1,

(1.青海大學(xué)省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,青海西寧 810016;2.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院,青海西寧 810016;3.中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所,青海西寧 810001;4.中國(guó)科學(xué)院大學(xué),北京 100049)

直穗小檗(BerberisdasystachyaMaxim.)、沙棘(HippophaerhamnoidesL.)和唐古特白刺(NitrariatangutorumBobr.)的果實(shí)泛稱(chēng)“三刺”果。在西北地區(qū),蒙、藏、維吾爾等少數(shù)民族將其作為藥用與食用的傳統(tǒng)野生漿果,因其為低矮灌木,且具刺,因此統(tǒng)稱(chēng)為“青海三刺”。直穗小檗果實(shí)作為高原特色漿果植物資源,天然無(wú)毒,具有多種活性物質(zhì)[1-2],20世紀(jì)80年代,已有添加小檗果汁的青海三刺飲料問(wèn)世[1]。而直穗小檗果在降血脂、降血糖方面的作用和應(yīng)用還未見(jiàn)報(bào)道。

糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)是一種由多種病因引起的以慢性高血糖為主要特征的代謝紊亂綜合癥。研究證明,Ⅰ型糖尿病是完全的胰島素依賴(lài)性疾病,是由胰島素分泌胰島β細(xì)胞的免疫相關(guān)破壞造成的疾病,通常導(dǎo)致高血糖癥,高脂血癥,和其他糖尿病并發(fā)癥[3]。近年來(lái),糖尿病調(diào)節(jié)治療方面取得了很大的進(jìn)展,目前糖尿病藥物主要包括胰島素療法、口服降糖治療和氧化應(yīng)激相關(guān)的補(bǔ)充劑治療[4]。同時(shí),還有西藥及合成藥,如α-糖苷酶抑制劑類(lèi)、磺脲類(lèi)和雙胍類(lèi)等化學(xué)藥物直接作用于胰島細(xì)胞或者改善胰島素敏感性間接作用[5]。化學(xué)藥物降糖效果顯著、針對(duì)性強(qiáng)、降糖機(jī)制比較明確,但在降糖的同時(shí)也帶來(lái)許多副作用,特別是對(duì)糖尿病并發(fā)癥的治療收效甚微。針對(duì)這一現(xiàn)象,采用天然藥物制備具低副作用的降血脂、降血糖的藥物尤為迫切,因此,開(kāi)發(fā)具有良好降脂降糖作用的天然藥物產(chǎn)品將具有良好的應(yīng)用前景[6]。

本論文采用鏈脲酶素(STZ)誘導(dǎo)的Ⅰ型糖尿病大鼠,對(duì)直穗小檗果粉調(diào)節(jié)糖尿病大鼠血糖和血脂功能進(jìn)行研究,并初步探討其調(diào)節(jié)的作用機(jī)制,以期為研發(fā)干預(yù)糖尿病的功能性食品及青海地區(qū)直穗小檗的綜合開(kāi)發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

四周齡雄性SD大鼠(8～9周,160～180 g) 甘肅大學(xué),中國(guó)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)買(mǎi)(動(dòng)物合格證號(hào):SYXK(甘)2011-0001),于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)將大鼠單獨(dú)飼養(yǎng)在鼠籠中,按照光照12 h及黑暗12 h的飼養(yǎng)周期,在溫度(22±1) ℃,濕度42%±2%條件下飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn),大鼠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,以標(biāo)準(zhǔn)嚙齒動(dòng)物供給所需食物和蒸餾水,所有的動(dòng)物方案在“National Institute of Health Guide”指導(dǎo)下進(jìn)行;直穗小檗鮮果 產(chǎn)自青海互助;鏈脲酶素(Streptozotocin,STZ) 北京中生瑞泰科技有限公司;格列本脲片 同仁堂大藥房;甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL)、極低密度脂蛋白膽固醇(VLDL)、超氧陰離子試劑盒、羥自由基試劑盒、谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、脂蛋白酯酶(LPL)、肝酯酶(HL)試劑盒、丙二醛(MDA)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、還原型谷胱甘肽(GSH-Px)試劑盒 南京建成生物科技有限公司。

