T淋巴細胞激活蛋白家族2對白細胞的調控作用

梁 卉 王 尊 莊學玲 熊禮寬

T淋巴細胞激活蛋白家族2基因(the linker for activator of T-cells family member 2, LAT2) 由Doyle等于2000年在人類和小鼠編碼Williams Beuren綜合征關鍵位點5蛋白(Williams Beuren syndrome critical region 5, WBSCR5)區(qū)域內發(fā)現(xiàn)，命名為WBSCR15。2002年Brdicka等利用體外激酶分析，在髓細胞鞘糖脂富集膜(glycophingolipid-enriched membrane, GEMs)蛋白區(qū)域蛋白中發(fā)現(xiàn)并命名為非T淋巴細胞激活蛋白(non-T-cell activator linker, NTAL)。2003年Janssen等成功克隆了WBSCR15序列，由于其在B淋巴細胞中表達和發(fā)揮作用，因此命名為B淋巴細胞激活蛋白(linker activator for B-cells, LAB)。2006年人類基因組命名委員會根據(jù)蛋白結構特點，將其命名為LAT2。

LAT2是一個跨膜轉接蛋白(transmembrane adaptor proteins, TRAPs)，具有多個酪氨酸磷酸化位點，在后續(xù)通路中發(fā)揮支架和信號傳遞功能。LAT2主要表達于髓樣細胞和淋巴樣細胞中，如肥大細胞、B淋巴細胞、自然殺傷細胞(natural killer cells, NKs)、嗜堿性粒細胞和單核細胞等。LAT2磷酸化后可直接或間接捕獲細胞質內信號分子，包括生長因子受體結合蛋白2(growth factor receptor-bound protein 2, GRB2)、非七激酶子同源物1(son of sevenless homolog 1, SOS1)、GRB2相關連接蛋白1(GRB2-associated binding protein 1, GAB1)、泛素連接蛋白(casitas B-lineage lymphoma, C-CBL)和Vav蛋白等，從而發(fā)揮其生物學效應。

一、LAT2基因克隆和表達

LAT2基因差異性表達：(1)與細胞狀態(tài)有關，活化后的T細胞、NK細胞和衰老細胞中，LAT2表達上調[2,3]。(2)在細胞成熟過程中呈動態(tài)改變，正常B淋巴細胞的成熟過程中，LAT2的表達量增加；正常T細胞成熟過程中，LAT2的表達量降低[1]。(3)髓系細胞分化過程中呈多元態(tài)勢，LAT2在髓系干細胞中低表達，向粒細胞、單核細胞和紅細胞分化時，LAT2的表達量先增加(第7天表達量最高)，隨后降低[4]。但另一項研究發(fā)現(xiàn)，LAT2的表達趨勢與分化方向有關，髓系細胞分化為單核細胞時，LAT2表達逐漸上調；而向粒細胞分化時，LAT2表達逐漸下降[1]。(4)不同類型白血病細胞的LAT2表達不同，單核系來源的急性髓細胞性白血病(acute myeloid leukemia，AML)細胞中，如AML-M4、AML-M4eo和AML-5，LAT2表達上調；而在粒系來源的AML細胞中，如M2和M3，LAT2表達下降；而當存在t(8,21)形成融合蛋白RUNX1/RUNX1T1時，LAT2不表達[1]。在急性淋巴細胞性白血病(acute lymphoblastic leukemia of childhood, ALL)原始細胞中也發(fā)現(xiàn)LAT2的表達量增加，兒童前體B-ALL細胞中LAT2 mRNA的表達量約為正常B淋巴細胞的4倍[1]。(5)LAT2表達量還與T-ALL對藥物的敏感度和疾病預后有關，LAT2高表達患者對潑尼松更敏感，而LAT2低表達患者對潑尼松不敏感。(6)LAT2表達水平還可用于腫瘤的生存期預測和預后評估，LAT2表達增高與星形膠質瘤、克羅恩病、卵巢癌、肺癌和乳腺癌的生存期和預后呈正相關[3]。

