濃香型白酒發(fā)酵旺盛期糟醅中酵母菌菌群研究

譚壹，趙東，陳敏，游玲，王濤，*

（1.西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川成都610039；2.宜賓學(xué)院固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川宜賓644007）

在濃香型白酒釀造過程中酵母菌群是一類至關(guān)重要的功能微生物[1]，具有影響產(chǎn)酒量、改善產(chǎn)品風(fēng)味[2]及產(chǎn)生多種活性物質(zhì)[3]以及能與細(xì)菌、霉菌相互作用影響白酒釀造的微生態(tài)[4]等多種功能。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的在濃香型白酒釀造過程中的酵母菌有：Wickerhamomyces[5]、Lodderomyces[6]、Clavispora、Issatchenkia、Trichosporon、Saccharomyces[7]、Saccharomycopsis、Zygosaccharomyces、Rhodotorula[8]、Torulopsis[9]、Candida[9]、Hansenula[9-10]、Kluyveromyces[10]、Schizosaccharomyces、Citeromyces[11]、Neatpspora、Brettanomyces[12]、Pachysolen、Porobolomyces、Trulaspora、Dekkera[13]、Geotrichum[14]、Debaryomyces[15]、Malamade、Oosporidium[16]、Torulaspora[17]、Yarrowia[18]、Pichia[19]、Cryptococcus[20]、Naumovozyma[21]、Sporidiobolus[22]31 個(gè)屬的酵母菌，其中有16 個(gè)屬的酵母菌株尚未獲得純培養(yǎng)菌株，表明在濃香型白酒釀造中尚有多數(shù)種屬的酵母菌株資源有待挖掘利用。

宜賓作為濃香型白酒的核心產(chǎn)區(qū)，其酵母菌株資源的開發(fā)利用也日益受到重視，本研究采用高通量測(cè)序及純培養(yǎng)相結(jié)合的方法，研究本產(chǎn)區(qū)代表企業(yè)五糧液發(fā)酵旺盛期糟醅中的酵母群體，一方面初步解析濃香型白酒主發(fā)酵過程中的關(guān)鍵酵母種屬，另一方面初步建立基于培養(yǎng)組學(xué)思想的白酒糟醅酵母菌株資源挖掘方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

五糧液發(fā)酵旺盛期糟醅：宜賓五糧液技術(shù)中心；賴氨酸瓊脂培養(yǎng)、YPD 瓊脂培養(yǎng)基、WL 瓊脂培養(yǎng)基、低真菌pH 瓊脂培養(yǎng)基、孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基及麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基（均添加60 g/mL 鏈霉素）[23]：海博公司；DL-乳酸（分析純）：鹽城華德生物工程有限公司；FastDNA SPIN 試劑盒：上海前塵生物科技有限公司；Yeast DNA 試劑盒：上海易匯生物科技有限公司；PCR擴(kuò)增試劑盒、引物NL-1 5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'、NL-4 5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高壓蒸汽滅菌鍋（MLS-3781L-PC）：上海圳寶機(jī)電設(shè)備有限公司；生化培養(yǎng)箱（SPX-250B）：上海圣科儀器設(shè)備有限公司；超凈工作臺(tái)（SW-CJ-2FD）：鄭州宏朗儀器設(shè)備有限公司；FastPrep-24TM：上海溪拓科學(xué)儀器有限公司；小型臺(tái)式冷凍離心機(jī)（5418R）：常州諾基儀器有限公司；Themal Cycler PCR 儀（T-100）：上海珂淮儀器有限公司；電泳儀（DYY-12）：北京新諾立華儀器有限公司；藍(lán)光透射儀（OSE-470）：天根生化（北京）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 取樣

采用專用取樣器對(duì)五糧液發(fā)酵窖池中旺盛期糟醅進(jìn)行多點(diǎn)均勻取樣，以取樣器插入窖池10 cm 處為上層糟醅，2.7 m 處為下層糟醅。取樣時(shí)分別于窖池內(nèi)上下層糟醅同一表面的中心及四周共10 個(gè)取樣點(diǎn)，每個(gè)取樣點(diǎn)取100 g 的樣品，然后將樣品分別裝入無菌取樣袋中，不冷藏，在1 h 內(nèi)完成總DNA 提取及純菌分離。

