不同熬煮時(shí)間對(duì)臺(tái)灣泥鰍湯蛋白組分及抗氧化能力的影響

(溫州科技職業(yè)學(xué)院,浙江溫州 325006)

臺(tái)灣泥鰍(Paramisgumusdabryanusssp.)是臺(tái)灣地區(qū)選育的泥鰍新品種,肉鮮味美,富含優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、脂肪酸、多種礦物元素及B族維生素[1]。中醫(yī)認(rèn)為,泥鰍具有補(bǔ)中氣、祛濕邪之用[2],被稱為“水中人參”,具有較高的藥用價(jià)值?，F(xiàn)有研究表明,從泥鰍中提取的蛋白、多糖、氨基酸等,具有提高機(jī)體免疫力、抗炎、抗氧化等作用[3-6]。

湯在中國(guó)人的飲食中居于十分重要的地位,古代哲人對(duì)湯膳的評(píng)價(jià)“寧可食無(wú)饌,不可飯無(wú)湯”就說(shuō)明了湯膳的重要性[7]。湯的烹飪方式有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的輸送,較大程度地保留食材風(fēng)味的同時(shí),可使食材中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)最大程度地溶出促進(jìn)消化,具有補(bǔ)充能量、滋補(bǔ)養(yǎng)生等功效[8]。不同的熬煮時(shí)間對(duì)湯的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值會(huì)有不同的影響,倪東東等[9]發(fā)現(xiàn),采用傳統(tǒng)常壓熬煮大鯢湯,熬煮60 min時(shí)湯中脂肪含量適宜,且飽和脂肪酸/多不飽和脂肪酸值(SFA/PUFA)最佳,氨基酸含量最高;朱琳等[10]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)烏魚(yú)湯在熬制1.5 h后,營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量明顯提高,熬制魚(yú)湯的時(shí)間應(yīng)控制在1.5～3 h。

泥鰍湯是一道歷史悠久的家常菜,其食療和藥用價(jià)值早已被報(bào)道[11],但大部分集中在臨床醫(yī)學(xué)研究上,而關(guān)于泥鰍湯的營(yíng)養(yǎng)成分種類及其含量、泥鰍湯的抗氧化性研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)以臺(tái)灣泥鰍為原料,通過(guò)分析泥鰍湯的可溶性蛋白、游離氨基酸、蛋白質(zhì)組分變化及ABTS+·、DPPH·清除率,探究了泥鰍湯熬煮過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的變化規(guī)律及抗氧化能力的變化,旨為科學(xué)合理地烹飪臺(tái)灣泥鰍湯提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮活臺(tái)灣泥鰍 浙江平陽(yáng)美飛淡水泥鰍養(yǎng)殖專業(yè)合作社;食鹽、姜等 永輝超市;乙腈 色譜純,北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司;正己烷 HPLC級(jí),北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司;十七種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品 中國(guó)藥品生物制品檢定所;蛋白Marker 10～200 kDa,福州飛凈生物科技有限公司;牛血清白蛋白、乙醇、SDS、尿素、巰基乙醇等 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

Agilent1100液相色譜儀 安捷倫科技(中國(guó))有限公司;Agilent ZORBAX Eclipse AAA 安捷倫科技(中國(guó))有限公司;伯樂(lè)Mini-PROTEAN Tetra cell165-8001電泳槽 美國(guó)Bio-Rad公司;721G紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;ALPHA2-4/LSC真空冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 臺(tái)灣泥鰍湯加工工藝 臺(tái)灣泥鰍→宰殺→放血→去黏液、內(nèi)臟→清洗→分割、稱質(zhì)量→加水→大火煮開(kāi)→小火慢燉→臺(tái)灣泥鰍湯

1.2.2 不同熬煮時(shí)間對(duì)臺(tái)灣泥鰍湯品質(zhì)的影響 分別以30、60、90、120、150 min為熬煮時(shí)間熬制泥鰍湯,取100 mL泥鰍湯樣品,于4 ℃、15000 r/min下離心10 min,取上清液進(jìn)行蛋白組分(可溶性蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)電泳及游離氨基酸組成)分析和ABTS+·、DPPH·清除率的測(cè)定。

