食用菌中尼古丁的毛細(xì)管電泳檢測方法研究

時(shí)文興 林 淼 邵 毅 金曉芬 劉海燕 趙劉旻*

（1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，上海奉賢201403；2上海市設(shè)施園藝技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海奉賢201403）

尼古丁又名煙堿，是存在于茄科植物的一種生物堿。尼古丁會(huì)使人上癮或產(chǎn)生依賴性[1]，會(huì)增加心跳速度和升高血壓并降低食欲，大劑量的尼古丁會(huì)引起嘔吐以及惡心，嚴(yán)重時(shí)會(huì)致死。較小劑量尼古丁可短暫刺激興奮嘔吐中樞，同時(shí)對(duì)自主神經(jīng)節(jié)、腎上腺髓質(zhì)、前肢動(dòng)作發(fā)展造成影響，降低人體顆粒細(xì)胞水平[2-3]。尼古丁急性中毒初始，出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉、出汗、流涎、心動(dòng)過速、血壓升高、呼吸增快、頭昏、眩暈、煩躁不安、怕光、視聽覺障礙等。Castro等[4]首次用放射免疫法提供可靠數(shù)據(jù)，證明茄類蔬菜如番茄、土豆中也含有尼古丁。

食用菌因其高蛋白、低脂肪、富含維生素、礦物質(zhì)和膳食纖維并且風(fēng)味獨(dú)特逐漸受到人們關(guān)注，成為餐桌上的新寵。歐盟食品安全委員會(huì)（EFSA)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，歐盟市場上99%的野生菌樣品中尼古丁含量均超出其法定最高限量0.01 mg/kg，且多數(shù)來自中國。該食品安全委員迫于食用菌輸出國政府、歐盟進(jìn)口商和生產(chǎn)商組織的壓力，已作出限量緊急修訂，EFSA建議食用菌鮮品和干品中尼古丁最高限量分別為0.036 mg/kg和1.17 mg/kg。2009年一月份云南出口德國的牛肝菌尼古丁含量超標(biāo)，雖經(jīng)調(diào)查牛肝菌中的尼古丁是來自內(nèi)源代謝產(chǎn)物而非加工污染，但這一事件還是給我國食用菌行業(yè)敲響了警鐘，對(duì)食用菌中尼古丁含量的監(jiān)控和檢測刻不容緩。

毛細(xì)管電泳分析法[5]測定食用菌中尼古丁含量，分離效率高，測定速度快，分離與測量同步進(jìn)行，重現(xiàn)性好，回收率高，過程無污染，越來越受到科研工作者的關(guān)注?，F(xiàn)將其優(yōu)化電泳方法介紹如下。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試劑

市售牛肝菌干品、鮮品，香菇鮮品，木耳干品。化學(xué)試劑：酒石酸（分析純）、氫氧化鈉（分析純）、甲醇。尼古丁標(biāo)準(zhǔn)品購自sigma公司。標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液：稱取適量的尼古丁標(biāo)準(zhǔn)品，用去離子水配制成濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4℃保存，一個(gè)月為限。

尼古丁工作標(biāo)準(zhǔn)液：分別移取適量的尼古丁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用去離子水配制，濃度分別為0.005 μg/mL、0.010 μg/mL、0.050 μg/mL、0.100 μg/mL、0.500 μg/mL。

1.2 主要儀器

分析天平（精確到0.1 mg）、高速組織搗碎機(jī)（10 000 r/min～12 000 r/min）、超聲波提取儀、高速離心機(jī)、毛細(xì)管電泳儀（配有紫外檢測器）。石英毛細(xì)管：50 μm×60 cm，有效長度45 cm（河北永年光導(dǎo)纖維廠）。檢測器：紫外檢測器。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 提取條件的確定

考察提取方式、提取溫度和提取時(shí)間對(duì)食用菌鮮樣（牛肝菌、香菇）和食用菌干樣（牛肝菌、木耳）中尼古丁測定的影響，確定了食用菌中尼古丁的最佳提取條件。

取牛肝菌、香菇鮮樣和牛肝菌、木耳干樣，以去離子水作為提取劑，分別采用振蕩（20 min，40℃）、超聲（20 min，40℃）、高速均質(zhì)（1 min）方式提取。因?yàn)橄愎胶湍径鷺悠分胁缓心峁哦?，因此?duì)此兩種樣品進(jìn)行了加標(biāo)。香菇樣品加標(biāo)量為0.05 mg/kg，木耳樣品加標(biāo)量為1.00 mg/kg。最終確定提取方式。

取牛肝菌和木耳干樣樣品（木耳樣品加標(biāo)量為1.00 mg/kg）。以去離子水作為提取劑，采用超聲提取法，不同的提取溫度（40℃、50℃、60℃、70℃、80℃），提取時(shí)間為40 min。最終確定提取溫度。