DZX6020真空干燥箱 上海南榮儀器公司;UV-722N可見(jiàn)紫外分光光度計(jì) 上海尼柯有限公司;HD型恒溫水浴鍋 遼陽(yáng)市恒溫儀器廠;血糖測(cè)試儀及血糖試紙三諾 天士力大藥房;Bio-Rad680型酶標(biāo)儀 美國(guó)伯樂(lè)公司;DS-1型組織勻漿儀 上海正慧工貿(mào)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 直穗小檗果粉的制備 直穗小檗鮮果于55 ℃,真空干燥6 h。然后直穗小檗果實(shí)去籽,用超微粉碎機(jī)粉碎(2000 r/min,1～2 s)后過(guò)80目篩網(wǎng),即得直穗小檗果粉(BDF)。

1.2.2 Ⅰ型糖尿病大鼠模型的建立 大鼠禁食12 h后采用低劑量的鏈脲酶素(STZ)誘導(dǎo)[7]。將STZ溶解于新鮮的檸檬酸鈉緩沖液(0.1 mol/L的檸檬酸鈉和0.1 mol/L檸檬酸,pH4.2～4.5),后立即以60 mg/kg的單次劑量對(duì)大鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射進(jìn)行造模。正常對(duì)照大鼠用等體積的檸檬酸鈉緩沖液注射。在造模期間,給予大鼠5%葡萄糖溶液過(guò)夜以克服藥物誘導(dǎo)而造成的低血糖期。于STZ或檸檬酸緩沖液注射試驗(yàn)72 h后測(cè)定血糖:從大鼠的尾尖端收集血液,用血糖試紙檢測(cè)血液中的葡萄糖,血糖值大于16.80 mmol/L的大鼠被選定為Ⅰ型糖尿病模型大鼠。

藥物治療模型大鼠四周,末次給予受試物后,使用腹腔注射水合氯醛溶液對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉,麻醉后采用頸總動(dòng)脈插管收集血液。采血后的血樣在室溫下靜止2 h后,經(jīng)離心(3000 r/min,10 min),得到血清,并在-80 ℃冷凍直至分析。取血完畢后,將大鼠的肝臟、腎臟以及脾臟剝離出后,用磷酸鹽緩沖鹽水漂洗(PBS,pH=7.4)后,濾紙吸去多余液體并-80 ℃冷凍直至分析。同時(shí),在每塊器官的同一部位切去一小塊組織,投入10%福爾馬林溶液中固定。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組及灌胃情況 空白組和模型組每天灌胃給予超純水;陽(yáng)性藥組每天灌胃給予格列本脲1次(0.02 g/kg);受試藥物組每天灌胃給予直穗小檗果粉1次(低劑量組0.4 g/kg,高劑量組1.6 g/kg),五組均連續(xù)灌胃給藥28 d(詳細(xì)給藥濃度見(jiàn)表1):

表1 大鼠的分組情況及各組給藥量Table 1 The group situation and given amount of medical for each group

1.2.4 各實(shí)驗(yàn)組大鼠健康狀況及體重的統(tǒng)計(jì) 在試驗(yàn)期間,每周[即-7(造模前7 d)、0、7、14、21、28 d]觀察大鼠的健康狀況,包括飲水量、飲食量、毛色以及脫毛與否、排尿量(墊料干燥程度)、精神狀態(tài)等方面的觀察。

在試驗(yàn)期間,每周(即-7、0、7、14、21、28 d),稱(chēng)各組大鼠的體重。

1.2.5 血糖相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定 末次給藥灌胃結(jié)束后禁食過(guò)夜,從大鼠的尾靜脈獲得用于葡萄糖測(cè)定血樣。血糖的測(cè)定采用血糖儀和血糖試紙進(jìn)行測(cè)量。血清胰島素水平通過(guò)使用胰島素ELISA試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

肝臟、肌肉勻漿在冰冷的培養(yǎng)基中通過(guò)組織均質(zhì)化制備(pH為7.4,10 mmol/L的Tris-HCl,0.1 mmol/L的EDTA-2Na,10 mmol/L蔗糖,0.8% NaCl),并在4 ℃下3000 r/min離心10 min后收集上清液?；贙eppler的方法[8]使用糖原測(cè)定試劑盒測(cè)定肝臟、肌肉中的糖原含量。

