠、細胞裂解和DNA堿解旋，將載玻片放置于堿性電泳中，25 V電泳30 min后，用0.4 mmol/L Tris-HCL緩沖液中和染色，并加入20 μL PI避光染色10 min，熒光顯微鏡下拍照。應(yīng)用Comet Assay Software Project (CASP)軟件分析彗星電泳圖中細胞的尾部DNA比例。

2.6Western blot檢測蛋白水平 取對數(shù)生長期的H929細胞，按5×108/L的細胞密度接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，按實驗分為對照組、1 mg/L 和5 mg/L的雷公藤紅素處理組和干預(yù)組，對照組加入等體積的DMSO，干預(yù)組中加入終濃度為5 μmol/L caspase 9抑制劑，37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中處理24 h再加入雷公藤紅素，常規(guī)培養(yǎng)24 h后收集細胞并加入RAPI(含有磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑cocktail)冰上裂解2 h，用BCA法對蛋白濃度進行定量。取20 μg的蛋白進行SDS-PAGE，然后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，于5%的BSA中室溫封閉2 h；4 ℃條件下 I 抗孵育過夜，用PBST漂洗4次,每次6 min；用HPR標(biāo)記的II 抗室溫振蕩孵育2 h，PBST漂洗4次；配置化學(xué)發(fā)光反應(yīng)反應(yīng)液并于室溫條件下孵育NC膜、暗室中曝光、顯影； Western blot結(jié)果用ImageJ圖像分析軟件分析目的蛋白條帶與內(nèi)參條帶吸光度比值，得出目的蛋白的相對表達量。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 7軟件進行統(tǒng)計分析，實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組比較采用單因素方差分析，兩組間的差異比較采用非配對t檢驗，以P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 雷公藤紅素抑制H929細胞的活力

采用CCK8法對H929細胞的活力進行檢測，結(jié)果顯示，不同濃度雷公藤紅素處理H929細胞24 h和48 h均對H929細胞的活力產(chǎn)生明顯的抑制作用，該抑制作用隨著雷公藤紅素濃度增加抑制效應(yīng)也隨之增強，雷公藤紅素處理H929細胞48 h后的抑制率明顯高于24 h組(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The effects of different concentrations of celastrol for different time on the viability inhibitory rate of H929 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs24 h group.

圖1 不同濃度雷公藤紅素作用不同時間對H929細胞活力抑制率的影響

2 雷公藤紅素誘導(dǎo)H929細胞凋亡

流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，1 mg/L和5 mg/L雷公藤紅素處理H929細胞24 h后，測得的凋亡率分別為(30.24±3.81)%和(76.75±1.51)%，明顯高于對照組[(6.52±0.80)%，P<0.05]。這一結(jié)果提示雷公藤紅素對H929細胞的凋亡有明顯的促進作用，隨著雷公藤紅素濃度增加，促進H929細胞凋亡作用明顯增強，見圖2。

Figure 2.The effect of celastrol on the apoptosis of H929 cells detected by flow cytometry. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 mg/L group.

圖2 雷公藤紅素誘導(dǎo)H929細胞凋亡

3 雷公藤紅素誘導(dǎo)H929細胞中線粒體膜電位下降

不同濃度的雷公藤紅素處理H929細胞后細胞線粒體膜電位均出現(xiàn)下降，應(yīng)用FlowJo軟件分析平均熒光強度(MFI)，結(jié)果顯示不同濃度雷公藤紅素處理組的MFI值均下降，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖3。這一結(jié)果表明雷公藤紅素誘導(dǎo)細胞對細胞凋亡的誘導(dǎo)作用可能是降低線粒體膜電位所介導(dǎo)的。

Figure 3.Decreased mitochondrial membrane potential in H929 cells induced by celastrol treatment. A: detection of the mitochondrial membrane potential of H929 cells by flow cytometry; B: decreased mean fluorescence intensity (MFI) was observed in celastrol treatment group. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 mg/L group.

圖3 雷公藤紅素誘導(dǎo)H929細胞線粒體膜電位下降

4 雷公藤紅素誘導(dǎo)H929細胞DNA損傷

不同濃度的雷公藤紅素處理24 h均對H929細胞具有DNA損傷誘導(dǎo)作用。在10 mg/L雷公藤紅素處理組中，彗星電泳實驗顯示細胞核DNA完全裂解，提示已經(jīng)處于晚期凋亡狀態(tài)，應(yīng)用CASP軟件分析彗星電泳圖中細胞的尾部DNA比例，結(jié)果顯示不同濃度雷公藤紅素處理組尾部DNA比例升高，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。這一結(jié)果表明雷公藤紅素可以誘導(dǎo)H929細胞DNA損傷，可能是誘導(dǎo)細胞凋亡的主要原因之一。

