CRIF1對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制*

馮 娟， 侯娟妮， 馮 健， 唐名揚(yáng)， 宋志平， 陳 莎， 裴海峰△， 楊永健, △

[1陸軍軍醫(yī)大學(xué)(第三軍醫(yī)大學(xué))研究生院， 重慶 400038； 2西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院心內(nèi)科， 四川 成都 610083]

脂毒性心肌病是指心肌細(xì)胞對(duì)脂肪酸(fatty acids，F(xiàn)As)的攝取、代謝和氧化失衡導(dǎo)致毒性脂代謝產(chǎn)物積聚，造成心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受損、心臟功能障礙和心力衰竭等[1]。CR6相互作用因子1(CR6-interacting factor 1，CRIF1)是一種多功能蛋白，表達(dá)于細(xì)胞核和胞質(zhì)中，在細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)具有調(diào)控細(xì)胞周期和腫瘤發(fā)展的作用[2]，并與多種轉(zhuǎn)錄因子相互作用[3]；它還是線粒體DNA編碼氧化磷酸化(oxidative phosphorylation，OXPHOS)亞基重要的有絲分裂核糖體蛋白，CRIF1缺失會(huì)影響OXPHOS復(fù)合物的正常形成，導(dǎo)致線粒體功能降低[4]。有研究表明，CRIF1缺失導(dǎo)致進(jìn)行性心臟肥大、心力衰竭，甚至死亡[5]。CRIF1是影響心肌細(xì)胞線粒體的結(jié)構(gòu)和功能重要分子，而線粒體又是細(xì)胞內(nèi)脂肪酸β氧化的重要場(chǎng)所，因此，CRIF1可能與脂肪酸的代謝及脂毒性心肌病的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系。目前， CRIF1在脂毒性心肌病中的作用及機(jī)制尚無研究報(bào)道。本研究采用棕櫚酸(palmitic acid, PA)模擬高脂環(huán)境誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，建立脂毒性心肌病細(xì)胞模型，研究CRIF1對(duì)高脂誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制，旨在為脂毒性心肌病提供新的治療靶點(diǎn)。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞株

小鼠心肌細(xì)胞系(mouse cardiomyocytes，MCMs)購(gòu)于深圳豪地華拓公司, 產(chǎn)品批號(hào)：HTX2799。

2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基及胰蛋白酶(HyClone)；胎牛血清(Gibco)；棕櫚酸(Sigma)；Trizol、SYBR及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)；RT-qPCR引物(成都擎科梓熙生物公司)；Lipofectamine 2000、Scra siRNA及CRIF1 siRNA(廣州銳博公司)；抗α-橫紋肌肌動(dòng)蛋白(α-sarcomeric actin)抗體(武漢博士德公司)；抗CRIF1抗體(Omnimabs)；抗β-actin抗體及山羊抗兔 II 抗(上海優(yōu)寧維公司)；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(BD)；測(cè)定小鼠活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的ELISA試劑盒(ELIXIR)；超氧化物陰離子熒光探針二氫乙啶(dihydroethidium，DHE)和N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)購(gòu)自上海碧云天公司。

3 主要方法

3.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組 小鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM正常葡萄糖培養(yǎng)基(葡萄糖5.5 mmol/L)中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱。根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇最佳棕櫚酸干預(yù)濃度為300 μmol/L模擬高脂環(huán)境，建立細(xì)胞脂毒性模型，干預(yù)時(shí)間24 h。首先將MCMs分為對(duì)照(control)組和PA (300 μmol/L)組。為探索CRIF1對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)MCMs損傷的影響及機(jī)制，利用siRNA轉(zhuǎn)染敲減細(xì)胞CRIF1的表達(dá)，進(jìn)一步將PA組分為溶劑組(vehicle，轉(zhuǎn)染試劑)、非特異陰性siRNA組(Scra siRNA，轉(zhuǎn)染試劑+非特異陰性siRNA)和CRIF1特異性siRNA組(CRIF1 siRNA，轉(zhuǎn)染試劑+CRIF1特異性siRNA)。為進(jìn)一步驗(yàn)證CRIF1在棕櫚酸導(dǎo)致MCMs損傷的具體機(jī)制，利用siRNA敲減CRIF1的表達(dá)，再將細(xì)胞分為DMSO組和NAC組，并給予相同條件的棕櫚酸干預(yù)。

3.2RT-qPCR檢測(cè)CRIF1的mRNA表達(dá) 采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以β-actin為內(nèi)參照，采用RT-qPCR法測(cè)量CRIF1的mRNA表達(dá)量。用基因相對(duì)定量法(2-ΔΔCt)計(jì)算目的基因表達(dá)量。β-actin的上游引物序列為5’-ACCCCGTGCTGCTGACCGAG-3’，下游引物序列為5’-TCCCGGCCAGCCAGGTCCA-3’；CRIF1的上游引物序列為5’-ACGAATTGCTGCTATGGCCT-3’，下游引物序列為 5’-CATGGCCTAGTGTCCAGGTG -3’。

