亮丙瑞林反加不同劑量雌激素對大鼠子宮異位內(nèi)膜生長的影響及相關(guān)機(jī)制研究

殷金鳳 付 瓊 宋 玲 胡 婷 熊萬春

四川省成都市第二人民醫(yī)院(610000)

子宮內(nèi)膜異位癥是一種雌激素相關(guān)性疾病,減緩病灶復(fù)發(fā)的重要環(huán)節(jié)在于減少內(nèi)源性雌激素產(chǎn)生[1]。反添加療法可有效減輕低雌激素癥狀,但該療法的開始時間和用藥方案并無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)[2]。本實(shí)驗(yàn)通過自體移植制備子宮內(nèi)膜異位癥大鼠模型,采取亮丙瑞林反添加不同劑量的雌激素治療,通過觀察給藥前后病灶體積變化、病灶組織類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白(StAR)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的表達(dá)及血清糖類抗原125(CA125)濃度變化,評價亮丙瑞林反添加不同劑量雌激素對大鼠子宮異位內(nèi)膜生長的影響及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 建立動物模型

75只SPF級健康SD雌性大鼠,8～9周齡,體重180～210 g,購自上海凱學(xué)生物科技有限公司。動物模型的建立：大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后,皮下注射苯甲酸雌二醇(上海通用藥業(yè)股份有限公司)0.10 mg/kg,使之處在同一動情周期。禁食禁飲12 h后7%水合氯醛麻醉,于下腹正中、尿道口上端1 cm作一2～3 cm縱行切口,結(jié)扎子宮系膜血管,隨后結(jié)扎需切除的子宮段兩端,分離子宮內(nèi)膜。在腹壁切口兩側(cè)作一隧道,放置分離的子宮內(nèi)膜并緊貼肌層,切口縫合,術(shù)后每日肌內(nèi)注射慶大霉素0.10 ml,共3 d,預(yù)防感染。

1.2 分組及給藥方法

造模后4周將大鼠隨機(jī)分為模型組、亮丙瑞林組、低劑量組、中劑量組、高劑量組,每組各15只。模型組予以生理鹽水3 ml灌胃；亮丙瑞林組皮下注射用醋酸亮丙瑞林微球(上海麗珠制藥有限公司)1 mg/kg,給藥第2周時予以生理鹽水3 ml灌胃反添加,1次/d,共2周；給藥第2周時,低、中、高劑量組開始每日予以戊酸雌二醇(浙江仙琚制藥股份有限公司)25、50、100 g/kg灌胃,1次/d,共2周。反添加療法的戊酸雌二醇用量為每日0.25～1.0 mg(體重按60 kg計)[3-5],對應(yīng)大鼠的用藥劑量為25～100 g/kg,故本實(shí)驗(yàn)中設(shè)定戊酸雌二醇的3個劑量分別為25、50、100 g/kg。

1.3 異位病灶檢測

分別于給藥前和給藥后4周、8周,各組均取5只大鼠開腹探查,測量異位病灶體積,計算公式(mm3)=長×寬2×0.5。免疫組織化學(xué)法檢測大鼠異位病灶組織,將病灶組織4%多聚甲醛溶液固定24 h,石蠟包埋,連續(xù)切片,經(jīng)DAB顯色(武漢博士德生物工程有限公司),復(fù)染、脫水、透明、封片,檢測組織中StAR和TNF-α的分布和表達(dá)情況。結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)：采用半定量分析法,根據(jù)著色程度和陽性細(xì)胞數(shù)占比評分,著色程度分為無著色(0分),淡黃色、輕微黃色(1分),棕黃色、深黃色(2分),黑褐色、棕褐色(3分)；陽性細(xì)胞數(shù)占比分為≤5%(0分)、6%～25%(1分)、26%～50%(2分)、51%～75%(3分)、76%～100%(4分)。兩項評分相乘為最終結(jié)果。

1.4 血清CA125 檢測

取大鼠眼眶內(nèi)眥靜脈叢血,4℃離心取上清液-80℃保存,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法測定血清CA125濃度,試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 子宮內(nèi)膜異位癥大鼠病灶組織觀察

