不同肌腱處理方法對(duì)同種異體肌腱生物學(xué)性能的影響

張?jiān)隽?胡先同 牛國(guó)珍 張迎龍 李利 趙彥濤

肌腱和韌帶損傷或撕裂是臨床常見(jiàn)問(wèn)題，常用自體肌腱移植進(jìn)行修復(fù)，能夠取得較好的效果。但自體可用肌腱的數(shù)量有限，且供區(qū)往往存在較多的并發(fā)癥[1-2]。同種異體肌腱具有來(lái)源充足、免疫原性低、強(qiáng)度與自體肌腱相似等優(yōu)點(diǎn)。隨著供體捐獻(xiàn)系統(tǒng)的不斷完善，同種異體肌腱移植逐漸成為目前修復(fù)肌腱缺損最理想的方法。因此，為了減少移植后的不良反應(yīng)，同種異體肌腱的處理方法顯得尤為重要。在本研究中，為了篩選出最佳的肌腱處理方法，筆者研究了四種同種異體肌腱處理方法對(duì)肌腱生物學(xué)性能的影響，為同種異體肌腱的研制和應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料與方法

一、主要試劑、材料

同種異體肌腱 ( 解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)院中心組織庫(kù) )、TnBP ( 天津大茂化學(xué)試劑廠 )、Triton X-100( 天津大茂化學(xué)試劑廠 )、異丙醇 ( 天津大茂化學(xué)試劑廠 )、胰蛋白酶 ( 索萊寶 )、中性甲醛溶液 ( 索萊寶 )、CCK8 試劑 ( 大連美侖 )。

二、處理方法

脫細(xì)胞肌腱的制備：根據(jù)前期工藝研究，選擇四種方法制備脫細(xì)胞肌腱。A 組，1% TnBP 處理12 h，純化水洗 3 次，每次 30 min，然后 1% Triton X-100 處理 12 h，純化水洗 3 次，每次 30 min，冷凍干燥；B 組，0.5% 胰蛋白酶處理 6 h，純化水洗3 次，每次 30 min，然后 0.5% Triton X-100 處理18 h，純化水洗 3 次，每次 30 min，冷凍干燥；C 組，1% TnBP 處理 24 h，純化水洗 3 次，每次30 min，冷凍干燥；D 組，1% Triton X-100 處理18 h，純化水洗 3 次，每次 30 min，70% 異丙醇處理6 h，純化水洗 3 次，每次 30 min，冷凍干燥。

大體觀察：四種方法處理肌腱后，觀察肌腱的大體形態(tài)。

去細(xì)胞效果觀察：取處理后的各組脫細(xì)胞肌腱，中性甲醛溶液固定 24 h，梯度脫水、包埋，制作蠟塊，并制作 5 μm 石蠟切片，然后進(jìn)行 HE 染色，鏡下觀察各組肌腱去細(xì)胞效果。

細(xì)胞毒性檢測(cè)：將各組的肌腱剪成 0.2 g 的片段，獨(dú)立包裝，進(jìn)行輻照滅菌，輻照劑量為 25 kGy。參照 GB / T16886.5 的方法，將輻照滅菌后的各組肌腱按 0.2 g / ml 的比例浸入含 10% 胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基中，37 ℃ 浸提 24 h 制作浸提液。同時(shí)將 L929細(xì)胞按 1×105/ ml 的細(xì)胞密度接種到 96 孔板中，24 h 后，各組加入對(duì)應(yīng)的細(xì)胞浸提液，空白對(duì)照組( BC ) 加入新鮮全培，陰性對(duì)照組 ( NC ) 加入鈦合金浸提液，陽(yáng)性對(duì)照組 ( PC ) 加入含 5% ( v / v ) 二甲基亞砜的全培。繼續(xù)培養(yǎng)后 24 h，用 CCK8 法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖情況，評(píng)價(jià)各組肌腱的細(xì)胞毒性。

細(xì)胞黏附觀察：將各組肌腱分別剪成合適的大小，輻照滅菌后置于 24 孔板中，制備 MC3T3-E1 細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度 1×105/ ml，將細(xì)胞懸液加入放置各組肌腱的 24 孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)后 72 h，掃描電鏡觀察細(xì)胞在各組肌腱上的黏附情況。

兔皮內(nèi)刺激實(shí)驗(yàn)：各組肌腱分別用生理鹽水( SC，極性 ) 和棉籽油 ( SSO，非極性 ) 按 0.2 g / ml的比例進(jìn)行浸提，37 ℃ 浸提 72 h。然后將浸提液按照?qǐng)D1 所示的點(diǎn)位注射到兔的背部皮內(nèi)，每個(gè)點(diǎn)位注射 0.2 ml。24 h 后觀察并記錄每個(gè)點(diǎn)位是否有紅腫和焦痂出現(xiàn)。

結(jié) 果

一、大體觀察及 HE 染色結(jié)果

如圖2 所示，四種方法處理后，各組肌腱的顏色、形態(tài)均未有顯著的變化 ( 圖2a )。HE 染色結(jié)果顯示，B 組去除細(xì)胞最徹底，纖維排列整齊，結(jié)構(gòu)完整；其它組均觀察到有少部分細(xì)胞殘留 ( 圖2b )。