1.2.6 血脂相關(guān)指標(biāo)及脂代謝酶活性的測(cè)定 血清血脂包括甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)采用試劑盒測(cè)定。極低密度脂蛋白(VLDL)是根據(jù)Wilson等[9]的方法計(jì)算(式1)。

VLDL=0.2×TG

式(1)

肝臟勻漿在冰冷的培養(yǎng)基中通過(guò)組織均質(zhì)化制備,并在4 ℃下3000 r/min離心10 min后收集上清液,上清液制備好后用于測(cè)定肝臟標(biāo)志酶和脂質(zhì)代謝酶。肝臟標(biāo)志酶谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT),兩種脂質(zhì)代謝酶即脂蛋白酯酶(LPL)和肝酯酶(HL)含量分別采用試劑盒測(cè)定。

1.2.7 體內(nèi)抗氧化活性的測(cè)定 胰腺勻漿在冰冷的培養(yǎng)基中通過(guò)組織均質(zhì)化制備,并在4 ℃下3000 r/min離心10 min后收集上清液。制備所得胰腺上清液和血清用于體內(nèi)抗氧化活性酶活性測(cè)定。蛋白質(zhì)濃度根據(jù)Bradford[10]的方法測(cè)定,并以牛血清白蛋白(BAS)為標(biāo)準(zhǔn)。脂質(zhì)過(guò)氧化采用Armstrong等[11]報(bào)道方法,采用Zhang等[12]所述的方法測(cè)量過(guò)氧化氫酶(CAT)的活性。超氧化物歧化酶(SOD)活性通過(guò)Marklund所報(bào)道的方法[13]。還原型谷胱甘肽酶(GSH-Px)的活性參照Lawrence等[14]的方法。

1.2.8 病理組織切片 取出已固定的胰腺組織,切取合適厚度的組織。經(jīng)過(guò)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、貼片與烤片、脫蠟及水化、染色、脫水、透明和封片的操作過(guò)程制得石蠟切片,晾干后即可觀察切片。

1.3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 各動(dòng)物分組試驗(yàn)期間的健康狀況

實(shí)驗(yàn)期間,各試驗(yàn)組大鼠的健康狀況記錄見(jiàn)表2?？瞻捉M大鼠攝食和飲水均屬正常水平,毛色光亮,糞便顏色和量正常,墊料干燥,精神狀態(tài)活潑健康。模型組大鼠體毛色發(fā)黃,暗淡,且脫毛現(xiàn)象嚴(yán)重,多尿,飲水量和飲食量較大,墊料潮濕帶有酸澀味,精神萎靡,體質(zhì)虛弱,易怒較為暴躁,實(shí)驗(yàn)期間有個(gè)別老鼠死亡。陽(yáng)性藥組大鼠較正常大鼠毛色發(fā)黃,較模型組少脫毛,多尿,飲水量和飲食量大,墊料較模型組干燥,精神不活潑。直穗小檗果粉樣品組:兩劑量組大鼠毛色部分發(fā)黃,脫毛輕,多尿,飲水量和飲食量大較模型組明顯減輕,精神活潑,有追逐現(xiàn)象發(fā)生。

2.2 各動(dòng)物分組試驗(yàn)期間體重變化

表2 各動(dòng)物分組試驗(yàn)期間的健康狀況Table 2 The health condition of each group

表3 直穗小檗果粉對(duì)Ⅰ型糖尿病大鼠體重的影響Table 3 Effect of fruit of Berberis dasystachya M.on the body weight of TypeⅠdiabetic

表4 直穗小檗果粉對(duì)Ⅰ型糖尿病大鼠血糖的影響Table 4 Effect of fruit of Berberis dasystachya M.on the blood glucose of TypeⅠdiabetic

實(shí)驗(yàn)期間,各試驗(yàn)組大鼠在給藥-7、0、7、14、21、28 d的體重記錄見(jiàn)表3。由表3可知,模型組體重在實(shí)驗(yàn)期間明顯下降,這與Ⅰ型糖尿病的發(fā)病患者表現(xiàn)出的典型癥狀一致(即體重迅速下降)。與模型組相比,從第7 d開(kāi)始直穗小檗劑量組體重均極顯著(P<0.01)上升。給藥最后一天(28 d),相比模型組糖尿病大鼠的體重,不同劑量(0.4、1.6 g/kg)的果粉給藥大鼠體重分別可增幅16.29%和27.02%。此外直穗小檗果粉對(duì)糖尿病大鼠體重急劇下降的改善隨劑量的增加而增強(qiáng),其中,陽(yáng)性組大鼠的體重與模型組相比有極顯著性差異(P<0.01),直穗小檗劑量組大鼠的體重與模型組相比有極顯著性差異(P<0.01)。以上體重結(jié)果說(shuō)明直穗小檗果粉能顯著緩解Ⅰ型糖尿病所致的體重下降。

