D-異抗壞血酸鈉抑制臘腸脂肪和蛋白質(zhì)氧化

尚校蘭，陳占兄，單新童，李妍，劉瑤瑤

（1.廊坊師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河北廊坊065000；2.河北省動(dòng)物多樣性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北廊坊065000）

臘腸是我國(guó)著名的傳統(tǒng)風(fēng)味肉制品之一，深受消費(fèi)者的喜愛(ài)。目前市面上最常見(jiàn)的臘腸有3 種，二八腸（肥瘦質(zhì)量比 2 ∶8）、三七腸（肥瘦質(zhì)量比 3 ∶7）和四六腸（肥瘦質(zhì)量比4 ∶6）。臘腸中脂肪對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)起著重要的作用，臘腸的特征風(fēng)味主要來(lái)自于脂質(zhì)的降解和氧化[1]，適度的脂質(zhì)氧化有利于臘腸特征風(fēng)味的形成，但是過(guò)度的脂肪氧化使臘腸產(chǎn)生哈喇味[2]，嚴(yán)重影響臘腸的品質(zhì)，因此如何控制臘腸中脂肪的過(guò)度氧化成為亟待解決的關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題。

趙謀明等[3]研究表明，真空包裝和抗氧化劑可以明顯抑制臘腸脂質(zhì)氧化，復(fù)配抗氧化劑、沒(méi)食子酸丙酯（propyl gallate，PG）和特丁基對(duì)苯二酚（tert butyl hydroquinone，TBHQ）的抗氧化效果最佳。徐勇等[4]研究抗壞血酸（ascorbic acid，VC）和生育酚（tocopherol，VE）對(duì)廣式臘腸過(guò)氧化值以及色澤的影響，認(rèn)為同時(shí)使用VC和VE能有效抑制廣式臘腸過(guò)氧化值的升高，并對(duì)臘腸的色澤具有較好的保護(hù)作用。

抗壞血酸是一種常用的抗氧化劑，它可以除去食品中的氧氣（如3.5 mg 抗壞血酸能清除1 cm3的頂空氧）；此外，抗壞血酸具有螯合金屬的能力，抗壞血酸和金屬形成的配合物的抗氧化活性低于單獨(dú)使用抗壞血酸的抗氧化活性[5]。

異抗壞血酸鈉（sodium erythorbate）是抗壞血酸鈉的旋光異構(gòu)體，它沒(méi)有抗壞血酸鈉的生理活性，但其具有較強(qiáng)的抗氧化活性以及僅為抗壞血酸鈉1/3 的生產(chǎn)成本，因此被廣泛用于肉制品的生產(chǎn)中。根據(jù)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)GB2760-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》，在食品加工中可以根據(jù)需要決定異抗壞血酸鈉添加量[6]。關(guān)于異抗壞血酸鈉在肉制品中的應(yīng)用，很多學(xué)者進(jìn)行了報(bào)道。徐海祥等[7]研究不同含量異抗壞血酸鈉對(duì)臘腸過(guò)氧化值的影響，結(jié)果表明650 mg/kg 異抗壞血酸鈉能使臘腸的過(guò)氧化值降低90%左右；Choe 等[8]發(fā)現(xiàn)在 12 d 的貯藏期內(nèi)，和未添加異抗壞血酸鈉的豬肉餅相比，添加異抗壞血酸鈉能有效地抑制豬肉餅的過(guò)氧化值和TBARS 值的升高。

關(guān)于抗氧化劑對(duì)肉制品中蛋白質(zhì)氧化的影響，賈娜等[9]發(fā)現(xiàn)沒(méi)食子酸能抑制豬肉肌原纖維蛋白氧化；許鵬[10]發(fā)現(xiàn)賴氨酸和精氨酸能夠有效抑制乳化香腸貯藏期間脂肪氧化和蛋白質(zhì)氧化程度；于海等[11]使用二丁基羥基甲苯（dibutyl hydroxytoluene, BHT）有效抑制了中式香腸的脂肪氧化和蛋白質(zhì)氧化。目前，大多數(shù)學(xué)者的研究主要集中在臘腸貯藏過(guò)程中的研究，而對(duì)于臘腸加工過(guò)程中的研究較少報(bào)道，而D-異抗壞血酸鈉在臘腸加工過(guò)程中對(duì)脂肪氧化和蛋白質(zhì)氧化的相關(guān)性分析，尚未見(jiàn)報(bào)道。本文研究了D-異抗壞血酸鈉對(duì)臘腸加工過(guò)程中脂肪氧化和蛋白質(zhì)氧化指標(biāo)的變化，并對(duì)其相關(guān)性進(jìn)行了分析，為提高臘腸的品質(zhì)奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮豬瘦肉、豬肥膘、鹽、綿白糖、生抽、酒：市售；天然羊腸衣：河南省許昌市鄢陵縣鑫鑫腸衣有限公司。