1.3.2 總DNA 提取及高通量測(cè)序

按照FastDNA SPIN 試劑盒的方法提取上、下層新鮮酒糟的總DNA，以NL1、NL4 為引物，PCR 擴(kuò)增酵母26S rDNA 特征序列[24]，獲得聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物，并回收純化，利用 Illumina MiSeq PE300 平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3.3 菌株分離純化

按文獻(xiàn)[25]對(duì)糟醅混合樣品進(jìn)行稀釋涂布。在同種培養(yǎng)基上挑選顏色或形態(tài)不同的單菌落到相應(yīng)的培養(yǎng)基的平板上進(jìn)行劃線純化培養(yǎng)，待其長(zhǎng)出單菌落后進(jìn)行后期菌落及細(xì)胞形態(tài)觀察合并以及做斜面保藏和30%甘油管保藏在4 ℃冰箱中。

1.3.4 特征序列鑒定

按照E.Z.N.A Yeast DNA 試劑盒的步驟提取純培養(yǎng)酵母菌株的DNA。以NL1、NL4 為引物擴(kuò)增酵母菌株26S rDNA 序列。

按照即用PCR 擴(kuò)增試劑盒在無菌潔凈的PCR 管中依次加入：無菌 ddH2O22 μL，2×HiFi-PCR Master 25 μL，DNA 模板 1 μL，引物（10 μmol/L）各 1 μL，終體積 50 μL，離心混勻。

擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 1 min；65 ℃退火1 min：每一個(gè)循環(huán)溫度降低0.5 ℃；72 ℃延伸 1 min；循環(huán) 20 次；94 ℃變性 1 min；55 ℃退火 1 min；72 ℃延伸 1 min；循環(huán) 10 次；4 ℃保存。PCR 完后制備1%的瓊脂對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，觀察是否有條帶，且條帶是否在500 bp～600 bp 之間。再將PCR 產(chǎn)物保存好，最后送到上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成測(cè)序。

將測(cè)序后的26S rDNA 序列與NCBI 中模式菌株的核酸序列進(jìn)行同源序列搜索（Blast Search），同時(shí)，運(yùn)用CLUSTAL W 軟件比對(duì)所有近似物種，使用MEGA 6.0 對(duì)序列進(jìn)行同源性分析，采用鄰近連接法（Neghbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育圖，確定其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的分類地位[26]。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵旺盛期糟醅中的酵母區(qū)系解析

選擇五糧液發(fā)酵旺盛期糟醅的上下層為研究對(duì)象，進(jìn)行高通量測(cè)序獲得五糧液發(fā)酵旺盛期糟醅上下層的酵母種屬以及相應(yīng)的豐度（序列條數(shù)reads），結(jié)果見表1。

由表1 可以看出，在五糧液發(fā)酵旺盛期糟醅中共檢測(cè)出9 個(gè)屬11 個(gè)種的酵母菌群，其中，豐度較高的種屬（優(yōu)勢(shì)種屬）包括Kazachstania exigua（82.97 %）、Saccharomyces cerevisiae（7.89%）、Kazachstania humilis（4.27%）、Pichia kudriavzevii（3.30%）4 個(gè)種屬，可以看出Kazachstania 酵母是糟醅中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)種屬，其可能是五糧液濃香型白酒發(fā)酵旺盛期中的主要功能酵母。上述5 個(gè)種之外的其他種屬酵母豐度均較低，其合計(jì)豐度不到2 %，這些酵母主要是Zygosaccharomyces bailii、Saccharomycopsis fibuligera、Trichosporon ovoides、Debaryomyces hansenii、Naumovozyma castellii、Pichia manshurica、Geotrichum silvicola 7 個(gè)種。

表1 發(fā)酵旺盛期糟醅中的酵母區(qū)系Table 1 Yeast flora in fermented grains at the main stage of fermentation