2.3 直穗小檗果粉對(duì)Ⅰ型糖尿病血糖的影響

實(shí)驗(yàn)期間,各試驗(yàn)組大鼠在給藥-7、0、7、14、21、28 d的血糖記錄見(jiàn)表4。如表4所示,健康正常大鼠的血糖水平在5.00 mmol/L左右保持穩(wěn)定,由于低濃度鏈脲酶素STZ直接損傷胰島細(xì)胞,導(dǎo)致了Ⅰ型糖尿病,因此造模后,各組造模大鼠的空腹血糖(FBG)與正常大鼠相比均極顯著升高(P<0.01)。在給藥最后一天(第28 d),低劑量和高劑量果粉組血糖相比模型組分別降低25.17%和26.93%,各給藥組大鼠的血糖與模型組相比均極顯著下降(P<0.01),且直穗小檗果粉的降血糖作用隨劑量的增加而增強(qiáng)。采用直穗小檗果粉對(duì)模型組大鼠進(jìn)行治療后,血糖水平的顯著增加在治療階段具有劑量依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性。因此,直穗小檗果粉可顯著緩解由STZ誘導(dǎo)的高血糖癥狀,其高劑量組的治療效果與陽(yáng)性藥格列本脲片相當(dāng)。

2.4 直穗小檗果粉對(duì)Ⅰ型糖尿病胰島素水平的影響

圖1展示了各試驗(yàn)組大鼠在給藥28 d后血清中胰島素的水平。STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠相比健康正常大鼠,血清胰島素水平極顯著降低(P<0.01)。如圖1所示,相比模型組,不同劑量的直穗小檗果粉和格列本脲給藥組,均可極顯著增加糖尿病大鼠血清胰島素水平(P<0.01)。此外,與模型組相比,果粉高劑量組可顯著增加糖尿病大鼠血清胰島素水平1.047倍。胰島素檢測(cè)結(jié)果表明,直穗小檗果粉能顯著緩解Ⅰ型糖尿病所致的胰島素分泌功能障礙的情況,但其緩解的原因有待進(jìn)一步明確。

圖1 直穗小檗果粉對(duì)Ⅰ型糖尿病大鼠胰島素水平的影響Fig.1 Effect of fruit of Berberis dasystachya M.on the iInsulin level in Type Ⅰ diabetic rats注:NC:空白組;MC:模型組;PC:陽(yáng)性藥組;BDF-L:直穗小檗果粉低劑量組;BDF-H:直穗小檗果粉高劑量組;# P<0.05,##P<0.01與正常組比較;*P<0.05,**P<0.01與模型組比較。圖2～圖4同。

2.5 直穗小檗果粉對(duì)Ⅰ型糖尿病大鼠肝糖原和肌糖原的影響

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了直穗小檗果粉在抗高血糖過(guò)程中,是否參與肝糖原和肌糖原合成,試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。在STZ誘導(dǎo)的Ⅰ型糖尿病大鼠中(模型組),相比空白組大鼠其肝糖原和肌糖原水平均極顯著減少(P<0.01)。直穗小檗果粉高劑量組與模型組相比,可極顯著的提高肝糖原含量1.03倍;格列苯脲組與模型組相比,可極顯著地提高肌糖原含量0.35倍。直穗小檗果粉和格列苯脲的治療后結(jié)果表明,二者均可改善糖的代謝控制,因此促進(jìn)了更高效的能量代謝。然而,直穗小檗果粉參與糖原合成以維持穩(wěn)定的血糖水平的細(xì)胞機(jī)制,需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)得出明確的結(jié)論。