5，5′-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）[5,5'-dithio bis-（2-nitrobenzoic acid），DTNB]：Sigma 公司；三（羥甲基）氨基甲 烷 [Tris（hydroxymethyl）aminomethane，Tris]、牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）、2，4-二硝基苯肼（2,4-dinitrophenylhydrazine，DNPH）、十二烷基硫酸鈉 （sodium dodecyl sulfate，SDS）、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、硝酸鈉、石油醚、硫代硫酸鈉、碘化鉀、三氯乙酸、乙酸乙酯、乙醇、鹽酸胍：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；D-異抗壞血酸鈉（食品級(jí)）：江西省德興市百勤異VC鈉有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

IKA T18 高速勻漿機(jī)：德國(guó)IKA 公司；CTH2050R冷凍離心機(jī)：美國(guó)Thermo Fisher 科技有限公司；SP-2102UV 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；R202-2 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國(guó)海道夫公司。

1.3 方法

1.3.1 臘腸的制作

原料豬肉切成8 mm～10 mm 的肉丁，肥瘦質(zhì)量比為 2 ∶8 混勻，按 100 g 豬肉，2 g 鹽，5 g 糖，5 g 生抽，3 g酒，10 mg 硝酸鈉，15 g 水的比例加入配料，攪拌混勻。向上述混合物中分別加入0%、0.05%、0.1%的D-異抗壞血酸鈉，攪拌均勻后按每根50 g 灌腸。灌腸后扎孔，置于 50 ℃烘箱內(nèi)，分別測(cè)定 0、5、10、15、20、30、48 h以及72 h 下臘腸的以下各指標(biāo)變化情況。

1.3.2 過(guò)氧化值的測(cè)定

根據(jù) AOAC 的方法（AOAC,965.33）進(jìn)行測(cè)定[12]。

1.3.3 TBARS 值的測(cè)定

根據(jù)GB5009.181-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中丙二醛的測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定[13]。

1.3.4 肌原纖維蛋白的提取

肌原纖維蛋白的提取參照Park 等[14]的方法，略作修改。取50 g 臘腸，剔除脂肪，稱取10 g 加入5 倍0.05 mol/L KCl-20 mmol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 7.0），混勻，9 000 r/min 4 ℃離心10 min，棄去上清液，重復(fù)洗滌一次。沉淀加入4 倍0.6 mol/L KCl-20 mmol/L Tris-HCl 緩沖液，10 000 r/min 勻漿90 s。過(guò)濾結(jié)締組織，靜置30 min 以充分溶解蛋白，9 000 r/min 4 ℃離心20 min，所得上清液即為肌原纖維蛋白溶液。肌原纖維蛋白濃度采用雙縮脲法測(cè)定，以牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.3.5 肌原纖維蛋白羰基含量的測(cè)定

參考李學(xué)鵬等的測(cè)定方法[15]，取1 mL 濃度為5 mg/mL 的蛋白溶液放入塑料離心管中，加入1 mL 10 mmol/L 的 DNPH（用 2 mol/L HCl 配制），25 ℃下黑暗靜置1 h（每15 min，振蕩 1 次），添加 3 mL 20%三氯乙酸后10 000 r/min 離心5 min，棄上清液，用體積比為1 ∶1 的乙酸乙酯-乙醇洗沉淀3 次后，加5 mL 6 mol/L 鹽酸胍溶液（用 20 mmol/L，pH 7.0 的磷酸鹽緩沖液配制），37 ℃保溫 15 min 溶解沉淀，10 000 r/min離心3 min 除去不溶物質(zhì)，所得溶液在370 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。使用分子吸光系數(shù)22 000 L/（mol·cm）計(jì)算每克蛋白中羰基含量μmol。

1.3.6 肌原纖維蛋白總巰基含量的測(cè)定

總巰基（-SH）含量測(cè)定參考Benjakul 等的方法[16]。1.0 mL 肌原纖維蛋白溶液（0.4 %）中加入9 mL 含有8 mol/L 尿素、2%SDS 和 10 mmol/L EDTA 的 0.2 mol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 6.8）0.4 mL，4 mL 混合液中加入0.4 mL 含有 0.1 % DTNB 的 0.2 mol/L Tris-HC1（pH 8.0）緩沖液，40 ℃反應(yīng) 25 min，于 412 nm 處測(cè)定吸光值?？瞻讟悠肥褂?.6 mol/L KCl 替代蛋白測(cè)定。巰基含量使用消光系數(shù)13 600 L/（mol·cm）進(jìn)行計(jì)算。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 16.0 和Excel 2016 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。n=3，P＜0.05 具有顯著性差異，P＜0.01 具有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 D-異抗壞血酸鈉對(duì)臘腸加工過(guò)程中過(guò)氧化值的影響