3.3Western blot 檢測(cè)CRIF1蛋白表達(dá) 配制分離膠和濃縮膠，取10 μL樣品行SDS-PAGE分離，然后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，于5%脫脂牛奶中室溫封閉2 h。用抗CRIF1(1∶500)和β-actin(1∶5 000)的 I 抗4 ℃孵育過夜。TBST漂洗3次，II 抗(山羊抗兔，1∶8 000)室溫孵育1 h后，TBST漂洗3次,每次10 min(在搖床上進(jìn)行)，最后使用ECL化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行發(fā)光，并使用ImageJ軟件分析灰度值。

3.4細(xì)胞免疫熒光染色 細(xì)胞干預(yù)完成后吸去培養(yǎng)基，用PBS沖洗3次,每次5 min。以4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS沖洗(3次)。0.2% Triton X-100透化2～5 min，PBS沖洗。5 % BSA室溫封閉30 min，PBS沖洗。加入抗CRIF1抗體(1∶100)4 ℃過夜，PBS沖洗。加入熒光 II 抗，37 ℃避光孵育30 min，PBS沖洗。DAPI以1:500濃度滴于激光共聚焦皿，室溫孵育5 min，PBS沖洗。保持濕潤(rùn)，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

3.5CRIF1 siRNA的轉(zhuǎn)染 提前 1 d 將MCMs接種到6孔板中，待細(xì)胞密度到30%～50%時(shí)，使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染siRNA，轉(zhuǎn)染濃度為50 nmol/L，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。Control組僅給予Lipofectamine 2000處理，Scra siRNA組給予Lipofectamine 2000+Scra siRNA處理，CRIF1 siRNA組給予Lipofectamine 2000+CRIF1 siRNA處理。轉(zhuǎn)染48 h后檢測(cè)CRIF1的mRNA表達(dá)水平，72 h后檢測(cè)CRIF1蛋白表達(dá)以明確敲減效率。轉(zhuǎn)染48 h后給予300 μmol/L棕櫚酸繼續(xù)干預(yù)24 h并檢測(cè)細(xì)胞的ROS和凋亡水平。

3.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MCMs的凋亡水平 用0.25%不含EDTA的胰酶消化離心收集細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌后binding buffer重懸細(xì)胞，加入annexin V-FITC(2.5 μL)混勻后，室溫避光孵育15 min，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)前5 min再加入PI染液(2.5 μL)，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，F(xiàn)lowJo軟件分析數(shù)據(jù)。

3.7DHE染色觀察MCMs中ROS的生成 將DHE熒光探針按5 μmol/L濃度用培養(yǎng)基稀釋后加入到各組細(xì)胞培養(yǎng)基中，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，37 ℃避光孵育30 min，采用激光共聚焦顯微鏡觀察DHE熒光水平。

3.8ELISA試劑盒測(cè)定MCMs細(xì)胞內(nèi)ROS的含量 加入裂解液破壞細(xì)胞，4 ℃ 2500 r/min離心30 min取上清液，按試劑盒說明書操作，測(cè)量吸光度，計(jì)算ROS含量。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 高脂促進(jìn)MCMs中CRIF1的表達(dá)

經(jīng)免疫熒光染色鑒定MCMs,見圖1。采用300 μmol/L棕櫚酸對(duì)MCMs干預(yù)24 h后，通過RT-qPCR及Western blot法分別檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CRIF1的mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05)，見圖2A、B。通過細(xì)胞免疫熒光染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CRIF1的表達(dá)水平明顯升高，見圖2C。這提示CRIF1不但在MCMs有表達(dá)，而且棕櫚酸可導(dǎo)致其表達(dá)增多。該結(jié)果表明CRIF1可能在高脂所致的MCMs損傷中發(fā)揮了一定作用。

2 CRIF1沉默加重高脂條件下的MCMs凋亡

為驗(yàn)證CRIF1是否在高脂誘導(dǎo)的MCMs凋亡中發(fā)揮了重要作用，本實(shí)驗(yàn)采用特異性siRNA敲減CRIF1的表達(dá)后繼續(xù)予以棕櫚酸干預(yù)。轉(zhuǎn)染后CRIF1的mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)，見圖3A、B。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)棕櫚酸能夠?qū)е翸CMs凋亡增加(P<0.05)；而CRIF1沉默進(jìn)一步增加了MCMs凋亡(P<0.05)，見圖3C。該結(jié)果表明CRIF1可能是高脂環(huán)境下受損MCMs重要的保護(hù)性分子。

Figure 1.The identification of cardiomyocytes. The protein expression of α-sarcomeric actin detected by immunofluorescence staining (blue indicates DAPI; red indicates α-sarcomeric actin; ×200).