表5 直穗小檗果粉對(duì)STZ誘導(dǎo)的大鼠的血脂指標(biāo)的影響Table 5 Effect of fruit of Berberis dasystachya M.on theserumlipid in Type Ⅰ diabetic

圖2 直穗小檗果粉對(duì)Ⅰ型糖尿病大鼠肝糖原(A)和肌糖原(B)水平的影響Fig.2 Effect of fruit of Berberis dasystachya M.on the level of hepatic and muscle glycogen of Type Ⅰ diabetic rats

2.6 直穗小檗果粉對(duì)Ⅰ型糖尿病血脂及脂代謝的影響

STZ誘導(dǎo)的糖尿病,會(huì)使得大鼠胰島細(xì)胞發(fā)生核固縮和玻璃樣病變。其脂代謝隨之發(fā)生紊亂。同時(shí)大鼠的脂代謝發(fā)生紊亂,相關(guān)血脂指標(biāo)及脂代謝相關(guān)的酶活性亦發(fā)生紊亂。脂蛋白代謝異?？梢鸶鞣N低血糖癥或高血脂癥。由于脂質(zhì)水平升高,導(dǎo)致糖尿病與冠狀動(dòng)脈、心臟疾病、過(guò)早動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)增加[15]。血清TC、TG含量是高血脂癥的重要指標(biāo),HDL能轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇,其中載脂蛋白又能激活卵磷脂-膽固醇轉(zhuǎn)脂?；?催化卵磷脂分子中β位脂肪?；c膽固醇作用生成膽固醇酯,使TC和TG含量降低,所以HDL是高血脂癥的輔助標(biāo)志。同時(shí),研究發(fā)現(xiàn),相比于正常對(duì)照大鼠或小鼠,STZ誘導(dǎo)的Ⅰ型糖尿病大鼠或小鼠TG,TC和LDL水平顯著增加,HDL水平顯著下降[15-17]。表5結(jié)果顯示空白健康大鼠、模型組大鼠和給藥組大鼠的四種血脂水平。

與模型組相比,當(dāng)用不同濃度的直穗小檗果粉的給藥處理糖尿病大鼠后,糖尿病大鼠的四項(xiàng)血脂水平均呈現(xiàn)明顯的改善。其中,果粉高劑量組相比模型組大鼠四項(xiàng)指標(biāo)TC、TG、LDL和VLDL分別降低41.17%、33.52%、57.30%、32.85%,HDL調(diào)節(jié)上升1.44倍。同時(shí),實(shí)驗(yàn)表明,直穗小檗果粉治療STZ誘導(dǎo)的Ⅰ型糖尿病大鼠后,高劑量組對(duì)其不同的血脂指標(biāo)的調(diào)節(jié)效果與格列本脲的效果相當(dāng),而格列本脲作為化學(xué)合成的藥品,其對(duì)機(jī)體有一定的副作用,因此可采用天然植物即直穗小檗果粉可做替代保健品使用。

本研究中,直穗小檗果粉治療STZ誘導(dǎo)的Ⅰ型糖尿病大鼠28 d后,發(fā)現(xiàn)在脂質(zhì)代謝的相關(guān)指標(biāo)發(fā)生改變,即TC、TG、LDL相比STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠顯著衰減,并可增加糖尿病大鼠血清HDL的濃度。因此,直穗小檗果粉能夠減少動(dòng)脈粥樣硬化和其他心血管糖尿病并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)[18-20]。推測(cè)直穗小檗果粉降低血脂水平的作用機(jī)制可能有三種,其一,可能充當(dāng)載體參與膽固醇的代謝和加速傳輸和/或血清脂質(zhì)的排泄[21];其二,可能作為膽汁酸合成的促進(jìn)劑[22];其三,可能作為自由基清除劑,以防止LDL形成氧化的LDL[18]。然而,直穗小檗果粉影響脂質(zhì)代謝的機(jī)制在尚未明確,需要進(jìn)一步研究。

