MXD3基因在腎透明細胞癌中的表達及臨床意義

梅 杰 徐 瑞 王惠宇 潘佳棟 劉超英

腎細胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，美國腫瘤協(xié)會預測2018年全美會有超過60000例RCC新增病例和近15000例死亡病例[1]。根據組織學特點和分析特征，RCC被分成許多亞型。主要亞型包括腎透明細胞癌(ccRCC)、腎乳頭狀細胞癌(pRCC)、腎嫌色細胞癌(chRCC)、腎集合管細胞癌(cdRCC)和未分類腎細胞癌[2, 3]。其中ccRCC是最常見的腎細胞癌亞型，約占70%～75%[2]。通常情況下RCC對傳統(tǒng)化療和放療療效不佳，最好的治療方法是早期外科切除[4]。然而，大量預后不良的ccRCC進展期患者仍然缺乏有效的治療措施來控制腫瘤惡性進展。因此，探索ccRCC潛在的生物學標志物和治療靶點對ccRCC的治療具有重要意義。

轉錄因子(transcription factors，TFs)被認為是細胞內基因表達的主要調控因子[5]。長期以來，關鍵TFs的失調被認為是多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關鍵事件。MXD3是堿性-螺旋-環(huán)-螺旋轉錄因子MXD家族成員之一，與其輔因子MAX形成異二聚體，最初被認為是MXD/MAX/MYC轉錄網絡中MYC蛋白的功能拮抗劑[6～8]。MXD3在細胞增殖中發(fā)揮重要作用，有報道稱MXD3在多種腫瘤中表達失調，并且對少數(shù)腫瘤具有臨床診斷和治療價值。MXD3在髓母細胞瘤和神經母細胞瘤中均有高表達，在上述兩種腫瘤中均發(fā)揮致癌基因的作用[9, 10]。與之相反的是，在前列腺癌和神經纖維瘤病中，MXD3表達降低[10]。然而，盡管MXD3的表達就作用機制在少數(shù)幾種腫瘤中已有探究，關于MXD3在ccRCC中表達的研究尚未見報道，MXD3對ccRCC的潛在作用還存在很大的探索空間。

本研究中，筆者從癌癥基因組圖譜數(shù)據庫(The Cancer Genome Atlas，TCGA)和基因表達匯編數(shù)據庫(Gene Expression Omnibus，GEO)下載ccRCC中MXD3表達數(shù)據和臨床病理參數(shù)，分析MXD3表達與腎透明細胞癌臨床病理學參數(shù)之間的相關性及對預后的影響。本研究首次揭示了MXD3在ccRCC中的差異表達及對預后的影響，有望成為ccRCC靶向治療的新靶點。

材料與方法

1.TCGA數(shù)據資料收集：利用UCSC Xena網站(https://xenabrowser.net/)下載腎透明細胞癌患者基因表達譜Level3數(shù)據和臨床隨訪資料。整理提取MXD3 mRNA表達數(shù)據以及相應的臨床資料，其中MXD3表達譜數(shù)據已進行l(wèi)g2(x+1)標準化轉化。通過篩選，共保留528例同時包含MXD3表達譜數(shù)據與對應的臨床隨訪資料的病例信息，其中有72例腫瘤組織包含配對的正常組織的基因表達數(shù)據。根據MXD3表達量，對數(shù)據集中的樣本按照MXD3的標準化表達量進行由高到低排序，將數(shù)據兩等分，位于前50%的樣本為高表達組，位于后50%的樣本為低表達組。

2.GEO數(shù)據資料收集：登錄GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/)數(shù)據庫，從數(shù)據集中下載ccRCC測序芯片集GSE40435，用于驗證ccRCC中MXD3 (ID_REF: ILMN_1711904)的差異表達。GSE40435由Wozniak等[11]在GPL10558平臺上使用Illumina HumanHT-12 v4表達串珠芯片獲得的ccRCC測序芯片集，包含101個腫瘤組織和與其匹配的正常組織的基因表達譜。

3.生存分析：采用Kaplan-Meier法對保留的528例患者的MXD3 mRNA表達數(shù)據與匹配的生存資料進行生存分析。使用COX比例風險模型對可能影響腎透明細胞癌患者預后的參數(shù)進行單因素和多因素分析，模型參數(shù)采用Omnibus檢驗法。

4.統(tǒng)計學方法：應用SPSS 25.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據進行統(tǒng)計分析。采用配對t檢驗比較腫瘤組織和對應的癌旁正常組織中MXD3表達量。采用ROC曲線評價腫瘤組織和癌旁正常組織中MXD3差異表達的診斷意義。采用χ2檢驗比較MXD3表達量與臨床病理參數(shù)關聯(lián)性，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.MXD3在腎透明細胞癌中的表達：與癌旁組織比較，TCGA數(shù)據庫中ccRCC組織的MXD3表達均明顯上調(P=0.000，圖1A)。筆者進而使用ROC曲線法評估MXD3的差異表達在診斷ccRCC中的潛在價值(AUC=0.897，P=0.000，圖1B)，敏感度為83.33%，特異性為91.67%。筆者進一步利用GSE40435微陣列數(shù)據驗證了MXD3在ccRCC中的差異表達(P=0.000，圖1C)，同時也證明MXD3在ccRCC組織中的過表達對鑒別ccRCC組織和癌旁組織具有良好的診斷價值(AUC=0.785，P=0.000，圖1D)。