5 雷公藤紅素誘導(dǎo)H929細胞P53及凋亡相關(guān)蛋白的表達

H929細胞經(jīng)雷公藤紅素處理24后，Western blot檢測細胞中凋亡相關(guān)蛋白表達水平,結(jié)果顯示,不同濃度的雷公藤紅素(1 mg/L和5 mg/L)處理后，參與DNA損傷應(yīng)答以及細胞凋亡途徑的P53蛋白水平明顯上調(diào)，同時NF-κB途徑下游蛋白XIAP的表達水平降低,細胞凋亡執(zhí)行者cleaved PARP-1和cleaved caspase-3均上調(diào)表達，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖5。

6 雷公藤紅素通過caspase-9依賴性的線粒體途徑誘導(dǎo)H929細胞凋亡

1 mg/L和5 mg/L雷公藤紅素處理后細胞漿中cytochrome C含量明顯上升，對照組細胞漿中僅檢測出微量cytochrome C，同時1 mg/L和5 mg/L雷公藤紅素處理組細胞線粒體內(nèi)cytochrome C水平明顯下降，見圖6A。

caspase-9抑制劑提前干預(yù)后，cleaved caspase-3的蛋白水平與處理組相比明顯下降，但是caspase-8的蛋白水平?jīng)]有變化，提示雷公藤紅素對H929細胞凋亡的誘導(dǎo)依賴于caspase-9的活性，見圖6B。

討 論

MM是一種目前尚未能治愈的惡性血液腫瘤，MM的顯著特征為疾病的克隆性進展，疾病進程中發(fā)生的基因組事件可以分為原發(fā)性和繼發(fā)性基因組事件，即“雙打擊”學(xué)說。雖然以大劑量化療和造血干細胞移植為代表的治療策略能提高緩解率，但仍會出現(xiàn)復(fù)發(fā)以及藥物耐受，導(dǎo)致治療失敗。在惡性血液腫瘤中，尤其是淋巴系統(tǒng)血液腫瘤中，NF-κB信號途徑出現(xiàn)的異?；罨痆6]。在幾乎所有的原發(fā)性MM中，均發(fā)現(xiàn)NF-κB有異常的活化并與化療不敏感有關(guān)[7]。

Figure 4.DNA damage in H929 cells induced by celastrol. The DNA damage of H929 cells was detected by comet assay. Mean±SD.n=5.**P<0.01vs0 mg/L group.

圖4 雷公藤紅素誘導(dǎo)H929細胞DNA損傷

Figure 5.The effect of celastrol on the protein levels of P53 and apoptosis-related molecules in the H929 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 mg/L group.

圖5 雷公藤紅素對H929細胞中P53和凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

Figure 6.Celastrol activated mitochondrial apoptosis pathway in a caspase-9-dependent manner. A: detection of the protein levels of cytochrome C located in mitochondrion and cytoplasm of H929 cells by Western blot; B: caspase-9 inhibitor reversed the increase in the protein level of cleaved caspase-3 induced by celastrol. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 mg/L group;△△P<0.01vscontrol group;##P<0.01vscelastrol group.

圖6 雷公藤紅素依賴于caspase-9激活細胞線粒體凋亡途徑

本研究應(yīng)用CCK8法和細胞凋亡實驗分析雷公藤紅素對H929細胞是否具有生長抑制及誘導(dǎo)細胞凋亡的作用。結(jié)果顯示0.5～10 mg/L濃度的雷公藤紅素呈濃度依賴性地抑制細胞活力；有研究指出，雷公藤紅素可通過誘導(dǎo)A549細胞于G1期阻滯，導(dǎo)致了細胞生長抑制和凋亡增加[8]。細胞凋亡實驗結(jié)果顯示1 mg/L和5 mg/L的雷公藤紅素處理組中annexin V陽性細胞比例明顯高于對照組，提示雷公藤紅素對H929細胞具有明顯的細胞凋亡誘導(dǎo)作用。雷公藤紅素可以誘導(dǎo)細胞凋亡，但是其作用機制仍未闡明。本研究通過羅丹明123熒光探針加載細胞，流式細胞術(shù)分析H929細胞線粒體膜電位水平，實驗結(jié)果顯示雷公藤紅素處理后線粒體膜電位均出現(xiàn)下降，并呈濃度依賴性。有報道指出，雷公藤紅素可以誘導(dǎo)非小細胞肺癌A549細胞線粒體膜電位下降，以及細胞色素C釋放[9]。然而，雷公藤紅素對棕櫚酸鹽誘導(dǎo)的C2C12肌管細胞線粒體損傷具有保護作用，其機制是通過激活PI3K-AKT信號途徑增強細胞對葡萄糖的攝取以及三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物水平[10]。本研究的Western blot實驗結(jié)果顯示，雷公藤紅素明顯誘導(dǎo)H929細胞線粒體中的細胞色素C釋放，提示雷公藤紅素可能通過線粒體途徑誘導(dǎo)H929細胞凋亡。