牛肝菌和香菇鮮樣（香菇中加標(biāo)量為0.05 mg/kg）采用高速均質(zhì)的提取法，提取時(shí)間分別設(shè)為1 min、2 min和3 min和4 min；牛肝菌干樣和木耳干樣（木耳樣品加標(biāo)量為1.00 mg/kg），去離子水作為提取劑，采用60℃超聲的方式進(jìn)行提取。提取時(shí)間設(shè)為 10 min、15 min、20 min、25 min和 30 min。最總確定提取時(shí)間。

1.3.2 電泳參數(shù)確定

確定優(yōu)化緩沖液、緩沖液pH、緩沖液濃度、電泳電壓等參數(shù)。采用350 mmol/L的酒石酸緩沖溶液，用5 mol/L的氫氧化鈉溶液分別調(diào)節(jié)pH為2.8、3.0、3.2、3.4、3.6，上機(jī)分析，確定pH；試驗(yàn)分別選取了濃度 為 320 mmol/L、335 mmol/L、350 mmol/L、365 mmol/L、380 mmol/L的緩沖溶液，以確定最佳緩沖液濃度。

1.3.3 方法性能檢驗(yàn)

根據(jù)本試驗(yàn)涉及的尼古丁在常見食用菌中的含量范圍，設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液的梯度濃度為0.005 μg/mL、0.010 μg/mL、0.050 μg/mL、0.100 μg/mL、0.500 μg/mL。用上述毛細(xì)管電泳條件檢測并計(jì)算，獲得尼古丁的線性方程。

方法準(zhǔn)確度試驗(yàn)，選用3種常見的食用菌樣品（香菇鮮樣、牛肝菌鮮樣、木耳干樣、牛肝菌干樣）作為基質(zhì)做添加回收試驗(yàn)。食用菌鮮樣按照0.025 mg/kg、0.05 mg/kg和0.1 mg/kg加標(biāo)。食用菌干樣按照0.5 mg/kg、1 mg/kg和2 mg/kg加標(biāo)。

重復(fù)性試驗(yàn)，將牛肝菌鮮樣和牛肝菌干樣按優(yōu)化后處理方法處理后上機(jī)檢測，每個(gè)樣品重復(fù)5次。以樣品中尼古丁的含量測定結(jié)果計(jì)算日內(nèi)變異系數(shù)，以三批測定結(jié)果計(jì)算日間變異系數(shù)。

根據(jù)公式“檢出限=（W×3）/（S/N）”計(jì)算儀器檢出限；根據(jù)公式“定量限=（W×10）/（S/N）”計(jì)算食用菌樣品的方法定量限。式中：W為目標(biāo)檢測物的濃度（μg/mL）；S/N為儀器信噪比。

表1 提取方式對(duì)食用菌中尼古丁提取效果的影響

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的優(yōu)化確定

2.1.1 提取方式的選擇

各種提取方式對(duì)食用菌樣品尼古丁的提取影響見表1。結(jié)果表明，食用菌鮮樣中尼古丁高速均質(zhì)提取效果最好，因此鮮樣采用高速均質(zhì)法提取。同樣的提取時(shí)間和提取溫度，用超聲提取食用菌干樣中尼古丁效果最好，因此食用菌干樣選用超聲法提取。

2.1.2 提取溫度的選擇

高速均質(zhì)方法提取鮮樣中尼古丁，因均質(zhì)過程中溫度在逐漸升高且無法精準(zhǔn)控制，所以只測定干樣的提取溫度，結(jié)果見表2。由表2可知，提取溫度40℃、50℃、60℃，隨著提取溫度的上升，食用菌干樣中尼古丁的提取量也呈上升趨勢，此后尼古丁提取量未隨著溫度的上升而上升，因此最終確定超聲提取食用菌干樣中尼古丁，適宜提取溫度為60℃。

表2 提取溫度對(duì)食用菌干樣中尼古丁提取效果的影響

2.1.3 提取時(shí)間的選擇

高速均質(zhì)提取食用菌鮮樣中尼古丁，2 min的提取量最大，此后尼古丁提取量未隨均質(zhì)時(shí)間延長而上升，選擇食用菌鮮樣的高速均質(zhì)時(shí)間為2 min；超聲提取，食用菌干樣中尼古丁，提取時(shí)間達(dá)到20 min時(shí)提取量最大，此后尼古丁的提取量未隨提取時(shí)間增加而上升，因此確定食用菌干樣的超聲提取時(shí)間為20 min。