從酵母群體的空間分布來看，上層糟醅有9 個(gè)種屬的酵母，下層糟醅有11 個(gè)種屬的酵母，上層糟醅酵母種屬的多樣性少于下層糟醅的。其中下層糟醅比上層 糟 醅 多 了 Zygosaccharomyces bailii、Debaryomyces hansenii 這2 個(gè)種屬的酵母，這可能是由于下層糟醅中的含氧量較低、pH 值較低、溫度較高等正好適合這2種酵母種屬的生長(zhǎng)?？傮w上發(fā)酵旺盛期上、下層糟醅中的酵母區(qū)系構(gòu)成基本一致，但是同一口窖池不同層次糟醅的酵母群體之間還是存在著一定的差異性。

2.2 純培養(yǎng)酵母菌株的26S DNA序列鑒定

在7 種培養(yǎng)基上獲得的純培養(yǎng)酵母菌株，將在同種培養(yǎng)基上菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)都相同的純培養(yǎng)菌株進(jìn)行合并，最后這7 種培養(yǎng)基共剩余57 株純培養(yǎng)酵母菌株，再對(duì)菌株的26S rDNA 序列進(jìn)行測(cè)序，最后對(duì)測(cè)序結(jié)果獲得的26S DNA 序列進(jìn)行同源序列搜索后，運(yùn)用CLUSTAL W 軟件比對(duì)以及使用MEGA 6.0 進(jìn)行同源性分析后采用鄰近連接法（Neghbor-joining）1000次重復(fù)自展構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育圖，見圖1。

圖1 純培養(yǎng)酵母菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.1 Phylogenetic analysis of yeast isolates based on 26S rDNA sequence

從圖1 可以看出，從五糧液發(fā)酵旺盛期糟醅中分離到的酵母純培養(yǎng)菌株共有57 株，分屬于3 個(gè)屬4個(gè)種，是 Pichia kudriavzevii、Saccharomyces cerevisiae、Candidaglabrata 和Candidarugosa，分別占總純培養(yǎng)酵母菌株的 58.9 %、21.4 %、1.8 %、17.9 %，其中 Candida glabrata 在其他濃香型白酒中并沒有分離到，這可能是五糧液濃香型白酒中特有的酵母菌株。同時(shí)，聚在同一分支上的酵母菌株的26SrDNA 序列盡管幾乎完全一致，但其菌株的菌落、細(xì)胞形態(tài)或氣味等方面仍存在不同程度的差異，表明濃香型白酒發(fā)酵旺盛期糟醅中的酵母菌株具有明顯的種內(nèi)分化現(xiàn)象，但那些與濃香型白酒釀造密切相關(guān)的表觀特征（如氣味）與特征序列的關(guān)聯(lián)并不明確，因此實(shí)際工作中，僅依靠特征序列分析從濃香型白酒糟醅中篩選得到具有優(yōu)良釀造特性的酵母菌株存在較大困難。

2.3 純培養(yǎng)方法與免培養(yǎng)方法比較

將高通量測(cè)序獲得的五糧液發(fā)酵旺盛期糟醅酵母群體與在7 種培養(yǎng)基上分離到的57 株純酵母菌株經(jīng)過26Sr DNA 測(cè)序后，與NCBI 上的模式菌株比對(duì)后獲得的相似性大于99%的種進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果見表2。

表2 純培養(yǎng)酵母種屬與高通量種屬比較Table 2 Comparison of pure cultured yeast species and highthroughput species