目前LAT2表達的調控機制尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，LAT2基因是AML/ETO的靶基因(與LAT2基因的內含子3區(qū)域結合)。當細胞中存在AML1/ETO時，LAT2表達明顯下降；敲除AML1/ETO后，LAT2表達上調，提示AML1/ETO可直接調控LAT2的表達[5]。免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)AML1/ETO與LAT2結合后，LAT2基因的活性組蛋白修飾降低，而非活性組蛋白修飾增加。特別是在LAT2轉錄結合區(qū)域上游的1.5kb處發(fā)現(xiàn)有非活化組蛋白的富集，以上均提示AML1/ETO與LAT2結合后，通過組蛋白表觀修飾來抑制LAT2的表達[5]。

二、LAT2蛋白結構和功能

LAT2相對分子質量為(25～30)kDa，為第Ⅲ類完整跨膜蛋白，具有典型的跨膜蛋白結構，包含短的胞外區(qū)(1～5)，含CxxC棕櫚化位點的跨膜區(qū)(6～26)和長的胞質區(qū)(27～243,圖1)。LAT2本身不具有催化活性，但可與細胞膜上的GEMs相關聯(lián)，其作為一個支架蛋白，募集具有SH2結構域的轉導分子加入受體信號復合物中(信號轉導小體)。

目前的研究發(fā)現(xiàn)LAT2包含3類重要位點，即棕櫚化位點、酪氨酸(tyrosine, Tyr)磷酸化位點和溶蛋白酶裂解位點(圖1)。

圖1 LAT2蛋白結構示意圖

LAT2蛋白包含243個氨基酸，具有胞外區(qū)(1～5)、跨膜區(qū)(6～26)和胞質區(qū)(27～243)。C25和C28是其棕櫚化位點，是該蛋白在脂筏上定位的重要結構。包含10個預測的酪氨酸磷酸化位點，其中Y136、Y193和Y233被證實磷酸化與其生物功能有關。D228為溶蛋白酶裂解位點，其裂解后LAT2的磷酸化水平大大下降，生物學功能也降低。

LAT2蛋白的棕櫚化位點位于第25和28個氨基酸(C25-V-R-C28)，在GEMs上的定位和支架形成過程中具有重要作用，是其發(fā)揮生物學功能的必要條件，也可通過競爭性占位發(fā)揮作用[6]。當給予烷化溶血磷脂(alkylphospholipid, APL)藥物時，由于APL可與細胞膜上的膽固醇結合，競爭性占位GEMs，使得LAT2的棕櫚化位點無法錨定在GEMs上，最終被蛋白酶水解[6]。LAT2的競爭性占位還體現(xiàn)在樹突狀細胞(dendritic cells, DCs)的抗感染反應中[7]。

LAT2在膜受體介導的信號轉導的啟動階段起著重要的作用，該過程依賴于胞質區(qū)的Y殘基磷酸化。LAT2的胞質區(qū)中共包含10個Y殘基位點(Y40、Y58、Y84、Y95、Y110、Y118、Y119、Y156、Y183和Y233)，生物信息預測發(fā)現(xiàn)Y95、Y118、Y119、Y156、Y183和Y233可能與胞質中的轉接蛋白Grb2的SH2區(qū)域結合，Y233個位點與LAT上的GADS SH2區(qū)域結合的位點同源。實驗研究發(fā)現(xiàn)，LAT2末梢的3個酪氨酸殘基(Y136、Y193和Y233)是其主要的功能域，當酪氨酸殘基突變?yōu)楸奖彼?phenylalanine, Phe)時，LAT2磷酸化程度，與Grb2的結合作用和Ca2+流通均發(fā)生降低(單獨突變時)或消失(任意2個位點突變或3個位點均突變時)[7]。

LAT2的磷酸化依賴于Src家族和c-kit。在293T細胞系中，Src激酶家族成員，如Lyn、Lck、ZAP-70和Sky均直接參與LAT2的磷酸。在B淋巴細胞中，Sky活化可磷酸化LAT2[5,8]。在肥大細胞中，F(xiàn)cεRI介導和SCF介導LAT2磷酸化分別由Src家族和c-kit調控，Lyn、Sky和Kit選擇性磷酸化不同的LAT酪氨酸殘基位點，但目前尚未有研究探討其差異細節(jié)[8]。