2.2 電泳參數(shù)確定

2.2.1 緩沖溶液的選擇

毛細(xì)管電泳，緩沖液起著保持管壁雙電層穩(wěn)定的重要作用，同時(shí)不同的緩沖體系會(huì)產(chǎn)生不同的分離效果。因此選擇合適的緩沖體系十分必要，緩沖溶液須穩(wěn)定、不電解且不與目標(biāo)分析物產(chǎn)生氣體或沉淀等化學(xué)反應(yīng)。尼古丁的電泳分析，一般采用磷酸鹽緩沖液和酒石酸緩沖液，但是酒石酸緩沖較磷酸鹽緩沖液，峰更高，也有效降低了該分析方法對(duì)尼古丁的檢測限，因此選擇酒石酸緩沖溶液為本方法的緩沖體系。

2.2.2 緩沖溶液pH的選擇

緩沖溶液的pH直接影響毛細(xì)管表面的電荷密度，pH的變換能明顯改變分析物的電荷和電滲流的大小，影響分離效率。上機(jī)后分析表明，隨著pH的上升，樣品出峰時(shí)間逐漸縮短，峰面積也逐漸變??；隨著pH的下降，峰面積逐漸變大，出峰時(shí)間逐漸延長，且峰形變寬。綜合考慮檢測效率及峰形，選取酒石酸緩沖溶液pH為3.2。

2.2.3 緩沖溶液濃度的選擇

為了保持緩沖溶液的pH的穩(wěn)定性，通常緩沖溶液要保持一定的濃度。濃度低則緩沖能力差，電滲流不穩(wěn)定，分析結(jié)果重現(xiàn)性差。濃度增加則緩沖能力增加，毛細(xì)管內(nèi)壁擴(kuò)散層厚度下降，改善峰形；但是濃度過高則會(huì)使電流增大，產(chǎn)生的熱效應(yīng)會(huì)引起峰展寬，不利于分析物的分離。在試驗(yàn)中考慮檢測效率及峰形，最終選擇酒石酸緩沖溶液濃度為350 mmol/L。

2.2.4 電泳電壓的選擇

毛細(xì)管電泳的分離效率和分離度與電泳電壓有線性關(guān)系。電泳的電壓低，樣品出峰時(shí)間變長，柱效低分離度變低。電壓高，樣品遷移快，柱效高，但是電壓過高會(huì)導(dǎo)致電流增加，引起毛細(xì)管中產(chǎn)生大量焦耳熱，影響溶質(zhì)遷移速度造成區(qū)帶展寬，柱效下降，所以選擇的分析電壓為12 kV。

尼古丁標(biāo)準(zhǔn)溶液毛細(xì)管電泳圖如圖1所示。

圖1 0.02 μg/mL尼古丁標(biāo)準(zhǔn)溶液電泳譜圖

2.3 方法性能檢驗(yàn)

根據(jù)毛細(xì)管電泳條件檢測計(jì)算，得出尼古丁的線性方程為Y=16.9832X+0.1703，R2=0.9995。方法準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果表明，尼古丁在食用菌樣品中的加標(biāo)回收率為76.1%～103.2%，證明該方法的準(zhǔn)確度較高。重復(fù)性試驗(yàn)中日內(nèi)變異系數(shù)在1.09%～2.83%，鮮樣和干樣的日間變異系數(shù)分別為2.75%和1.62%。且通過計(jì)算，方法檢出限0.001 μg/mL，定量限為0.003 μg/mL。

應(yīng)用上述方法，對(duì)代表性食用菌品種（牛肝菌、木耳）中的尼古丁進(jìn)行了測定，測定譜圖如圖2和圖3（木耳干樣未檢出）。結(jié)果表明：本方法原理明確，測定方法科學(xué)合理，方法簡單快速，兼容性強(qiáng)，整個(gè)方法的靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度均符合食用菌產(chǎn)品測定的要求，滿足目前對(duì)食用菌產(chǎn)品中尼古丁的測定要求。

圖2 牛肝菌鮮樣電泳譜圖

圖3 木耳干樣電泳譜圖

3小結(jié)

試驗(yàn)結(jié)果表明，毛細(xì)管電泳－紫外檢測的準(zhǔn)確性、選擇性、重現(xiàn)性均良好，是一種有效定性定量分析食用菌中尼古丁含量的新方法。最優(yōu)化條件：以酒石酸緩沖溶液，pH為3.2，濃度為350 mmol/L，進(jìn)樣時(shí)間10 s，分析電壓12 kV，紫外檢測器波長254 nm，尼古丁與其他雜質(zhì)在12 min內(nèi)可基本實(shí)現(xiàn)基線分離。該方法高效、簡單、穩(wěn)定，適用于食用菌中尼古丁的檢測，能滿足對(duì)食用菌產(chǎn)品安全監(jiān)控的要求。