由表2 可以看出，濃香型白酒發(fā)酵旺盛期糟醅中的酵母包括 Zygosaccharomyces bailii、Kazachstania exigua、Geotrichum silvicola、Pichia kudriavzevii、Kazachstania exigua humilis 等9 個(gè)屬13 個(gè)種，高通量測(cè)序可檢測(cè)到除Candida glabrata 和 Candida rugosa 外的 11 個(gè)種，純培養(yǎng)法僅分離到 Pichia kudriavzevi、Saccharomyces cerevisiae、Candida glabrata 和 Candida rugosa 4個(gè)種，有 80%的酵母種屬?zèng)]有被分離出來，表明高通量測(cè)序用于檢測(cè)濃香型白酒發(fā)酵旺盛期糟醅中的酵母群體明顯好于純培養(yǎng)法，這可能主要是由于發(fā)酵旺盛期糟醅中優(yōu)勢(shì)酵母的生長(zhǎng)干擾了非優(yōu)勢(shì)酵母的分離，針對(duì)這一問題，后續(xù)可在高通量測(cè)序結(jié)果的指導(dǎo)下，充分利用營(yíng)養(yǎng)及培養(yǎng)條件的組合，設(shè)計(jì)培養(yǎng)組學(xué)方法，分離糟醅中的非優(yōu)勢(shì)酵母。一方面可設(shè)計(jì)選擇性更強(qiáng)的培養(yǎng)基來抑制優(yōu)勢(shì)種屬酵母菌的生長(zhǎng)，分離目的種屬酵母，如設(shè)計(jì)以木糖作為唯一碳源并耐高滲透壓的培養(yǎng)基分離高度耐鹽的Debaryomyces 屬酵母[27]；利用高滲透壓高酸培養(yǎng)基、并在較高溫度下培養(yǎng)，分離耐鹽、耐酸及耐高溫（可在 40 ℃～50 ℃下生長(zhǎng)）的 Kazachstania 屬酵母[28]；設(shè)計(jì)耐酸培養(yǎng)基分離可耐受pH2.0 的Zygosaccharomyces 屬酵母[29]；設(shè)計(jì)以木糖為唯一碳源且可耐受 pH 7.0 的培養(yǎng)基分離 Trichosporon 屬酵母[30]，設(shè)計(jì)耐堿的培養(yǎng)基并在較低溫度下培養(yǎng)，分離耐堿（pH 11.0）及耐低溫（6 ℃）的 Geotrichum 屬酵母[31]。另一方面，針對(duì)某些特殊營(yíng)養(yǎng)需求的酵母，也可通過添加糟醅提取物來滿足其營(yíng)養(yǎng)需求。

3 討論

同時(shí)利用高通量測(cè)序技術(shù)與純培養(yǎng)方法解析濃香型白酒發(fā)酵旺盛期糟醅中的酵母群體，發(fā)現(xiàn)濃香型白酒發(fā)酵旺盛期糟醅中的酵母包括Zygosaccharomyces bailii、Saccharomycopsis fibuligera、Trichosporon ovoides、Debaryomyces hansenii、Naumovozyma castellii、Pichia manshurica、Kazachstania exigua、Geotrichum silvicola、Pichia kudriavzevii、Saccharomyces cerevisiae、Candida humilis 等 13 個(gè)種屬，且 Kazachstania exigua、Pichia kudriavzevii、Saccharomyces cerevisiae、Candida humilis 為優(yōu)勢(shì)種。在醬香型白酒釀造過程中Zygosaccharomyces bailii、Saccharomyces cerevisiae 及 Schizosaccharomyce spombe 為優(yōu)勢(shì)種屬[32]；在清香型白酒釀造過程中 Saccharomycopsis fibuligera、Pichia anomala及Saccharomyces cerevisiae 為優(yōu)勢(shì)種屬[33]，通過對(duì)濃香型白酒與醬香型、清香型白酒釀造過程中的優(yōu)勢(shì)酵母種屬的比較，發(fā)現(xiàn)不同香型的白酒在釀造過程中的優(yōu)勢(shì)種屬之間存在著一定的差別，而這些差別的優(yōu)勢(shì)酵母群體可能在白酒風(fēng)味形成過程中有重要的貢獻(xiàn)，后續(xù)還需利用分離到的純培養(yǎng)菌株，通過單獨(dú)或混合發(fā)酵試驗(yàn)來進(jìn)一揭示其各種屬的不同代謝特征。

另外，盡管使用了7 種各具特色的培養(yǎng)基來分離五糧液發(fā)酵旺盛期糟醅中的酵母菌株，獲得了57 株形態(tài)各不相同的純培養(yǎng)酵母菌株，但分離到的酵母種屬也遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于高通量測(cè)序檢測(cè)到的種屬，一方面說明純培養(yǎng)法仍存在較大局限，需要在高通量測(cè)序結(jié)果的指導(dǎo)下進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)組學(xué)方法，另一方面，高通量測(cè)序結(jié)果無法反映種內(nèi)的酵母形態(tài)及釀造特性多樣性，需要通過分離大量純培養(yǎng)菌株開展進(jìn)一步研究。