圖1 心肌細(xì)胞鑒定

3 CRIF1沉默誘發(fā)心肌脂毒性損傷時(shí)增加ROS的生成

為進(jìn)一步明確CRIF1沉默是否通過氧化應(yīng)激途徑加重高脂條件下的心肌脂毒性損傷，在敲減CRIF1表達(dá)的基礎(chǔ)上予以棕櫚酸干預(yù)24 h后，DHE染色和ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，棕櫚酸能夠增加細(xì)胞內(nèi)ROS 的生成(P<0.05)；而CRIF1沉默后細(xì)胞內(nèi)ROS 的生成進(jìn)一步增加(P<0.05)，見圖4。這一結(jié)果表明CRIF1的確通過抑制ROS的產(chǎn)生發(fā)揮高脂條件下的心肌保護(hù)作用。

4 NAC部分逆轉(zhuǎn)CRIF1下調(diào)造成的心肌脂毒性損傷

同樣轉(zhuǎn)染CRIF1 siRNA的細(xì)胞，用抗氧化劑NAC(5 mmol/L)干預(yù)6 h后，ELISA及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，MCMs中ROS及細(xì)胞凋亡水平明顯降低(P<0.05)，見圖5。這表明CRIF1作用的發(fā)揮與氧化應(yīng)激反應(yīng)顯著相關(guān)。

討 論

近年來，由于人們飲食習(xí)慣和生活方式的改變，肥胖的發(fā)病率正在逐年增加，肥胖相關(guān)的心功能障礙也在逐年升高，這可能與脂毒性心肌病的發(fā)生密切相關(guān)[6]。心臟能量代謝的60%～80%依賴于脂肪酸的氧化，當(dāng)心肌細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)的攝取和氧化失衡時(shí)，毒性的脂肪代謝產(chǎn)物(如神經(jīng)酰胺、二酰甘油和長(zhǎng)鏈?；o酶A等)可在心肌細(xì)胞中積聚引起線粒體功能障礙、能量生成減少和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等，最終可導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡、心功能障礙和心力衰竭等嚴(yán)重后果，這一過程稱為脂毒性心肌病[7]。2型糖尿病、肥胖、心肌缺血和心力衰竭等疾病均可引起脂毒性心肌病的發(fā)生[8]。2型糖尿病及肥胖患者的血脂異?？蓪?dǎo)致心臟脂質(zhì)積累[9]，而循環(huán)中高游離脂肪酸(free fatty acids， FFAs)水平與心肌脂毒性密切相關(guān)[10]，可引起心肌肥厚、纖維化和心肌細(xì)胞凋亡等[11]。本研究也證實(shí)了棕櫚酸能夠誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，但其潛在的機(jī)制尚不清楚。因此，深入研究脂毒性心肌病的損傷機(jī)制和干預(yù)靶點(diǎn)非常有意義。

Figure 2.The effect of palmitic acid (PA) on CRIF1 expression at mRNA and protein levels in the MCMs. A: the mRNA expression of CRIF1 detected by RT-qPCR; B: the protein expression of CRIF1 detected by Western blot; C: the protein expression of CRIF1 detected by immunofluorescence staining (blue indicates DAPI; green indicates CRIF1; ×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖2 棕櫚酸對(duì)MCMs CRIF1表達(dá)的影響

線粒體對(duì)能量穩(wěn)態(tài)的維持至關(guān)重要,其氧化磷酸化系統(tǒng)在細(xì)胞能量和自由基的產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用[12]。線粒體氧化磷酸化系統(tǒng)由嵌入線粒體內(nèi)膜的5個(gè)OXPHOS多聚體復(fù)合物組成；而CRIF1是OXPHOS亞基生成所必需的核糖體因子，在維持線粒體的結(jié)構(gòu)和功能中占據(jù)舉足輕重的地位[4]。CRIF1是一種具有多種生物學(xué)功能的蛋白，在細(xì)胞核和線粒體中均有表達(dá)，最初被認(rèn)為是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和生長(zhǎng)的分子[13]，可與多種核受體交互作用[14]。在小鼠心肌細(xì)胞中，CRIF1的缺失可引起線粒體結(jié)構(gòu)異常和心肌ATP產(chǎn)量降低，表明CRIF1可能在維持心肌線粒體結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用[5]。然而，CRIF1在脂毒性心肌損傷中的表達(dá)以及功能研究尚無報(bào)道。我們的研究發(fā)現(xiàn)，CRIF1表達(dá)于MCMs中，且在棕櫚酸干預(yù)后明顯上升，提示CRIF1可能在脂毒性心肌損傷中發(fā)揮著重要作用。在脂毒性心肌病細(xì)胞模型中CRIF1表達(dá)的增加，可能是細(xì)胞內(nèi)的一種代償性自我保護(hù)機(jī)制。為了進(jìn)一步闡明CRIF1在其中的作用，我們給予特異性siRNA敲減CRIF1的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)， CRIF1下調(diào)會(huì)進(jìn)一步增加MCMs凋亡，即CRIF1下調(diào)會(huì)加重脂毒性心肌損傷。CRIF1可能在脂毒性心肌損傷中發(fā)揮重要保護(hù)作用，但其通過何種途徑調(diào)控細(xì)胞凋亡需要進(jìn)一步研究。