1.2.3 可溶性蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 采用雙縮脲法測(cè)定泥鰍湯中可溶性蛋白質(zhì)含量[12]。準(zhǔn)確移取上清液1 mL于試管中,加入4 mL雙縮脲試劑,充分振蕩均勻,置于室溫下反應(yīng)30 min。然后,將試樣置于比色皿中用分光光度計(jì)在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.2.4 游離氨基酸含量的測(cè)定 取上清液(1.2.2)2 mL于離心管中,加入2 mL 0.02 mol/L鹽酸,10000 r/min離心10 min,取上清液定容至10 mL用0.45 μm濾膜過(guò)濾,移取5 μL濾液采用安捷倫公司自動(dòng)在線衍生化方法,一級(jí)氨基酸與鄰苯二甲醛、二級(jí)氨基酸與芴甲氧羰酰氯衍生后,采用高效液相色譜測(cè)定樣品[13]。色譜條件:色譜柱為ZORBAX Eclipse AAA(4.6×150 mm,3.5 μm);紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為338 nm,熒光檢測(cè)信號(hào)為(激發(fā)波長(zhǎng)266 nm,發(fā)射波長(zhǎng)305 nm);流動(dòng)相A為40 mmol/L磷酸二氫鈉(pH7.8);流動(dòng)相B為乙腈/甲醇/水=45/45/10;流速為1 mL/min;洗脫程序:0～31 min,0% B;31～33 min,54% B;33～41 min,100% B;41～43 min,0% B;流速為1 mL/min。取17種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸混合樣品,每種最終濃度為0.25 μmol/mL,在同樣條件下進(jìn)樣,將得到的每種氨基酸的峰面積對(duì)濃度作圖繪制17種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線,采用峰面積外標(biāo)法進(jìn)行定量。

1.2.5 SDS-PAGE蛋白電泳 取一定量的上清液(1.2.2)于真空冷凍干燥(絕對(duì)壓力85 Pa,升華溫度20 ℃)下干燥32 h,干燥所得樣品用蒸餾水稀釋10倍,添加等體積處理液(2% SDS、8 mol/L尿素、2%巰基乙醇)勻漿后100 ℃加熱5 min,室溫下在10000 r/min下離心15 min,上清液為上樣樣品。采用5%濃縮膠和12%分離膠,上樣量為10 μL。在穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀上進(jìn)行電泳,調(diào)節(jié)電流,濃縮膠中為15 mA,分離膠為20 mA。當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)凝膠底部時(shí)停止電泳[14]。

1.2.6 抗氧化能力的測(cè)定

1.2.6.1 DPPH·清除率測(cè)定 參照文獻(xiàn)[15]中的方法并略做改進(jìn)。取1 mL上清液(1.2.2)加1 mL濃度為0.2 mmol/L的DPPH,室溫下靜置30 min后,在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度變化。

DPPH·清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100

式中:Ai為1 mL的DPPH+l mL樣品的吸光度;Aj為1 mL溶劑+1 mL樣品的吸光度;A0為1 mL DPPH+1 mL溶劑的吸光度。

1.2.6.2 ABTS+·清除率的測(cè)定 參照胥莉等[16]的方法并稍作修改。將7 mmol/L的ABTS溶液10 mL和7.35 mmol/L的K2S2O8溶液5 mL混合后,在室溫下避光放置12～16 h,形成ABTS儲(chǔ)備液,使用前用無(wú)水乙醇稀釋成ABTS工作液,使其在734 nm波長(zhǎng)處的吸光度為0.70±0.02。吸取50 μL上清液(1.2.2)與ABTS工作液3 mL混合均勻,室溫反應(yīng)10 min后,于734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度(A樣品),空白組以水代替樣品(A空白)。按下式計(jì)算ABTS+·清除率:

ABTS+·清除率(%)=(1-A樣品/A空白)×100

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用Excel軟件進(jìn)行初步分析,并用Origin 8.5軟件作圖,采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行相關(guān)處理和分析,其中,顯著性分析采用t-檢驗(yàn),P>0.05說(shuō)明無(wú)顯著性差異,P<0.05說(shuō)明差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同熬煮時(shí)間對(duì)泥鰍湯可溶性蛋白含量的影響