造模期間未出現(xiàn)大鼠死亡情況。肉眼觀察可見大鼠異位病灶內(nèi)存在透亮液體,病灶呈囊泡樣,表面被覆豐富脂肪組織,移植物可見新生血管爬行生長,周圍可見豐富的結(jié)締組織；經(jīng)蘇木精-伊紅染色可見異位病灶上皮細(xì)胞核下空泡,細(xì)胞呈柱狀排列,間質(zhì)層較薄,可見少量腺體。見圖1(封二)。

2.2 各組大鼠給藥前后病灶體積變化

各組大鼠給藥前病灶體積比較無差異(t=0.32～1.01,P>0.05)；模型組給藥4、8周后病灶體積大于給藥前(t=7.97、11.28,均P<0.05)；亮丙瑞林組和低、中、高劑量組給藥4、8周后病灶體積較給藥前縮小(t=8.07～15.85,均P<0.05),且給藥8周后病灶體積較給藥后周4增大(t=5.03、8.18、10.84、19.63,均P<0.05)；亮丙瑞林組和低、中、高劑量組給藥后4、8周后病灶體積小于模型組(t=10.32～23.95,均P<0.05),中、高劑量組給藥8周后病灶體積大于亮丙瑞林組和低劑量組(t=8.75、17.06、10.21、12.84,均P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠給藥前后病灶體積比較

2.3 各組大鼠給藥前后病灶組織StAR 和TNF-α 表達(dá)比較

StAR和TNF-α蛋白陽性細(xì)胞呈褐色、棕黃色,二者均主要定位于子宮內(nèi)膜異位癥病灶內(nèi)膜組織腺上皮細(xì)胞漿中,StAR少量分布于在位內(nèi)膜,TNF-α少量分布于間質(zhì)細(xì)胞漿。各組大鼠給藥前腹壁異位病灶組織StAR和TNF-α表達(dá)水平無差異(t=0.12～1.03,均P>0.05)；模型組給藥后4周StAR表達(dá)與給藥前無差異(P>0.05),8周時低于給藥前(P<0.05),給藥前后TNF-α表達(dá)無差異(均P>0.05)；相比給藥前,亮丙瑞林組和低、中、高劑量組給藥后4周StAR和TNF-α表達(dá)量均下降,中、高劑量組給藥后8周TNF-α表達(dá)量高于給藥后4周(均P<0.05)；亮丙瑞林組和低、中、高劑量組給藥后4周StAR和TNF-α表達(dá)無差異(均P>0.05)；相比模型組,亮丙瑞林組和低、中、高劑量組給藥后4周StAR和TNF-α表達(dá)量均下降,中、高劑量組給藥后8周StAR和TNF-α表達(dá)量較亮丙瑞林組和低劑量組升高(均P<0.05)。見圖2(封二)和表2。

表2 各組大鼠給藥前后病灶組織StAR 、TNF-α 表達(dá)比較

(接下表)

2.4 各組大鼠給藥前后血清CA125 濃度比較

血清CA125濃度,各組大鼠給藥前比較無差異(P>0.05)；相比模型組,亮丙瑞林組和低、中、高劑量組給藥后4、8周濃度均下降,中、高劑量組給藥后8周濃度較給藥后4周升高(P<0.05),且高于亮丙瑞林組和低劑量組(均P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠給藥前后血清CA125 濃度比較

3 討論

促性腺激素釋放激素受體激動劑可快速降低血清雌二醇含量,臨床廣泛用于子宮內(nèi)膜異位癥治療[6],但長期使用可能會引起低雌激素血癥,出現(xiàn)不可逆的骨丟失等,臨床應(yīng)用受限[7-9]。長時間低雌激素血癥可導(dǎo)致原始卵泡減少、卵泡閉鎖,使卵巢功能下降[10-11]。近年來提出反添加療法,即聯(lián)合應(yīng)用促性腺激素釋放激素受體激動劑和類固醇激素[12],如何控制用藥時間和用量仍是目前亟需解決的問題,并且脈沖式加用性激素是否會影響隱伏的雌激素敏感組織,使疾病提前復(fù)發(fā)的問題亦值得研究。

