白藜蘆醇治療膿毒癥大鼠急性肺損傷的作用及機(jī)制研究

鄭鳳霞 劉 迪 張莉紅

膿毒癥(sepsis)是臨床常見的急危重癥，急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是膿毒癥最常見的伴發(fā)癥[1]。炎性因子的大量激活是膿毒癥患者器官損傷的主要機(jī)制，急性肺損傷也與炎性因子的過度激活密切相關(guān)[2]。抑制炎性反應(yīng)可以保護(hù)膿毒癥大鼠的肺功能已被研究所證實(shí)[3]。核因子 κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)通路是膿毒癥炎性因子激活釋放的主要調(diào)節(jié)通路[4]。白藜蘆醇是多酚類化合物，主要來源于花生、葡萄(紅葡萄酒)、虎杖、桑椹等植物，具有抗炎、抗氧化的作用，可以作為動脈粥樣硬化、心腦血管疾病的化學(xué)預(yù)防劑[5]。實(shí)驗(yàn)研究觀察到白藜蘆醇對膿毒癥大鼠急性肺損傷具有治療作用[6]，本研究觀察白藜蘆醇對對膿毒癥大鼠急性肺損傷的保護(hù)作用，并探討NF-κB炎性通路在其中的可能作用。

材料和方法

1.實(shí)驗(yàn)動物:健康雄性SD大鼠購自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心，體質(zhì)量210～240g(2月齡)，共 80只，在動物中心清潔級適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)造模和研究。

2.膿毒癥造模：80只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(20只)和造模組(60只)，盲腸結(jié)扎穿刺術(shù)制作膿毒癥大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。簡述如下：備皮消毒后?0mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，沿腹正中線做1.5cm切口，找到盲腸，游離腸系膜，距盲腸末端1/3處用 4 號手術(shù)線結(jié)扎，穿刺盲腸腸管，將盲腸還納腹腔，關(guān)閉腹腔，術(shù)后皮下注射0.9%NaCl注射液抗休克治療。20只假手術(shù)組大鼠僅僅分離盲腸，不做結(jié)扎和穿孔。造模組SD大鼠術(shù)后12h開始出現(xiàn)豎毛、蜷縮、少動、精神倦怠、少食、腹瀉、眼角滲出物等表現(xiàn)，成功率100%。術(shù)后60只造模SD 大鼠隨機(jī)分為膿毒癥模型組、低劑量白藜蘆醇干預(yù)組(Rec，20mg/kg)和高劑量白藜蘆醇干預(yù)組(Rec，40mg/kg)，每組20只，白藜蘆醇干預(yù)組大鼠于術(shù)后60min按照分組分別尾靜脈注射無菌白藜蘆醇(20mg/kg或40mg/kg，美國Sigma公司產(chǎn)品)，假手術(shù)組和膿毒癥模型組大鼠尾靜脈注射等量0.9%NaCl注射液。24h后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測。

3.腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)的ELISA法檢測:大鼠外周血TNF-α、IL-6的表達(dá)的ELISA法檢測。ELISA檢測試劑盒購自武漢博士德生物科技技術(shù)有限公司(批號：20180732)，造模前和造模24h后抽取大鼠尾靜脈血液0.4ml，交由檢驗(yàn)科嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，加入相關(guān)試劑，上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司SAF-680T酶標(biāo)儀檢測各樣品的吸光度值變化，對照標(biāo)準(zhǔn)品，計(jì)算各樣品TNF-α和IL-6的表達(dá)水平。

4.肺損傷評分:造模24h后，所有大鼠均斷頸處死，取左肺下葉組織，4%甲醛固定肺組織24h后，送病理科制作HE染色切片，鏡下見肺組織血管充血，間質(zhì)水腫出血，肺泡壞死，肺泡腔范圍消失，淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤[7]。顯微鏡下進(jìn)行肺損傷評分，按照正常(0分)、輕度(1分)、中度(2分)、重度(3分)從肺泡水腫、肺泡出血、肺不張、炎性細(xì)胞浸潤、透明膜形成5個方面進(jìn)行評分，總分15分，評分越高損傷越嚴(yán)重[8]。

5.肺組織細(xì)胞核P65的Western blot法檢測：造模24h后，所有大鼠均斷頸處死，取50mg左肺下葉組織，液氮下研磨后，PBS洗滌2次，細(xì)胞核蛋白提取試劑盒購自北京碧云天生物科技有限公司(批號：20180321)，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，提取細(xì)胞核蛋白，加入蛋白裂解液，取10μg核蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳后電轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入兔抗鼠P65抗體(武漢博士德生物科技技術(shù)有限公司，批號：20180716)孵育12h，加入羊抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(武漢博士德生物科技技術(shù)有限公司，批號：20180227)，化學(xué)發(fā)光后使用上海金鵬公司生產(chǎn)JP-K300型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)拍照，Quantity One V4.3.0軟件，掃描條帶，以組蛋白為內(nèi)參計(jì)算各樣品的相對表達(dá)量。同一大鼠在不同部位取材3次，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，然后求平均值。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較使用方差分析，組間相互比較使用LSD-t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.白藜蘆醇對膿毒癥模型大鼠存活率的影響:假手術(shù)組無大鼠死亡，存活率為100.0%，膿毒癥模型組死亡9只，存活11只，存活率為55.0%，低劑量Rec干預(yù)組死亡5只，存活15只，存活率為75.0%，高劑量Rec干預(yù)組死亡2只，存活18只，存活率為90.0%，4組間存活率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中低劑量和高劑量Rec干預(yù)組存活率顯著高于膿毒癥模型組(P<0.05)，高劑量Rec干預(yù)組存活率顯著高于低劑量Rec干預(yù)組(P<0.05)。