過(guò)氧化值（peroxide value，PV）主要是用來(lái)評(píng)價(jià)脂質(zhì)氧化形成初級(jí)氧化產(chǎn)物-氫過(guò)氧化物的量，臘腸加工過(guò)程中脂肪氧化指標(biāo)見(jiàn)表1。

由表1 可知，不添加D-異抗壞血酸鈉的臘腸，在0～10 h，過(guò)氧化值呈顯著（P＜0.05）上升趨勢(shì)，15 h～72 h呈下降趨勢(shì)，可能是因?yàn)?0 h 后之前積累的氫過(guò)氧化物變?yōu)樾》肿游镔|(zhì)，同時(shí)使TBARS 值升高，這和孫為正的研究一致[17]。Choe 等[8]向豬肉中添加了0.05%的抗壞血酸，發(fā)現(xiàn)添加抗壞血酸會(huì)降低豬肉的過(guò)氧化值，并且在12 d 的儲(chǔ)藏過(guò)程中，第1 天過(guò)氧化值最低，第4 天升高，后期呈現(xiàn)繼續(xù)升高趨勢(shì)，但和未添加抗壞血酸的相比，相同的時(shí)間點(diǎn)下，添加抗壞血酸的豬肉比不添加的過(guò)氧化值要低，這說(shuō)明抗壞血酸在脂肪的氧化過(guò)程中，起到了持續(xù)的抗氧化作用。本研究發(fā)現(xiàn)，在0～10 h，添加0.05%D-異抗壞血酸鈉會(huì)使臘腸過(guò)氧化值降低但不顯著（P＞0.05），15 h～72 h，臘腸的過(guò)氧化值有所升高但也不顯著（P＞0.05）。添加0.1%D-異抗壞血酸鈉的臘腸過(guò)氧化值和添加0.05%D-異抗壞血酸鈉臘腸的過(guò)氧化值變化趨勢(shì)類似，但由于D-異抗壞血酸鈉量的增多，其過(guò)氧化值比0.05%的略低。

2.2 D-異抗壞血酸鈉對(duì)臘腸加工過(guò)程中TBARS的影響

肉制品的二級(jí)氧化通常通過(guò)測(cè)定TBARS 值來(lái)反映，而TBARS 值是以丙二醛含量的多少來(lái)表示。Ferreira 等[18]認(rèn)為丙二醛濃度超過(guò) 2 mg/kg～3 mg/kg 時(shí)，肉品才會(huì)出現(xiàn)不良風(fēng)味，臘腸加工過(guò)程中蛋白質(zhì)氧化指標(biāo)見(jiàn)表1。

表1 可知，所有臘腸的TBARS 值都沒(méi)超過(guò)2 mg/kg，未添加D-異抗壞血酸鈉的臘腸，隨著加工時(shí)間的延長(zhǎng)，TBARS 值顯著性升高（P＜0.05）。添加 0.05%D-異抗壞血酸鈉和0.1%D-異抗壞血酸鈉的臘腸，TBARS值也升高，但沒(méi)有未添加的顯著。這說(shuō)明D-異抗壞血酸鈉在抑制脂肪氧化小分子化合物的生成上，起到了一定的作用。

2.3 D-異抗壞血酸鈉對(duì)臘腸加工過(guò)程中肌原纖維蛋白羰基含量的影響

未添加D-異抗壞血酸鈉的臘腸，隨著加工時(shí)間的延長(zhǎng)，肌原纖維蛋白羰基含量呈現(xiàn)升高趨勢(shì)（P＜0.05）。在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)下，均發(fā)現(xiàn)添加D-異抗壞血酸鈉能使羰基含量顯著下降。0、5、10、15、20 h 以及 48 h 時(shí)，添加0.05 %D-異抗壞血酸鈉和添加0.1 %D-異抗壞血酸鈉的臘腸的羰基含量差異不顯著（P＞0.05），而30 h和72 h 下，添加0.05 %D-異抗壞血酸鈉和添加0.1 %D-異抗壞血酸鈉的臘腸的羰基含量具有顯著性差異（P＜0.05）。