本研究中,相比模型組,亮丙瑞林組和低、中、高劑量組給藥后4、8周病灶體積和血清CA125濃度均明顯下降,表明亮丙瑞林可有效治療大鼠子宮內(nèi)膜異位癥,療效肯定。且亮丙瑞林組和低、中、高劑量組給藥后8周病灶體積較給藥后4周增大,中、高劑量組體積增加的更大。結(jié)果說明,停藥后可能會出現(xiàn)子宮異位內(nèi)膜生長的傾向,而反添加給予中、高劑量雌激素(50、100 g/kg)后病灶體積明顯大于低劑量雌激素(25 g/kg)組和單一應(yīng)用亮丙瑞林組,同時中、高劑量組給藥后8周血清CA125濃度較給藥后4周均顯著升高,說明反添加給予中、高劑量雌激素可能會加速子宮異位內(nèi)膜的生長。

TNF-α是由激活的巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞等產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子[13]。在生理狀態(tài)下可參與并調(diào)節(jié)抗腫瘤、免疫監(jiān)視、胚胎著床及卵泡發(fā)育等重要生物學(xué)過程；病理狀態(tài)下具有介導(dǎo)免疫和炎癥反應(yīng)作用[14-15]。在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生發(fā)展過程中,TNF-α參與并調(diào)節(jié)新生血管生成、炎癥浸潤及粘連形成等。TNF-α既可促進(jìn)多種炎癥細(xì)胞因子的釋放,亦可誘導(dǎo)間質(zhì)細(xì)胞及間皮間黏附,促進(jìn)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生,在子宮內(nèi)膜異位癥病理過程中起重要作用[16-17]。本研究中,給藥前TNF-α高表達(dá)于大鼠子宮內(nèi)膜異位癥病灶組織,說明高表達(dá)的TNF-α可能誘導(dǎo)了病情的發(fā)生發(fā)展；亮丙瑞林組和低、中、高劑量組給藥后周4TNF-α表達(dá)量均下降,說明亮丙瑞林反添加雌激素對子宮內(nèi)膜異位癥大鼠的治療效果；中、高劑量組給藥后周8TNF-α表達(dá)量較亮丙瑞林組和低劑量組均升高,表明中、高劑量雌激素可能通過增強(qiáng)TNF-α的表達(dá)而促進(jìn)了子宮異位內(nèi)膜的生長。

作為類固醇激素產(chǎn)生的一種主要限速酶,StAR可使膽固醇從線粒體的外膜轉(zhuǎn)至內(nèi)膜,可在芳香化酶和P450scc等其它類固醇激素合成酶作用下對雌二醇進(jìn)行合成[18-19]。本研究顯示,給藥前StAR高表達(dá)于大鼠子宮內(nèi)膜異位癥病灶組織,推測StAR可能參與了子宮內(nèi)膜異位癥的病理過程；而亮丙瑞林組和低、中、高劑量組給藥4周后StAR表達(dá)量均下降,中、高劑量組給藥8周后StAR表達(dá)量較亮丙瑞林組和低劑量組升高。表明中、高劑量雌激素可能通過促進(jìn)StAR的高表達(dá)而誘導(dǎo)大鼠子宮異位內(nèi)膜生長。

綜上所述,亮丙瑞林反添加低劑量雌激素(25 g/kg)對子宮內(nèi)膜異位癥大鼠治療可能有更佳效果,而添加中、高劑量雌激素(50g/kg、100 g/kg)可能會促進(jìn)異位內(nèi)膜生長,其機(jī)制可能與提高了StAR、TNF-α表達(dá)及CA125濃度密切相關(guān)。但本實(shí)驗(yàn)樣本量較少,且觀察時間較短,尚需大樣本、長時間的研究和臨床應(yīng)用的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。