熬煮過(guò)程中部分可溶性蛋白質(zhì)會(huì)溶于湯汁,且湯汁中的可溶性蛋白與肉湯的感官品質(zhì)具有正相關(guān)關(guān)系[17]。圖1為不同熬煮時(shí)間對(duì)泥鰍湯的可溶性蛋白含量的影響。由圖1可知,在熬煮過(guò)程中,熬煮30～150 min,湯中可溶性蛋白質(zhì)含量顯著(P<0.05)上升,在30～90 min期間上升速率較為相近,在90 min后上升速率有所提高,到150 min時(shí)可溶性蛋白質(zhì)含量達(dá)到18.49 mg/mL。這與倪冬冬等[9]研究大鯢湯加工過(guò)程中蛋白質(zhì)溶出趨勢(shì)一致。

圖1 不同熬煮時(shí)間對(duì)泥鰍湯的可溶性蛋白含量的影響Fig.1 Effect of different boiling time on soluble protein content of loach soup注:不同小寫(xiě)表示差異顯著(P<0.05);圖3同。

2.2 不同熬煮時(shí)間對(duì)泥鰍湯蛋白組分的影響

不同熬煮時(shí)間泥鰍湯蛋白SDS-PAGE電泳圖如圖2所示。由圖2可知,隨著熬煮時(shí)間的延長(zhǎng),分子量>100 kDa蛋白條帶逐漸變淺,分子量為63～100 kDa的蛋白條帶逐漸增多和加深,說(shuō)明大分子蛋白在熬煮過(guò)程中發(fā)生降解,隨著熬煮時(shí)間的延長(zhǎng),蛋白質(zhì)降解程度不斷加深。在湯的熬煮過(guò)程中,肌肉纖維束開(kāi)始破裂,肌肉纖維中的蛋白質(zhì)在熱的作用下開(kāi)始降解,水解成不同大小的短肽以及相應(yīng)的游離氨基酸[18]。

表1 臺(tái)灣泥鰍湯的游離氨基酸含量Tabla 1 Free amino acids contents of in loach soup

圖2 不同熬煮時(shí)間泥鰍湯的SDS-PAGE蛋白電泳圖Fig.2 SDS-PAGE electrophoresis of loach soup with different boiling time

2.3 不同熬煮時(shí)間對(duì)泥鰍湯游離氨基酸含量的影響

湯中的游離氨基酸有助于形成肉湯的鮮美滋味,提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[19]。由表1可得,泥鰍湯中共檢測(cè)到17種氨基酸,總游離氨基酸(TAA)含量隨熬煮時(shí)間呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì),在90 min時(shí)TAA達(dá)到最大值2957.20 μg/mL,隨后急劇下降。在90 min時(shí)泥鰍湯中半胱氨酸(22.5%)、甘氨酸(19.0%)、丙氨酸(11.6%)和谷氨酸(9.6%)含量較高,其次為組氨酸、賴氨酸、脯氨酸以及亮氨酸,絲氨酸含量最少。其中,谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸等氨基酸具有不同程度的甜味和鮮味,還有呈苦味的組氨酸等,這些豐富的氨基酸賦予了泥鰍湯醇厚而鮮美的滋味[13]。在90 min之后,泥鰍湯中TAA急劇下降,這可能是因?yàn)槟圉q湯在熬煮過(guò)程中,肌肉中蛋白質(zhì)受熱降解成大小不同的小肽或者相應(yīng)的游離氨基酸,通過(guò)物質(zhì)交換溶出到湯汁中,當(dāng)熬煮至一定時(shí)間,氨基酸會(huì)降解成肌苷酸和各類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),這影響了氨基酸在泥鰍湯中的含量,同時(shí)肌肉中的纖維組織經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間熬煮會(huì)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)吸附湯中的游離氨基酸[20-22]。動(dòng)物肌肉細(xì)胞中含有多糖,在熱的作用下可水解生成單糖、雙糖和低聚糖[16],與湯中的游離氨基酸產(chǎn)生美拉德反應(yīng),這可能也是造成游離氨基酸含量降低的原因之一。