2.7 直穗小檗果粉對(duì)Ⅰ型糖尿病脂代謝的影響

HL是由肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞合成的一種具有磷A1和甘油三酯水解酶活性,對(duì)血漿脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)有重要作用的胞外蛋白,HL活力異常與動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病有較高的相關(guān)性。LPL是脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、乳腺細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞等實(shí)質(zhì)細(xì)胞合成和分泌的一種糖蛋白[17-18]。LPL是脂蛋白代謝的關(guān)鍵酶,是水解富含甘油三酯蛋白中TG的關(guān)鍵酶[17]。LPL和HL可以分解TG并分解為甘油和游離脂肪酸(FFA),采用銅試劑測(cè)定其分解產(chǎn)生的游離脂肪酸就可以分別計(jì)算出HL和LPL的活性[19]。因此,LPL和HL酶活性的升高,意味著其脂代謝的增加以及脂蛋白含量的降低。AST和ALT是肝損傷或壞死重要標(biāo)志[19]。肝臟內(nèi)的AST與ALT含量在一些藥物的刺激下,其體內(nèi)肝組織受到脂肪細(xì)胞侵潤(rùn),影響相關(guān)肝細(xì)胞酶活性。一般情況下,格列本脲、辛伐他汀及其他化學(xué)藥物都會(huì)對(duì)肝組織有一定的影響。表6為空白大鼠、模型組大鼠及給藥組大鼠四種肝臟標(biāo)志酶的水平。

表6 直穗小檗果粉對(duì)STZ誘導(dǎo)的大鼠肝臟標(biāo)志酶的影響Table 6 Effect of fruit of Berberis dasystachya M.on liver markers in Type Ⅰ diabetic

由表6可知,與模型組大鼠相比,直穗小檗果粉能夠使患病大鼠的HL和LPL酶活性增加,LPL是清除富含TG脂蛋白的限速酶,從而發(fā)揮了其在脂蛋白循環(huán)中的重要作用。同時(shí)可使糖尿病大鼠的HL活性增加,通過(guò)HL作為配體,促進(jìn)肝細(xì)胞攝取膽固醇和乳糜微粒殘粒,降低血漿中總膽固醇和甘油三酯濃度,進(jìn)而達(dá)到調(diào)節(jié)機(jī)體脂代謝紊亂的作用。本研究表明,直穗小檗果粉治療STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠一段時(shí)間后,可顯著增強(qiáng)以上兩種關(guān)鍵酶的活性,從而調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝。

相比格列本脲陽(yáng)性藥組,直穗小檗果粉給藥組的AST和ALT活性均有不同程度的降低,說(shuō)明陽(yáng)性藥組即格列苯脲對(duì)肝臟具有損傷作用,而直穗小檗果粉對(duì)肝臟則損傷作用較小,直穗小檗果粉高劑量組相比陽(yáng)性藥組,其AST和ALT活性呈現(xiàn)極顯著的下降(P<0.01),表明直穗小檗果粉可減少肝損傷。直穗小檗果粉治療的糖尿病大鼠體內(nèi)兩個(gè)肝臟標(biāo)記酶活性的降低,可能是由于直穗小檗果粉表現(xiàn)出有效的抗氧化劑活性,衰減了肝臟內(nèi)的細(xì)胞損傷。

2.8 直穗小檗果粉對(duì)Ⅰ型糖尿病大鼠氧化應(yīng)激的影響

糖尿病導(dǎo)致升高的血糖和血脂濃度,與肝,腎和胰腺等組織中活性氧化物的形成相關(guān)聯(lián)[20]。Davi等也已經(jīng)證明胰島素抵抗的發(fā)生與系統(tǒng)性氧化應(yīng)激有關(guān)[18,21]。同時(shí),有研究表明使用抗氧化劑治療糖尿病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,可降低糖尿病的相關(guān)癥狀,推測(cè)可能減少了患病動(dòng)物體內(nèi)氧自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化物的水平[22]。動(dòng)物組織或血清內(nèi)MDA含量作為脂質(zhì)過(guò)氧化程度的標(biāo)志物,MDA含量的升高意味著組織內(nèi)或者體內(nèi)過(guò)氧化物損傷增加。CAT、SOD和GSH-Px是動(dòng)物體內(nèi)重要的氧化應(yīng)激防御酶,其活性的增加表明可減少體內(nèi)或組織內(nèi)的氧化損傷[23]。圖3為各試驗(yàn)組大鼠血清和胰腺中MDA含量的變化,圖4為各試驗(yàn)組大鼠血清和胰腺中CAT、SOD和GSH-Px酶活水平的變化。