2.白藜蘆醇對膿毒癥模型大鼠肺組織損傷的影響:肺損傷評分在假手術(shù)組、膿毒癥模型組、低劑量Rec干預(yù)組和高劑量Rec干預(yù)組分別為1.04±0.22分、12.25±2.14分、8.63±1.36分和5.18±1.13分，4組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其中低劑量和高劑量Rec干預(yù)組肺損傷評分顯著低于膿毒癥模型組(P<0.01)，高劑量Rec干預(yù)組肺損傷評分顯著低于低劑量Rec干預(yù)組(P<0.01)，詳見圖1。

圖1 4組造模24h后肺損傷評分的比較與假手術(shù)組比較，*P<0.01；與膿毒癥模型組比較，▲P<0.01；與低劑量Rec干預(yù)組比較，#P<0.01

3.白藜蘆醇對膿毒癥模型大鼠TNF-α、IL-6炎性因子表達(dá)的影響:假手術(shù)組、膿毒癥模型組、低劑量Rec干預(yù)組和高劑量Rec干預(yù)組造模前大鼠外周血TNF-α和IL-6表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，造模24h后低劑量和高劑量Rec干預(yù)組TNF-α和IL-6表達(dá)顯著低于膿毒癥模型組(P<0.01)，高劑量Rec干預(yù)組TNF-α和IL-6表達(dá)顯著低于低劑量Rec干預(yù)組(P<0.01)，詳見表1。

表1 4組TNF-α和IL-6表達(dá)的比較

與假手術(shù)組比較，*P<0.01；與膿毒癥模型組比較，▲P<0.01;與低劑量Rec干預(yù)組比較，#P<0.01；與造模前比較，&P<0.05，&&P<0.01

4.白藜蘆醇對膿毒癥模型大鼠肺組織細(xì)胞核P65的表達(dá)：肺組織細(xì)胞核P65相對灰度值在假手術(shù)組、膿毒癥模型組、低劑量Rec干預(yù)組和高劑量Rec干預(yù)組分別為0.14±0.03、0.82±0.15、0.56±0.09、0.25±0.06，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。其中假手術(shù)組肺組織細(xì)胞核P65表達(dá)顯著低于低劑量和高劑量Rec干預(yù)組(P<0.01)，低劑量和高劑量Rec干預(yù)組P65表達(dá)顯著低于膿毒癥模型組(P<0.01)，高劑量Rec干預(yù)組P65表達(dá)顯著低于低劑量Rec干預(yù)組(P<0.01)，詳見圖2。

圖2 4組大鼠肺組織細(xì)胞核P65表達(dá)的Western blot法檢測

討 論

膿毒癥是臨床上的急危重癥，急性肺損傷是急性呼吸窘迫綜合征的早期階段，20%的急性肺損傷是伴發(fā)于膿毒癥患者，其病死率高達(dá)50%～70%[9]。膿毒癥激發(fā)的全身炎性反應(yīng)綜合征是導(dǎo)致多器官功能障礙的重要原因，研究已發(fā)現(xiàn)膿毒癥急性肺損傷患者體內(nèi)炎性反應(yīng)的激活[10]。NF-κB信號通路是機(jī)體內(nèi)一條重要的炎性調(diào)節(jié)通路，在膿毒癥時處于激活狀態(tài)，并且可以參與到肺損傷的致病過程中[11，12]。王國全等[13]研究證實(shí)抑制NF-κB信號通路可以對膿毒癥急性肺損傷大鼠發(fā)揮保護(hù)作用。白藜蘆醇是一種含有芪類結(jié)構(gòu)的非黃酮類多酚化合物，其抗炎作用已被大多數(shù)實(shí)驗(yàn)所證實(shí)[14]。于紅等[15]研究顯示，白藜蘆醇可以顯著降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和血管內(nèi)皮損傷標(biāo)志蛋白的表達(dá)，對急性肺損傷小鼠發(fā)揮保護(hù)作用。本研究也觀察到白藜蘆醇干預(yù)組肺損傷評分顯著低于膿毒癥模型組，說明膿毒癥時給予白藜蘆醇對模型鼠肺組織具有保護(hù)作用。

NF-κB信號通路中的主要效應(yīng)蛋白是P65和P50，二者形成二聚體進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用，調(diào)節(jié)下游炎性因子例如TNF-α和IL-6 等的表達(dá)[16]。因此研究中檢測細(xì)胞核中P65蛋白的表達(dá)就可以反應(yīng)出NF-κB信號通路的激活情況[17]。本研究的檢測顯示模型組大鼠肺組織細(xì)胞核P65表達(dá)顯著高于假手術(shù)組，其中白藜蘆醇干預(yù)組肺組織細(xì)胞細(xì)胞核P65表達(dá)顯著低于非干預(yù)的膿毒癥模型組，說明白藜蘆醇抑制了NF-κB信號通路中關(guān)鍵蛋白P65的核移位，下游的炎性因子TNF-α和IL-6在相應(yīng)的在白藜蘆醇干預(yù)組也顯著低于非干預(yù)的膿毒癥模型組。楊劍榆等[18]的研究也發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可以通過抑制NF-κB活性減輕大鼠腸缺血再灌注模型中繼發(fā)的肺損傷，綜合上述研究提示白藜蘆醇對膿毒癥大鼠肺損傷的保護(hù)作用可能是通過調(diào)節(jié)NF-κB通路來實(shí)現(xiàn)的，但是其具體的機(jī)制還需要開展進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。

綜上所述，本研究顯示白藜蘆醇下調(diào)膿毒癥大鼠肺組織細(xì)胞核P65蛋白的表達(dá)，抑制炎性反應(yīng)，對肺損傷具有保護(hù)作用。