ROS是細(xì)胞代謝和穩(wěn)態(tài)維持的重要副產(chǎn)物，線粒體是產(chǎn)生ROS主要場(chǎng)所之一，當(dāng)細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生過多，超過抗氧化系統(tǒng)對(duì)其清除的能力，可對(duì)機(jī)體產(chǎn)生有害的氧化應(yīng)激損傷[15-16]。氧化應(yīng)激可導(dǎo)致線粒體損傷[17]，而線粒體損傷又進(jìn)一步增加ROS的生成[18]，兩者形成不斷加劇的惡性循環(huán)。大量人體和動(dòng)物研究均表明，氧化應(yīng)激參與了脂質(zhì)超載的反應(yīng)，氧化應(yīng)激水平隨著脂質(zhì)的積累而不斷增加[19]。循環(huán)中過高的脂質(zhì)水平可通過影響心臟線粒體功能導(dǎo)致心肌損傷[8]，線粒體氧化應(yīng)激在代謝綜合征患者心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)病機(jī)制中起主要作用[20]，而心肌細(xì)胞凋亡是影響心臟結(jié)構(gòu)和功能的重要因素[21]。這些研究均表明，氧化應(yīng)激可能介導(dǎo)了脂毒性心肌損傷發(fā)生，我們的研究也證明氧化應(yīng)激可能介導(dǎo)脂毒性心肌損傷，而線粒體CRIF1是否參與其中呢?在骨髓多能間充質(zhì)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，CRIF1可減輕輻射損傷后的氧化應(yīng)激水平[22]；在內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，敲減CRIF1的表達(dá)可增加ROS生成[23]。這些報(bào)道均提示CRIF1可能通過抑制氧化應(yīng)激發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。為了明確CRIF1在脂毒性心肌病中的相關(guān)保護(hù)機(jī)制，我們?cè)谇脺pCRIF1后檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平，發(fā)現(xiàn)MCMs中ROS的水平顯著增加，提示細(xì)胞內(nèi)ROS含量增加可能是CRIF1下調(diào)加重MCMs凋亡的內(nèi)在機(jī)制。為了明確這一結(jié)論，本研究給予細(xì)胞抗氧化劑NAC干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NAC可降低細(xì)胞ROS水平，減少CRIF1下調(diào)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)論：CRIF1對(duì)MCMs的保護(hù)作用可能是通過抑制細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激實(shí)現(xiàn)的。

Figure 3.The effects ofCRIF1knock-down on apoptosis of PA-treated MCMs. A: RT-qPCR; B: Western blot; C: flow cytometry; Mean±SD.n=5.ΦP<0.05vscontrol group;&P<0.05vsvehicle/PA group;$P<0.05vsScra siRNA/PA group.

圖3 敲減CRIF1的表達(dá)對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)MCMs凋亡的影響

Figure 4.The effects ofCRIF1knock-down on ROS level in PA-treated MCMs. A: DHE staining (×200); B: ELISA. Mean±SD.n=4.ΦP<0.05vscontrol group;&P<0.05vsvehicle/PA group;$P<0.05vsScra siRNA/PA group.

圖4 敲減CRIF1的表達(dá)對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)MCMs生成ROS的影響

Figure 5.NAC attenuated the PA-treated MCM damage enhanced byCRIF1knock-down. A: ROS level detected by ELISA; B: apoptosis detected by flow cytometry. Mean±SD.n=5.#P<0.05vsDMSO group.

圖5 NAC減輕敲減CRIF1表達(dá)加重棕櫚酸誘導(dǎo)所致MCMs損傷的作用

本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了脂毒性心肌病狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)總CRIF1的變化情況，但其在不同細(xì)胞器中表達(dá)的有無變化尚不清楚，其抑制ROS產(chǎn)生具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探索，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中我們將采用腺病毒過表達(dá)技術(shù)進(jìn)一步探索CRIF1與氧化應(yīng)激之間的關(guān)系。綜上所述，在脂毒性心肌病中，CRIF1可能通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)來發(fā)揮心肌保護(hù)作用。這為CRIF1在脂毒性心肌病中的作用提供了理論基礎(chǔ)，有利于開發(fā)新的防治靶點(diǎn)。