圖3 直穗小檗果粉對(duì)Ⅰ型糖尿病大鼠血清(A)和胰腺(B)中丙二醛含量的影響Fig.3 Effects of fruit of Berberis dasystachya M.on MDA in serum(A)and pancreas tissue(B)of Type Ⅰ diabetic rats

圖4 直穗小檗果粉對(duì)Ⅰ型糖尿病大鼠血清(A,B,C)和胰腺(D,E,F)中CAT,SOD,GSH-Px含量的影響Fig.4 Effects of fruit of Berberis dasystachya M.on CAT,SOD and GSH-Px in serum(A,B,C)and pancreas tissue(D,E,F)of diabetic rats

直穗小檗果粉對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠血清和組織中的MDA、CAT、SOD和GSH-Px的含量及活性均有影響,結(jié)果如圖3和4所示,與模型組相比,直穗小檗果粉的不同劑量(0.4、1.6 g/kg)均可使MDA水平顯著降低,并且可升高糖尿病大鼠血清和組織內(nèi)CAT、SOD和GSH-Px的活性(P<0.05或P<0.01)。模型組的糖尿病大鼠血清和組織內(nèi)的MDA含量相對(duì)于正常對(duì)照大鼠分別升高了1.06倍和2.00倍。當(dāng)患糖尿病大鼠灌胃給予低劑量和高劑量直穗小檗果粉治療28 d后,胰腺組織中MDA水平分別減少64.04%和45.00%;血清中MDA水平分別減少56.65%和29.87%。

相比于空白組健康大鼠,模型組大鼠胰腺組織中的CAT、SOD和GSH-Px水平分別下降55.59%,58.04%和56.27%;模型組大鼠的血清中的CAT、SOD和GSH-Px的水平分別降低63.53%,60.23%和61.96%。同時(shí),相比模型組大鼠,發(fā)現(xiàn)在糖尿病大鼠血清中的CAT、SOD和GSH-Px酶活性,通過(guò)低劑量組直穗小檗果粉治療后分別增幅88.16%、17.52%和63.43%;通過(guò)高劑量組直穗小檗果粉治療后分別增加了1.46、1.36和1.45倍。相比模型組大鼠胰腺組織中的CAT、SOD和GSH-Px酶活性,通過(guò)低劑量組直穗小檗果粉治療可顯著提高三種氧化酶活性,可分別增加45.97%、45.02%和36.80%;通過(guò)高劑量組直穗小檗果粉治療后分別增加了1.22、1.21倍和1.30倍。

不同劑量直穗小檗果粉治療STZ誘導(dǎo)的Ⅰ型糖尿病大鼠28 d后,均可使糖尿病大鼠血清和組織的MDA水平顯著降低,并且可以升高糖尿病大鼠血清和胰腺組織內(nèi)CAT、SOD和GSH-Px的活性。以上結(jié)果表明,直穗小檗果粉可以減輕STZ誘導(dǎo)的Ⅰ型糖尿病大鼠胰腺及血清內(nèi)的氧化損傷,同時(shí),推測(cè)直穗小檗果粉通過(guò)改善糖尿病大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激程度的效應(yīng),進(jìn)而影響其糖代謝及脂代謝。

2.9 胰腺組織病理學(xué)觀察

圖5呈現(xiàn)了五個(gè)試驗(yàn)組大鼠的胰腺組織病理學(xué)切片。在正常大鼠體內(nèi),其胰腺的胰島內(nèi),大量的胰島β細(xì)胞以固定的形狀和形態(tài)、定期的、均勻地進(jìn)行排列(5A)。在糖尿病大鼠中,胰腺組織的由于受到低劑量的STZ的損傷,其胰島嚴(yán)重?fù)p害,包括出現(xiàn)有局灶性壞死和凋亡,組織收縮,β細(xì)胞溶解與β細(xì)胞數(shù)量的減少的現(xiàn)象(5B)。但是,此現(xiàn)象隨著格列本脲和直穗小檗果粉不同劑量的治療,發(fā)現(xiàn)以上病變明顯減少。不同劑量的直穗小檗果粉治療糖尿病大鼠后(5D和5E),可有效緩解了胰島架構(gòu)的損傷,并伴隨著胰腺β細(xì)胞數(shù)量增加。相對(duì)于陽(yáng)性對(duì)照組,其高劑量組的大鼠體內(nèi)胰島損傷有更明顯的改善。說(shuō)明直穗小檗果粉能一定程度地修復(fù)STZ對(duì)胰島造成的損傷,推測(cè)其損傷的修復(fù)可能與胰島細(xì)胞的氧化應(yīng)激有關(guān)。即直穗小檗果粉通過(guò)改善糖尿病大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激程度的效應(yīng),進(jìn)而可在一定程度上減輕胰島胰島β細(xì)胞的損傷及凋亡。