二、細(xì)胞毒性結(jié)果

CCK8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，A 組和 C 組處理的肌腱細(xì)胞毒性較大，為二級(jí)毒性，B 組和 D 組處理的肌腱細(xì)胞毒性較小，為 1 級(jí)毒性 ( 圖3 )。

圖1 兔背部注射孔排列示意圖Fig.1 Schematic diagram of injection holes on the rabbit back

圖2 肌腱大體照片及 HE 染色圖 ( 200 × )Fig.2 General photos and HE staining pictures of the allogeneic tendon ( 200 × )

三、各組肌腱細(xì)胞黏附情況

掃描電鏡觀察細(xì)胞黏附狀態(tài)。結(jié)果顯示，四組材料表面均有細(xì)胞黏附，A 組和 C 組處理的肌腱上細(xì)胞黏附數(shù)量較少，且基本呈現(xiàn)圓形；D 組處理的肌腱上細(xì)胞黏附數(shù)量較多，細(xì)胞狀態(tài)較好；B 組處理的肌腱上細(xì)胞黏附數(shù)量最多，細(xì)胞成片生長(zhǎng)，狀態(tài)較好 ( 圖4 )。

四、皮內(nèi)刺激結(jié)果

兔背部皮內(nèi)刺激實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組極性和非極性浸提液注射后均未出現(xiàn)紅腫和焦痂，平均記分均為 0 ( 圖5 )。

圖3 四種方法處理肌腱的細(xì)胞毒性Fig.3 Cytotoxicity of tendons treated with four methods

圖4 MC3T3-E1 細(xì)胞在四種方法處理的肌腱上的黏附情況Fig.4 Adhesions of MC3T3-E1 cells on tendon treated by four methods

圖5 四種方法處理的肌腱皮內(nèi)刺激情況Fig.5 Intradermal stimulation of tendons treated by four methods

討 論

肌腱和韌帶損傷或撕裂的病例日漸增多，目前肌腱修復(fù)的方法主要有 4 類：自體肌腱移植[3-4]、同種異體肌腱移植[5]、人工肌腱置換[6]、組織工程肌腱置換[7]。在這幾種修復(fù)方法中，自體肌腱移植修復(fù)效果最好，是肌腱移植的金標(biāo)準(zhǔn)。但對(duì)于肌腱缺損較多或缺損較大的患者，自體移植往往不能滿足臨床需求；人工肌腱包括聚酯纖維、尼龍、滌綸、碳纖維等，其主要缺點(diǎn)為長(zhǎng)期不能腱化、不能吸收、黏連、異物反應(yīng)等[8]；組織工程肌腱技術(shù)難度較大，成本較高，目前尚處于實(shí)驗(yàn)階段。而同種異體肌腱經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單處理后，能夠達(dá)到很低的免疫原性和很好的生物相容性，完全能夠滿足肌腱修復(fù)的需求，并且隨著供體捐獻(xiàn)制度的不斷完善，肌腱來(lái)源逐漸增多。因此，同種異體肌腱逐漸成為最理想的肌腱缺損修復(fù)材料。

在本研究中，筆者根據(jù)前期工藝的探索，選取了四種肌腱處理的方法。四種方法的處理時(shí)間均為24 h 左右，加上凍干和輻照，整個(gè)制備過(guò)程可以控制在 48 h 以內(nèi)，節(jié)約了時(shí)間成本。從處理效果看，A 組、C 組和 D 組去除了大部分細(xì)胞，但仍有少部分細(xì)胞殘留，而 B 組完全去除了細(xì)胞，可能是由于胰蛋白酶的作用，增強(qiáng)了試劑的去細(xì)胞效果。細(xì)胞毒性結(jié)果顯示，A 組和 C 組細(xì)胞毒性為二級(jí)，可能是由于 TnBP 較難清洗，殘留較多導(dǎo)致。而 B 組和 D組細(xì)胞毒性較小，為一級(jí)。細(xì)胞黏附結(jié)果更直觀的印證了細(xì)胞毒性結(jié)果，A 組和 C 組處理的肌腱上細(xì)胞黏附較少，且細(xì)胞呈球形，說(shuō)明細(xì)胞活力較差，而 B 組和 D 組處理的肌腱上細(xì)胞黏附較多，且細(xì)胞伸展?fàn)顟B(tài)較好，說(shuō)明細(xì)胞活力較強(qiáng)。最后，兔背部皮內(nèi)刺激實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了各組材料在動(dòng)物體內(nèi)的相容性。結(jié)果表明，雖然 A 組和 C 組處理的肌腱具有一定的細(xì)胞毒性，但各組在皮內(nèi)刺激實(shí)驗(yàn)中均未表現(xiàn)出刺激反應(yīng)。這可能是由于動(dòng)物體內(nèi)體液的循環(huán)，稀釋了浸提液中的刺激性物質(zhì)。綜合以上結(jié)果，四種方法處理的肌腱中 B 組和 D 組處理的肌腱的生物相容性更好，特別是 B 組處理的肌腱，不但完全去除了細(xì)胞，而且具有最小的細(xì)胞毒性，最好的細(xì)胞黏附。

在四種肌腱處理方法中，0.5% 胰蛋白酶＋0.5%Triton X-100 的處理方法最為理想。