LAT2溶蛋白性裂解導致細胞內信號轉導的效率降低或終止，可能是細胞內信號轉導負調控的機制之一。Arbulo-Echevarria等[9]發(fā)現(xiàn)在Fas或十字孢堿(staurosporine)作用下，LAT2從D228處裂解為約22kDa蛋白，CD3刺激后，LAT2整體磷酸化水平、與Grb2的結合能力以及PLC-γ的磷酸化均下降，LAT2溶蛋白性裂解可降低或終止細胞內信號轉導。但截斷的LAT2不影響Erk的活性水平。因此，溶蛋白性裂解可能是活化T淋巴細胞中Fas促進細胞死亡和終止TCR介導信號轉導的機制。

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LAT2磷酸化與溶蛋白性裂解呈負相關。LAT2溶蛋白性裂解后，丟失了重要的磷酸化位點Y233，LAT2整體磷酸化水平明顯下降。過釩酸鈉可促進LAT2的磷酸化，通過預先加入過釩酸鈉可抑制Fas介導的LAT2裂解。此外，將D228附近的兩個磷酸化位點(S223和Y233)突變后，加入過釩酸鈉抑制裂解的作用消除，提示LAT2的磷酸化作用可抑制蛋白裂解作用?？赡艿臋C制是LAT2磷酸化導致蛋白結構發(fā)生改變，隔斷蛋白酶和裂解位點，此外，磷酸化后引入帶負電荷的磷酸鹽也可抑制裂解[9]。

三、LAT2在細胞中的作用

1.T淋巴細胞：T淋巴細胞分化成熟過程中，LAT2表達量逐漸降低，初始T細胞中LAT2不表達，活化后，LAT2表達[1，5]。LAT2-/-小鼠的T細胞正常成熟分化，但極度活躍，TCR刺激后，T淋巴細胞中的ARK活性，Ca2+的分泌和細胞因子的產生均增強。由于T細胞的過度活化，LAT2-/-小鼠極易發(fā)展為自身免疫性疾病[5]。當LAT2過表達時，ERK和AKT的活性降低，抑制T細胞的活性。綜上所述，LAT2在活化T淋巴細胞中的負調控作用可能是T細胞維持正常功能的機制之一。

LAT2在T淋巴細胞中的作用機制目前存在兩個假說。一是競爭性抑制LAT。LAT與LAT2基因的序列相似，編碼的蛋白質結構類似，被認為具有相同的進化起源，在細胞中呈現(xiàn)出相互補償?shù)谋磉_模式。在LAT2-/-小鼠的T淋巴細胞中，發(fā)現(xiàn)LAT的磷酸化水平增高，而在超表達LAT2的T淋巴細胞中，LAT的磷酸化水平降低。LAT2缺陷的T淋巴細胞膜脂筏(lipid rafts)上定位了更多的LAT，以上均提示LAT2和LAT在T淋巴細胞中表現(xiàn)為拮抗作用[5]。該假說部分解釋了LAT2的負調控機制，但無法解釋生理狀態(tài)下LAT2和LAT的相互作用。二是LAT2可能通過溶蛋白酶裂解作用抑制T淋巴細胞的活化。Arbulo-Echevarria等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在Fas或十字孢堿作用下，LAT2從D228處裂解為約22kDa的蛋白，裂解后的LAT2蛋白N端仍錨定在脂筏上，但是其整體的磷酸化水平，捕獲GRB2能力及PLC-γ的磷酸化水平均大幅度降低，進而抑制TCR介導的信號傳遞。但是截斷的LAT2蛋白可維持足夠的ERK的活性水平，促進了Fas介導的細胞死亡，進一步抑制了T淋巴細胞的活性和恢復T淋巴細胞的數(shù)量，防止T淋巴細胞過度活化。

2. B淋巴細胞：LAT2在B淋巴細胞整個生命周期中存在差異表達，未成熟的B淋巴細胞中表達較低，細胞成熟后LAT2表達上調，漿細胞中也表達。

LAT2不是B淋巴細胞發(fā)育過程中的關鍵蛋白，表現(xiàn)為LAT2單基因敲除(knock out, KO)小鼠中，僅發(fā)現(xiàn)邊緣帶B細胞數(shù)量減少，而其他類型B淋巴細胞發(fā)育并未受影響[3]。LAT2可能參與BCR介導的反應，包括Ca2+流通和BCR內吞作用。在LAT2 KO小鼠中，BCR刺激可導致Ca2+流通輕微增加，提示LAT2在B淋巴細胞中的負調控作用。但是在DT-40(成熟的雞B淋巴細胞系)細胞中，超表達LAT2導致pro-BCR誘導的Ca2+流通增加，突變后的LAT2不影響Ca2+流通，提示LAT2對B淋巴細胞的正調控作用。LAT2對B淋巴細胞中Ca2+流通的差異作用機制還不清楚，可能與誘導物(BCR或pro-BCR)的差異、B淋巴細胞來源以及細胞成熟程度不同有關。