3 討論與結(jié)論

圖5 Ⅰ型糖尿病大鼠胰腺病理組織切片F(xiàn)ig.5 Histopathology examination of pancreas in diabetic rats(H&E stain)注:A為空白組;B為模型組;C為陽(yáng)性藥組;D為直穗小檗果粉低劑量組;E為直穗小檗果粉高劑量組。

目前糖尿病的化學(xué)誘導(dǎo)造模法通常使用四氧嘧啶和鏈脲酶素(STZ),兩種均是具毒性的誘導(dǎo)型化學(xué)合成試劑[24]。Rakieten等[25]首次報(bào)道,采用STZ致胰島β細(xì)胞損傷進(jìn)而導(dǎo)致糖尿病的模型。STZ,一種氨基葡萄糖-亞硝基脲,是一種DNA烷基化試劑,通常在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物糖尿病模型建立中作為一種高毒性的β細(xì)胞誘導(dǎo)劑[26]。天然的鏈脲佐菌素是由一種鏈球菌產(chǎn)生的抗生素,與葡萄糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)具有很高的相似度,以至于葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(GLUT2)會(huì)將其當(dāng)做葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞中,而胰島細(xì)胞內(nèi)含有大量的GLUT2。STZ進(jìn)入胰島細(xì)胞后通過(guò)DNA烷基化的方式損害DNA,對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性。對(duì)β細(xì)胞的DNA損傷將誘導(dǎo)ADP-核糖基化的活化,ATP去磷酸化反應(yīng)增強(qiáng),同時(shí),可導(dǎo)致超氧化物自由基和羥基自由基的形成[27]。胰島β細(xì)胞的凋亡機(jī)制可能以這樣的途徑進(jìn)行,因此,降低糖尿病患者體內(nèi)的自由基,提高氧化應(yīng)激能力可以作為一種有效的治療途徑,幫助減輕糖尿病并發(fā)癥。Junod等[28]報(bào)道,Wistar雄性大鼠腹腔注射STZ后,觀察到β細(xì)胞大量壞死,β細(xì)胞數(shù)量明顯減少。STZ所致的速發(fā)型糖尿病動(dòng)物模型,接近于人的Ⅰ型糖尿病。本研究對(duì)雄性SD大鼠采用低濃度、單劑量腹腔注射STZ的方法誘導(dǎo)Ⅰ型糖尿病模型的建立。目前關(guān)于低劑量鏈脲酶素誘導(dǎo)大鼠患Ⅰ型糖尿病的發(fā)病機(jī)制尚未研究清楚,推測(cè)其發(fā)病機(jī)制類(lèi)似于四氧嘧啶。

本研究通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠血液中的葡萄糖水平、體重和血清胰島素在服用直穗小檗果粉后均有所改善。通過(guò)直穗小檗果粉的治療,糖尿病大鼠體重高于模型組大鼠,推測(cè)其原因是增加脂肪儲(chǔ)存或減少脂肪分解。此外,高血糖的降低可能是由于果粉增加了患病大鼠胰島素的敏感性。直穗小檗果粉可改善糖的代謝控制,使糖尿病大鼠獲得更高效的能量代謝,以抵抗高血糖癥;其次,直穗小檗果粉參與了脂代謝的控制,并且對(duì)其關(guān)鍵酶具有一定的調(diào)節(jié)作用;同時(shí)對(duì)血清和組織中的氧化應(yīng)激酶以及MDA水平具有調(diào)節(jié)作用,推測(cè)其是改善胰島細(xì)胞損傷的主要機(jī)制之一。然而,直穗小檗果粉參糖代謝與脂代謝的控制,以及參與調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的細(xì)胞機(jī)制尚未明確,需要進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以得出明確的結(jié)論。