2.MXD3表達與ccRCC臨床病理變量的關系：因GSE40435微陣列數(shù)據未包含完整的臨床病理參數(shù)，本研究只納入了TCGA數(shù)據庫中的528例患者進行臨床病例參數(shù)和生存分析。按照MXD3表達量將患者分為MXD3高表達組和低表達組。MXD3表達在性別及年齡方面比較，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.465，P=0.296，表1)。在ccRCC的臨床分期方面，MXD3表達在較大及發(fā)生遠端轉移的腫瘤中的表達顯著增加(P均=0.001)。TNM分期較高者MXD3表達也顯著增加(P=0.000)。然而，淋巴結轉移陽性患者MXD3表達情況與淋巴結轉移陰性患者比較，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.213)。此外，MXD3高表達與病理分級密切相關(P=0.001)，詳見表1。

圖1 MXD3在ccRCC組織及癌旁組織中的表達A.TCGA數(shù)據顯示ccRCC組織中MXD3的表達明顯上調；B.TCGA數(shù)據集中MXD3 mRNA差異表達對ccRCC組織和癌旁組織具有良好的診斷價值；C.GSE40435微陣列數(shù)據顯示ccRCC組織中MXD3的表達明顯上調；D.GSE40435微陣列數(shù)據集中MXD3 mRNA差異表達對ccRCC組織和癌旁組織具有良好的診斷價值

3.MXD3表達與腎透明細胞癌患者生存的關系：與存活患者比較，死亡患者MXD3的表達明顯增加(P=0.000，圖2A)。Kaplan-Meier法分析顯示，MXD3高表達與ccRCC患者總體生存期縮短顯著相關(P=0.000，圖2B)。

表1 MXD3 mRNA表達量與腎透明細胞癌患者臨床病理學參數(shù)的關系

圖2 MXD3表達與ccRCC患者預后的關系A.存活患者與死亡患者MXD3表達比較差異有統(tǒng)計學意義；B.MXD3高表達的患者OS明顯短于MXD3低表達的患者

4.腎透明細胞癌患者的單因素和多因素生存分析：在總生存率預后因素的單因素COX回歸模型中，初診年齡(P=0.000)、T分期(P=0.000)、N分期(P=0.001)、M分期(P=0.000)、TNM分期(P=0.000)、腫瘤分化程度(P=0.000)、MXD3表達(P=0.000)均與患者預后相關(表1)。多因素COX分析顯示MXD3是OS的獨立預后因素(HR=2.249，95% CI: 1.350～3.488，P=0.000)。此外，年齡(P=0.008)和M分期(P=0.001)也是ccRCC患者的獨立預后指標(表2)。

表2 腎透明細胞癌患者的單因素和多因素生存分析

討 論

MXD3是MXD家族成員之一，參與調控MXD/MAX/MYC轉錄網絡，通過與MAX競爭性結合而阻斷依賴MYC基因轉錄的激活，被認為是一種腫瘤抑制因子。已有多項研究證實了MXDs與MYC相互作用的可能機制，MXDs的低表達或失活可導致MXDs-MAX二聚體的減少，從而使MYC的功能形式——MYC- MAX二聚體的數(shù)量顯著增加[12]。MYC編碼細胞核轉錄因子，在包括細胞增殖、生長、黏附、代謝、血管生成、分化和凋亡等真核細胞生物活動中發(fā)揮重要作用[13]。此外，大多數(shù)人類惡性腫瘤中都被發(fā)現(xiàn)存在MYC的表達失調，充當腫瘤發(fā)生、發(fā)展的致癌基因[14]。

MXD3在少數(shù)幾種腫瘤中已被確定為一種新的致癌基因，包括髓母細胞瘤、神經母細胞瘤以及急性B淋巴細胞白血病[9,10,15]。一項基于TCGA數(shù)據庫的研究表明膠質瘤過表達的MXD3受其轉錄組水平的可變剪接調控[16]。此外，以MXD3為靶點的靶向治療腫瘤的前景也十分可觀。MXD3 siRNA已被報道用于神經母細胞瘤和急性B淋巴細胞白血病的靶向治療，并對癌細胞的增殖有明顯抑制作用[10,17]。目前尚無相關研究報道MXD3在ccRCC中表達及臨床意義，因此本研究為較早地關注MXD3在ccRCC中的表達及其與臨床病理參數(shù)的關系。

通過對TCGA中MXD3表達數(shù)據的分析，筆者發(fā)現(xiàn)與癌旁組織比較，ccRCC組織中MXD3表達明顯上調。筆者采用ROC曲線評價MXD3對ccRCC的診斷價值，結果顯示相對敏感度為83.33%，特異性為91.67%。GSE40435微陣列數(shù)據集的MXD3表達數(shù)據進一步驗證了本研究結果，兩個獨立數(shù)據庫的結果均表明檢測MXD3 mRNA的差異表達是診斷ccRCC的有效方法。此外，MXD3表達量與ccRCC的TNM分期有關，在不同分化程度的腫瘤中差異有統(tǒng)計學意義。上述結果表明，MXD3表達可作為預測ccRCC進展的可靠指標。迄今為止，對于MXD3對人類惡性腫瘤的預后價值還知之甚少。筆者發(fā)現(xiàn)MXD3高表達組患者的OS明顯低于低表達組。單因素和多因素COX回歸分析表明，MXD3表達可作為ccRCC的獨立預測因子。

本研究初步分析MXD3表達及其與臨床病例參數(shù)的關系，表明MXD3表達的上調是ccRCC潛在的生物學標志物和獨立的預后指標。同時，MXD3可能成為一個新的抗癌治療靶點，可能改善ccRCC患者的預后。雖然本研究已經初步證明MXD3是一種新的ccRCC診斷和預后標志物，但本研究也存在一些局限性。主要的缺點是TCGA和GEO數(shù)據庫只提供了MXD3在mRNA水平上的表達，這或許不能完全代表MXD3在蛋白水平上的表達及活化程度。MXD3參與ccRCC發(fā)生、發(fā)展的可能機制還有待于進一步研究。