LAT2參與BCR的內吞作用，Malhotra等[10]發(fā)現(xiàn)，BCR刺激B淋巴細胞后，LAB發(fā)生磷酸化。磷酸化后的LAT2分別與GRB2-dynamin(驅動蛋白)和Vav蛋白結合，形成dynamin-GRB2-LAT2-Vav復合物，該復合物中的Vav活化小分子GTPsaes Rac1/2，進而發(fā)揮BCR內吞作用和向T細胞遞呈抗原的作用。由于Vav和Rac是BCR內吞作用的關鍵蛋白，而LAT2缺陷的B淋巴細胞中BCR介導的Vav磷酸化和Rac活化減低，提示LAT2參與BCR的內吞作用。但是在LAT2 KO小鼠中，BCR的內吞作用有所減少，可能存在不包含LAT2的其他途徑或其他支架蛋白可替代LAT2的部分作用。

綜上所述，LAT2的缺陷會部分影響B(tài)CR的內吞作用，因此，LAT2缺陷的B淋巴細胞介導的體液免疫可能減少而非完全喪失。在LAT2 KO和野生型小鼠中，也未發(fā)觀察到B淋巴細胞對TNP-OVA的抗體反應性存在顯著性差異。

3.肥大細胞：不同來源和干預方式獲得的肥大細胞在受到免疫球蛋白E受體(immunoglobulin E receptor, FcεRI)刺激后，LAT2的調控方向不同。骨髓來源肥大細胞(bone marrow derived mast cells, BMMCs)中，LAT和LAT2均有表達，LAT單基因KO小鼠和LAT、LAT2雙基因KO小鼠的BMMCs對FcεRI刺激均表現(xiàn)為低反應性，但是，雙基因KO小鼠BMMCs的反應性更低，提示LAT缺陷時，LAT2正向調控FcεRI信號。此外，在LAT2 KO小鼠的BMMCs和人肥大細胞LAT2單基因敲減(knock down, KD)模型以及嗜堿性粒細胞性白血病細胞中發(fā)現(xiàn)脫顆粒作用受損，提示在LAT存在下，LAT2也正調控肥大細胞功能[11]。但在其他研究小組發(fā)現(xiàn)LAT2 KD小鼠的 BMMCs對FcRI刺激表現(xiàn)為高反應性：ERK活性增強，Ca2+流通增加，脫顆粒和細胞因子產生增加，Polakovicova等[11]在LAT2 KO和KD的BMMCs中均觀察到脫顆粒、Ca2+流通、趨藥性增強，以及LAT和ERK磷酸化增強和絲狀肌動蛋白解聚作用，提示LAT2負調控FcεRI信號。LAT2在肥大細胞中的相互矛盾的調節(jié)作用的機制還不清楚。有研究者認為，LAT2的負調控作用可能是通過競爭性抑制LAT來發(fā)揮的：在LAT2 KO的BMMCs中，存在抗原介導的PLC1、PI3K和ERK活性增強和Ca2+流通增強，同時，在這些細胞中，發(fā)現(xiàn)LAT的磷酸化增強。因此，這些高反應性表型體現(xiàn)的是LAT介導的反應的過度補償導致的異常信號。此外，LAT2與LAT競爭性結合細胞膜上的脂筏也可能是導致其負調控作用的可能機制。而LAT2在活化的肥大細胞中的正調控作用可能與磷酸化后的LAT2結合了相應信號分子有關。

