多孔淀粉對姜黃素的吸附

俞力月，李海燕，馬云翔，陳金鳳，孫倩，茍麗娜，劉鑫，張盛貴

(甘肅農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州，730070)

姜黃素(雙-α，β-不飽和β-二酮)是一種來自植物姜黃(CurcumalongaL.)根莖的黃橙色多酚，已被廣泛用作食品的天然著色劑，具有很高的消費接受度[1-2]。由于其已知的抗癌、抗氧化、抗炎、抗微生物和抗病毒等活性[3-5]，已成為研究熱點。姜黃素主鏈為不飽和脂族及芳香族基團，結構式如圖1所示[2]，由于內部氫鍵結合，其在水性介質中溶解度非常低，是造成生物利用上的主要障礙[6]，也存在穩(wěn)定性差，利用率低的問題。因此，合適的姜黃素緩釋載體是增加穩(wěn)定性、提高其生物利用率的重要手段。近年來，姜黃素緩釋載體的研究逐漸受到重視[7-9]，如合成聚合物生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯(TPG)和聚乙二醇-聚己內酯等用于制備負載姜黃素的納米膠束[10]，天然聚合物如改性菊粉和透明質酸，安全且可生物降解[11]，被認為更有利于遞送姜黃素。

圖1 姜黃素結構式[2]

淀粉來源廣泛，生物安全性強，具有很好的應用前景。多孔淀粉(porous starch，PS)是用物理法、生物和化學法使淀粉顆粒由表面至內部形成孔洞的變性淀粉[12]，其表面到中心豐富的微孔，增加了比表面積，改善了其作為壁材的性能[13]，可用作香料、調味劑、多種功能性物質及藥物的保護載體[14-16]。BELINGHERI等研究顯示了多孔淀粉作為調味劑、香料載體的潛在適用性[17]。WANG等研究結果表明，當使用明膠和多孔淀粉的混合物作為壁材料將葉黃素包埋在網(wǎng)狀結構中時，其溶解度增加，并且可以直接溶解在水中[18]。MEER等研究發(fā)現(xiàn)用溶劑交換法制備的多孔淀粉可用作卡馬西平低水溶性藥物及各種其他候選藥物的增溶劑和載體[13]。溶劑交換法是較廣泛使用的多孔淀粉制造方法，在此過程中通過乙醇交換產(chǎn)生微孔，孔容易形成，溶劑可以完全從介質中除去[19]。多孔淀粉內部的洞孔和孔隙分布密集，具有良好的吸附性能。因此，作為載體保護目的物，多孔淀粉是很好的選擇。

盡管多孔淀粉可為功能性物質生產(chǎn)提供很大的可能性，但迄今為止還沒有關于溶劑交換法制備多孔淀粉對姜黃素吸附后性質的研究。本實驗以溶劑交換法制備的多孔淀粉為材料，對姜黃素進行吸附，表征吸附能力及穩(wěn)定性，并通過在模擬腸液和胃液中的釋放來評估其生物利用度，為姜黃素的緩釋和生物利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

馬鈴薯淀粉(BR)、姜黃素(純度95%)、1,1-二苯基-2-苦基肼基(DPPH)、NaCl、HCl(36%質量分數(shù))、吐溫80、KH2PO4、NaOH，無水乙醇及所有其他試劑和溶劑均為分析級，實驗用水均為蒸餾水。

1.2 儀器設備

DHG-9070鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；JA2603B電子天平，上海精科電子天平；Telstar-LYOQUEST-85凍干機，奧然科技有限公司；18系列紫外可見分光光度計,北京普析通用儀器有限責任公司；HH-4A恒溫磁力攪拌水浴鍋，常州金壇恒豐儀器制造有限公司；JY92-2DN超聲波細胞粉碎機，上海比朗儀器有限公司；PHS-3C pH計，鄭州寶晶電子科技有限公司；JSM-6701F掃描電子顯微鏡，上海立泛機電設備技術有限公司；H-1850R冷凍離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司;FTIR-650變換紅外光譜儀，天津港東公司；Bettersize2600激光粒度分布儀，丹東市皓宇科技有限公司；DSC25差示掃描量熱儀，深圳市廣潤自動化設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 多孔淀粉的制備

參考CHANG的方法并略作修改[20]。5 g馬鈴薯淀粉加入100 mL蒸餾水中，將混合物在40 ℃條件下持續(xù)攪拌20 min后升溫至90 ℃保溫0.5 h，以使淀粉完全糊化。然后在5 ℃儲存48 h以獲得淀粉凝膠。將凝膠切成約1 cm3立方體，并在-10 ℃下冷凍48 h。將冷凍的淀粉凝膠立方體在室溫下浸入無水乙醇3次，每次約1 h，取出后在50 ℃下干燥6 h，在105 ℃加熱2 h以除去乙醇和水，獲得白色固體研磨以備用。

1.3.2 姜黃素與多孔淀粉微膠囊的制備

參考LI的方法并作修改[21]。姜黃素以4 mg/mL的濃度溶解在無水乙醇中，過0.4 μm過濾器除去未溶解晶體；多孔淀粉以5 mg/mL的濃度溶解在蒸餾水中，超聲處理使其體系分布穩(wěn)定；在攪拌下將一定體積的姜黃素乙醇溶液緩慢移液到多孔淀粉溶液中，制備成姜黃素質量分數(shù)分別為0.1%，0.2%，0.3%，0.4%和0.5%的5種復合樣品(Cur@PS)，適度加熱樣品溶液除去乙醇。為了提高姜黃素的吸附能力并減小顆粒的尺寸，將制備的樣品溶液在冰浴中以20%的額定功率輸出進行超聲處理5 min。樣品用凍干機干燥(真空度0.07 mBar，抽真空18 h，干燥時間約為30 h)，制得具有姜黃素的特征黃色樣品，在-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 姜黃素標準曲線的繪制