從線粒體中釋放的cytochrome C通過激活caspase-9啟動細胞凋亡聯(lián)級反應(yīng)，是線粒體凋亡途徑中重要的機制。caspase-9是線粒體凋亡的關(guān)鍵蛋白， caspase-8是死亡受體凋亡途徑中關(guān)鍵的半胱天冬酶。為了確定雷公藤紅素是否依賴于caspase-9誘導(dǎo)細胞凋亡，本研究通過caspase-9抑制劑提前干預(yù)，分析雷公藤紅素對細胞凋亡關(guān)鍵蛋白caspase-3的活性，結(jié)果提示雷公藤紅素依賴于caspase-9促進細胞凋亡，而對caspase-8的表達無明顯作用。

P53作為維持基因組穩(wěn)定性的監(jiān)護者，在50%的人類腫瘤中發(fā)生突變[11]。MM患者中P53突變或缺失發(fā)生率分別為3%和10%，且與治療的耐藥有關(guān)，特別是在疾病進展后期[12-14]。正常情況下，P53與E3泛素化蛋白連接酶MDM2相互作用，保持較低的表達水平。當(dāng)細胞在應(yīng)激狀態(tài)下發(fā)生磷酸化，抑制與MDM2的相互作用所介導(dǎo)的蛋白降解，并通過其轉(zhuǎn)錄因子活性啟動下游基因的表達，參與細胞周期調(diào)控并誘導(dǎo)細胞凋亡[15]。然而，NF-κB途徑的活化可以抑制P53的轉(zhuǎn)錄以及P53介導(dǎo)的細胞凋亡[16-17]。本研究中的彗星實驗結(jié)果顯示雷公藤紅素處理的H929細胞彗尾DNA比例明顯上升，且呈濃度依賴性，結(jié)果提示雷公藤紅素具有誘導(dǎo)DNA損傷的作用，同時也可能是誘導(dǎo)P53表達的主要原因之一。

本研究的Western blot實驗結(jié)果顯示，經(jīng)雷公藤紅素處理的H929細胞中P53表達水平明顯上調(diào)。有文獻報道雷公藤紅素處理后的非小細胞肺癌細胞株中，P53的mRNA和蛋白表達水平均上調(diào)表達[18]。有文獻報道雷公藤紅素具有增強前列腺癌細胞對放療的敏感性，其機制可能是通過抑制DNA損傷應(yīng)答，增強細胞凋亡[19]。雷公藤紅素還可以誘導(dǎo)成纖維樣滑膜細胞DNA損傷，促進細胞凋亡，提示可能為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療提供新的思路[20]。還有報道顯示雷公藤紅素可以抑制范可尼貧血癥(Fanconi anemia，F(xiàn)A)通路，并且是一種FANCD2抑制劑，通過干擾其泛素化修飾及蛋白的穩(wěn)定性，抑制腫瘤細胞內(nèi)DNA損傷修復(fù)途徑，增強對化療藥物的敏感性[21]。因此，雷公藤紅素可能通過誘導(dǎo)DNA損傷激活P53的表達，并影響細胞凋亡進程。

雷公藤紅素作為一種蛋白酶體抑制劑，對NF-κB途徑的活化具有抑制作用，并參與炎癥調(diào)節(jié)，發(fā)揮抗炎作用。研究表明雷公藤紅素具有抑制腫瘤細胞增殖，促進細胞凋亡的生物學(xué)作用，發(fā)揮抗腫瘤作用，其主要分子機制為抑制IκBα亞基的磷酸化降解，抑制NF-κB途徑的活化，從而影響下游Bcl-2家族蛋白的表達[22-23]。本研究的Western blot實驗結(jié)果也顯示雷公藤紅素處理后的H929細胞中XIAP蛋白下調(diào)表達。XIAP是NF-κB的下游蛋白，對caspase-9以及下游的caspase-3的活性具有抑制作用，表現(xiàn)出抗凋亡作用[24]。因此，雷公藤紅素促進H929細胞凋亡，可能與NF-κB的活化及其下游蛋白表達受抑有關(guān)。

綜上所述，雷公藤紅素對多發(fā)性骨髓瘤H929細胞的活力具有抑制作用，并誘導(dǎo)細胞凋亡，可能與抑制NF-κB的活化、促進P53的表達以及誘導(dǎo)線粒體凋亡途徑有關(guān)。同時，雷公藤紅素具有誘導(dǎo)DNA損傷的作用，也是其誘導(dǎo)細胞凋亡的主要機制之一。雷公藤紅素抗腫瘤作用機制的研究為MM的臨床治療提供理論基礎(chǔ)，可能成為MM患者潛在的治療選擇。