LAT2抑制前列腺素E2(prostaglandin E2, PEG2)介導的肥大細胞趨化性。與FcεRI不同，PEG2并不誘導LAT2的磷酸化，但LAT2缺陷的肥大細胞對PEG2的趨化性增強。PEG2刺激LAT2-/-肥大細胞后，AKT磷酸化增強，并促進了磷脂酰激醇3，4，5-三磷酸的生成。LAT2-/-靜止型肥大細胞存在腫瘤侵襲性增加的特征，如ERM家族蛋白中抑制性蘇氨酸磷酸化和β1整合素活性增加。加入全長的LAT2后，可恢復LAT2-/-肥大細胞對PEG2的趨化功能[12]。

LAT2具有維持肥大細胞骨架的功能。與野生型BMMCs比較，在抗原刺激下，LAT2-/-BMMCs的纖維蛋白附著減少、絲狀肌動蛋白解聚作用增加和遷移性增加。該作用可能與GTPase Rho相關，LAT2對GTPase Rho活性具有正調控作用，當LAT2缺陷時，RhoA活性快速降低。而將LAT2轉導至LAT2缺陷的細胞中，纖維連接蛋白附著和肌動蛋白的反應性均增加。因此，LAT2通過Rho和Rho相關蛋白激酶(Rho-associated protein kinase, ROCK)在肥大細胞骨架的維持中發(fā)揮重要的作用，表現(xiàn)為正調控肌動蛋白的聚合作用和細胞附著，以及負調控趨藥性[13]。

4．粒細胞：LAT2在骨髓造血細胞中低表達，在造血細胞分化過程中，LAT2的表達發(fā)生改變[4]。Duque-Afonso等[1]在HL-60和NB4細胞系中發(fā)現(xiàn)，當使用全反式維甲酸誘導分化粒系細胞時，LAT2的表達下調，而當佛波酯誘導細胞系向單核細胞分化時，LAT2表達上調。健康人的CD34+骨髓細胞分離后，經體外細胞因子刺激誘導分化，LAT2表達先增高，在第7天(粒系/單核系)或第9天(紅系)最高，隨后降低[4]。此外，在髓細胞性白血病中，也存在LAT2表達異常。Duque-Afonso等[1]從不同F(xiàn)LATAB分型的急性白血病患者中分離的骨髓細胞中發(fā)現(xiàn)，LAT2在大多數(shù)原始白血病細胞中高表達，特別是在粒-單核細胞特性和淋巴細胞性白血病。以上均提示，LAT2可能參與髓細胞的成熟分化。

5．NK細胞：在LAT-/-和LAT-/-/LAT2-/-的小鼠中，NK細胞的數(shù)量增加和Ly49庫的抑制性受體表達改變，提示LAT和LAT2參與NK細胞的發(fā)育[14]。由于Ly49庫的改變與PLCγ的水平有關，而LAT和LAT2直接或間接與PLCγ相互作用，因此，LAT和LAT2可能通過PLCγ來參與Ly49庫的調控。LAT-/-NK細胞保留溶解靶細胞的能力，同時靶細胞中Fc受體介導的ADCC功能正常。而在IL-2活化的LAT-/-/LAT2-/-的NK細胞中，DAP12介導的細胞毒性和IFN-γ的產生均喪失，表明LAT2可能補償了LAT的功能。Whittaker等[14]發(fā)現(xiàn)NK細胞中至少存在ITAM-Sky-LAT2/LAT和ITAMZ-Zap70-LAT兩種信號框，LAT正調控NK1.1功能，而LAT2對NK細胞起到負調控作用。NK細胞在IL-12刺激下，LAT表達下降，LAT2表達上調，結合基因敲除的功能研究結果推測活化的NK細胞作用主要與LAT2相關。