2.4 D-異抗壞血酸鈉對(duì)臘腸加工過(guò)程中肌原纖維蛋白巰基含量的影響

未添加D-異抗壞血酸鈉的臘腸，巰基含量隨著加工時(shí)間延長(zhǎng)呈顯著降低趨勢(shì)（P＜0.05），這和孫為正的研究結(jié)果一致[17]，是因?yàn)榧≡w維空間結(jié)構(gòu)受到氧化因子的破壞，導(dǎo)致內(nèi)部易氧性疏基的暴露[19]。添加D-異抗壞血酸鈉后，巰基含量也降低，可能是由于D-異抗壞血酸鈉中的某個(gè)基團(tuán)和巰基發(fā)生反應(yīng)（羥基化合物），從而導(dǎo)致其含量降低。但從30 h 開(kāi)始，添加D-異抗壞血酸鈉的臘腸巰基含量比未加D-異抗壞血酸鈉的高，這可能是由于隨著時(shí)間延長(zhǎng)，D-異抗壞血酸鈉的抗氧化能力突顯，其發(fā)揮的抗氧化作用強(qiáng)于合成羥基化合物的能力，因此巰基含量升高。

2.5 臘腸過(guò)氧化值、TBARS值、肌原纖維蛋白羰基值、巰基值相關(guān)性分析

李夢(mèng)琪[20]研究了羊肉在凍藏過(guò)程中脂肪氧化和蛋白質(zhì)氧化之間的相關(guān)性關(guān)系，得出羊肉中脂肪氧化在一定程度上能夠促進(jìn)肌原纖維蛋白羰基含量的增加、巰基的流失以及表面疏水性的增加。本文研究了不同D-異抗壞血酸鈉添加量下臘腸過(guò)氧化值、TBARS 值和肌原纖維蛋白羰基值、巰基值的相關(guān)性（表2）以及不同加工時(shí)間下臘腸過(guò)氧化值、TBARS 值和肌原纖維蛋白羰基值、巰基值的相關(guān)性（表3）。

表2 不同D-異抗壞血酸鈉添加量下臘腸過(guò)氧化值、TBARS 值和肌原纖維蛋白羰基值、巰基值相關(guān)性分析Table 2 Correlation between PV，TBARS and carbonyl value，sulfhydryl value of different concentrations of D-sodium erythorbate

表3 不同加工時(shí)間下臘腸過(guò)氧化值、TBARS 值和肌原纖維蛋白羰基值、巰基值相關(guān)性分析Table 3 Correlation between PV，TBARS and carbonyl value，sulfhydryl value of different processing time

由表2 可知，未添加D-異抗壞血酸鈉的臘腸，肌原纖維蛋白羰基值與TBARS 呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與巰基值呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）；添加 0.05%D-異抗壞血酸鈉的臘腸，肌原纖維蛋白羰基值與TBARS 呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與巰基值呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）；添加0.1%D-異抗壞血酸鈉的臘腸，肌原纖維蛋白羰基值與TBARS 呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），而與巰基值無(wú)相關(guān)性。

由表3 可知，15 h 時(shí)，肌原纖維蛋白羰基值、巰基值與過(guò)氧化值呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；0 h 時(shí)，巰基值與 TBARS 呈極顯著正相關(guān)（P＜0.05），72 h 時(shí)，肌原纖維蛋白羰基值與TBARS 呈極顯著正相關(guān)（P＜0.05）。

3 結(jié)論

添加D-異抗壞血酸鈉能減緩脂肪氧化和蛋白質(zhì)氧化的速度，臘腸加工初期（0～10 h）過(guò)氧化值升高可能是由于被氧化形成氫過(guò)氧化物，后期（15 h～72 h）TBARS 值升高可能是由于形成小分子風(fēng)味物質(zhì)。未添加D-異抗壞血酸鈉的臘腸，巰基含量隨著加工時(shí)間延長(zhǎng)呈顯著降低趨勢(shì)（P＜0.05），添加D-異抗壞血酸鈉后，巰基含量也降低，可能是由于D-異抗壞血酸鈉中的某個(gè)基團(tuán)和巰基發(fā)生反應(yīng)（羥基化合物），從而導(dǎo)致其含量降低。不同D-異抗壞血酸鈉添加量下，蛋白質(zhì)氧化指標(biāo)和TBARS 值具有很大的相關(guān)性；而不同加工時(shí)間下，相關(guān)性較小，15 h 時(shí)，肌原纖維蛋白羰基值、巰基值與過(guò)氧化值呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），0 h 時(shí)，巰基值與 TBARS 呈極顯著正相關(guān)（P＜0.05），72 h 時(shí)，肌原纖維蛋白羰基值與TBARS 呈極顯著正相關(guān)（P＜0.05）。