從必需氨基酸總量(EAA)分析比較,在90 min時(shí)泥鰍湯中必需氨基酸含有纈氨酸、蛋氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸,較其他組種類齊全且含量最高,為664.3 μg/mL。從鮮味氨基酸含量(UAA)分析比較,隨著熬煮時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。在90 min時(shí)含量最高,達(dá)到1296.7 μg/mL,遠(yuǎn)高于其他組;其中甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸是泥鰍湯中主要的鮮味氨基酸,略不同于倪冬冬等[9]測(cè)得大鯢湯中主要鮮味氨基酸(丙氨酸、精氨酸、谷氨酸)的種類。

綜上,在熬煮時(shí)間達(dá)到90 min時(shí),泥鰍湯中游離氨基酸含量較高且必需氨基酸種類豐富,此時(shí)的鮮味氨基酸含量高,泥鰍湯醇厚鮮美。

2.4 不同熬煮時(shí)間對(duì)泥鰍湯抗氧化能力的影響

由圖3可知,隨著熬煮時(shí)間的增加,ABTS+·清除率逐漸上升,這可能是泥鰍在加熱過(guò)程中蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生多肽和游離氨基酸,極性基團(tuán)數(shù)量增多,導(dǎo)致親水性增強(qiáng),使其更容易與水溶性的ABTS+·發(fā)生作用,同時(shí)泥鰍多肽具有清除ABTS+·的能力[23]。在30～120 min時(shí),ABTS+·清除率顯著(P<0.05)上升,從18.01%升至43.61%,熬煮到120 min時(shí),ABTS+·清除率為43.29%,隨后略有下降。由于加熱烹飪會(huì)影響肉類蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu),使粗肽中更多的疏水性基團(tuán)位點(diǎn)暴露,導(dǎo)致疏水性提高,使其更容易與水溶性的ABTS+·發(fā)生作用[24]。因此，ABTS+·清除率升高。

圖3 不同熬煮時(shí)間對(duì)泥鰍湯ABTS+·和DPPH·清除率的影響Fig.3 Effect of different boiling time on ABTS+·and DPPH· scavenging rate of loach soup

泥鰍湯表現(xiàn)出較高的DPPH·清除能力,在熬煮時(shí)間30～90 min范圍內(nèi),清除率顯著(P<0.05)上升,從11.66%上升到84.10%,隨熬煮時(shí)間延長(zhǎng),泥鰍中的脂肪溶出,湯中脂肪含量增加,使其容易捕獲脂溶性的DPPH·,同時(shí)肌肉中多糖在熬煮過(guò)程中不斷的溶出,而泥鰍中的多糖又具有清除DPPH·的作用[25];在90～120 min時(shí)DPPH·清除率趨于平穩(wěn)(84.10%～87.25%),這可能是由于多糖降解的影響;在50 min時(shí)清除率上升至93.23%,DPPH·清除率升高是由于長(zhǎng)時(shí)間的熬煮,某些游離氨基酸降解成一些殘基,比如親核側(cè)鏈的Cys殘基等,這些物質(zhì)可以阻斷自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[24]。

3 結(jié)論

在泥鰍湯的熬煮過(guò)程中,熬煮時(shí)間對(duì)泥鰍湯的營(yíng)養(yǎng)成分和抗氧化活性產(chǎn)生了很大的影響。隨熬煮時(shí)間的延長(zhǎng),湯中可溶性蛋白質(zhì)含量顯著上升,在150 min達(dá)到18.49 mg/mL;SDS-PAGE蛋白電泳顯示,隨著熬煮時(shí)間的延長(zhǎng),大分子蛋白質(zhì)發(fā)生降解產(chǎn)生多肽和氨基酸,在90 min湯中游離氨基酸含量最高達(dá)到2957.20 μg/mL,鮮味氨基酸含量高達(dá)到1296.70 μg/mL,湯汁口感鮮美。在抗氧化性方面,隨著熬煮時(shí)間的增加,湯中ABTS+·清除率和DPPH·的清除率整體呈上升趨勢(shì)。綜上,在烹飪臺(tái)灣泥鰍湯時(shí),熬煮90 min較為合理,此時(shí)臺(tái)灣泥鰍湯的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)較好,且抗氧化能性強(qiáng)。