6．樹突狀細胞(dendritic cells, DCs)：LAT2在DCs中表達，表達量略低于肥大細胞和巨噬細胞，參與DCs抗細菌和真菌感染的固有免疫應答。LAT2-/-缺陷小鼠中DCs的分化不受影響，但存在缺陷，表現(xiàn)為MHC Ⅱ類分子表達量下降。在LPS刺激下，LAT2-/-DCs中的ERK、JNK和p38活化增強，且LAT2-/-小鼠對LPS誘導的感染性休克呈高反應性，提示LAT2在DCs中負調控TLR4介導的信號的MAPK活性[7]。在其他細胞中，當細胞表面受體聚集后，LAT2磷酸化后參與細胞內因子的級聯(lián)反應來發(fā)揮作用，但是當LPS刺激后，并未觀察到DCs細胞中的LAT2磷酸化水平增加，同時，LAT2的5個酪氨酸磷酸化位點突變后，與野生型細胞中LPS介導的反應相似。上述實驗表明，在DCs中，LAT2可能通過其他途徑參與調控，可能與LAT2和其他分子在脂筏上的競爭性占位有關，需進一步研究證實[7]。在真菌感染過程中，磷酸化的LAT2通過抑制β-catenin向細胞核移動，進而促進IL12家族細胞因子的表達和IFN-γ的產生，來發(fā)揮抗真菌感染的免疫反應。LAT2-/-小鼠易被白色念珠菌感染，以及LAT2-/-DCs中的IL-12家族細胞因子表達下調，提示LAT2在清除真菌感染中發(fā)揮正調控作用[15]。

7.巨噬細胞：在單核細胞分化為巨噬細胞過程中，LAT表達下調而LAT2表達升高。與DCs相似，巨噬細胞中LAT2表達，而LAT不表達。研究發(fā)現(xiàn)，LAT2-/-巨噬細胞中，TREM-2介導的Erk1/2活性增強，Syk和c-CbL磷酸化水平增加，提示LAT2負調控TREM-2介導的Erk1/2活化，導致抗炎性反應增強。其可能的機制是LAT2被Syk磷酸化后，與Grb2結合，進而使Erk1/2活化，并招募c-Cbl。隨后c-Cbl下調鄰近的TREM-2信號，包括Syk的活化。

8．上皮細胞：LAT2在上皮細胞的炎性反應中正向調控ERK通路。當幽門螺旋桿菌(helicobacterpylori, HP)感染人結直腸癌細胞系HCA-7后，LAT2和淋巴細胞特異性絡氨酸蛋白激酶相互作用膜蛋白的磷酸化水平增加?；罨腖AT2通過Grb2的相互作用與c-Met-Grb2-Sos1蛋白復合物相互作用，Sos1活化Ras-Raf-1-MEK1/2-ERK通路，活化cPLA2?；罨腸PLA2生成氨基酸，參與炎性反應的啟動和傳播。

四、展 望

LAT2是一個跨膜轉接蛋白，主要存在于白細胞中。LAT2通過棕櫚化位點、磷酸化位點和溶蛋白裂解位點發(fā)揮作用。LAT2蛋白通過棕櫚化位點錨定在細胞膜表面，發(fā)揮占位和維持LAT2蛋白穩(wěn)定的作用。磷酸化位點是LAT2的主要功能位點，當細胞受到刺激后，Src家族和c-kit磷酸化介導LAT2磷酸化，并將信號傳遞給下游蛋白，發(fā)揮負調控作用和(或)正調控作用。LAT2的溶蛋白裂解導致細胞內信號轉導降低或終止，參與LAT2負調控作用。LAT2的功能研究主要集中于肥大細胞和淋巴細胞中，參與免疫反應。由于LAT和LAT2在結構上同源，在多種細胞中表達互補，且動態(tài)改變，因此，對于LAT2的功能研究，還要排除LAT的補償作用。目前對于LAT2的功能研究多使用LAT2-/-模型，無法體現(xiàn)生理狀態(tài)下LAT2的作用以及無法解釋LAT2在細胞膜上占位引起的生物學改變。

嚴重的先天性中性粒細胞減少癥(severe congenital neutropenia, SCN)是一種先天性骨髓衰竭疾病，遺傳因素為其主要致病因素。一些致病基因(如ELANE、GFI1、CSF3R、WAS和HAX1等)突變導致髓細胞成熟分化障礙，使得髓細胞處于幼稚階段。SCN具有急性髓細胞白血病的風險，被認為屬于白血病前期。已有報道發(fā)現(xiàn)LAT2參與白細胞的成熟分化，且在髓性白血病中發(fā)現(xiàn)LAT2的表達異常，同時筆者在一個SCN家系中發(fā)現(xiàn)LAT2突變且與表型共分離，提示LAT2在SCN中的潛在作用。從 LAT2 的功能特性和患者人群遺傳分析結果來看，LAT2基因可能參與了 SCN 的發(fā)病，但其是否為SCN新的致病基因及其在SCN中的作用和機制還不清楚，需要開展深入的研究證實。