參考高鳳苑等方法[22]，準確稱取25.0 mg 姜黃素置于燒杯中，用無水乙醇溶解后轉移到250 mL容量瓶中，再用無水乙醇進行定容，得到100 μg/mL的儲備液。分別精密移取2、3、4、5、6 mL 儲備液到100 mL的容量瓶中，用無水乙醇進行定容，制成2～6 μg/mL系列標準溶液。用無水乙醇做空白對照，分別在425 nm處測定其吸光度。以濃度(C，μg/mL)為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.4 吸附能力的確定

將制備的樣品以0.2 mg/mL的濃度添加到乙醇中，并在超聲波中處理30 min，離心(3 000 r/min，10 min)2次，取上清液合并測定425 nm處吸光值，根據(jù)標準曲線，計算吸附能力。

吸附能力(AC)計算為姜黃素與多孔淀粉的質量比，如公式(1)所示：

(1)

式中：mcur，姜黃素質量；mps，多孔淀粉的質量。

1.3.5 掃描電子顯微鏡(SEM)形態(tài)學研究

掃描電子顯微鏡用于研究多孔淀粉及Cur@PS的微觀形態(tài)。以15 kV的加速電壓通過掃描電子顯微鏡觀察表面形態(tài)。在觀察之前，用金濺射涂覆微球2 h。

1.3.6 傅立葉變換紅外(FTIR)光譜測定

FT-IR光譜技術用于分析樣品粉末的化學結構。在該實驗中，使用FTIR-KBr純化合物在20 MPa下壓制5 min，獲得備用片劑。掃描范圍500～4 000 cm-1。

1.3.7 差示掃描量熱(DSC)測定

通過差示掃描量熱儀測量樣品熱轉變性質。稱量樣品粉末(約2.0 mg)并密封在鋁DSC盤中。以10 ℃/ min的加熱速率從20至250 ℃進行DSC掃描，空盤作為參考。

1.3.8 粒度分布測定

使用激光粒度分布儀濕法測量姜黃素、多孔淀粉及Cur@PS的粒度分布。將少量粉末分散在蒸餾水中，攪拌混合物以獲得適當?shù)恼诠舛龋６缺硎緸槠骄w積尺寸D [4,3](De Brouckere平均直徑)，即具有相同體積的球體的平均直徑，并進行分析。

1.3.9 自由基清除活性測定

根據(jù)KIM等[23]方法，使用2,2-二苯基-1-苦基肼基(DPPH)測定制備樣品的自由基清除活性。通過將DPPH試劑以0.1 mmol/L的濃度(稱取0.003 94 g DPPH，用無水乙醇溶解定容到100 mL容量瓶)溶解在乙醇中來制備DPPH工作溶液。向4 mL上述工作溶液中加入1 mL姜黃素乙醇溶液或樣品水溶液。搖動混合物并在室溫下避光保持30 min。在UV-vis分光光度計上記錄525 nm處的吸光值。在DPPH測定中，使用濃度為12.5、25、50、125和250 μg/mL的姜黃素乙醇溶液作為對照，同時將Cur@PS材料溶解于水中,濃度分別為0.5、1、2、5和 10 mg/mL。

根據(jù)公式(2)估算DPPH自由基清除活性：

(2)

式中：A空白和A樣品分別是525 nm波長時加入蒸餾水和樣品溶液的DPPH溶液的吸光值。

1.3.10 模擬胃液(SGF)和模擬腸液(SIF)中姜黃素釋放曲線以及釋放特性

根據(jù)EFSTATHIA等[24]，PEREIRA等[25]方法略作修改。用2.0 g NaCl，7.0 mL HCl(36%質量分數(shù))和1 g吐溫80溶解在1 L蒸餾水中制備SGF，調節(jié)pH至1.2。用6.8 g KH2PO4，0.616 g NaOH和1 g吐溫80溶解在1 L蒸餾水中制備SIF，調節(jié)pH至7.8。秤量約50.0 mg Cur@PS樣品至玻璃小瓶中，向其中加入800 mL預熱的SIF或SGF。將玻璃小瓶轉移至設定為37 ℃，130 r/min搖動的水浴中進行釋放測量。在425 nm下于5 h內監(jiān)測姜黃素的釋放。

(3)

式中：m1,釋放姜黃素的質量；m2,總姜黃素的質量。

1.3.11 水溶性的測定

為了檢測水溶性，通過溫和攪拌將30 mg Cur@PS溶于3mL蒸餾水中30 min。觀察樣品是否完全溶解，在4 ℃冰箱中儲存24 h，離心并觀察是否有沉淀物。同樣將姜黃素溶解在水中，觀察Cur@PS和原始姜黃素在水中的不同溶解情況。

1.4 統(tǒng)計分析

該研究中的所有數(shù)據(jù)測試重復3次，所有數(shù)據(jù)均表示為平均值和標準偏差(平均值±SD)，采用Origin軟件進行作圖和數(shù)據(jù)處理分析。

2 結果與討論

2.1 SEM形態(tài)結構分析

實驗分析了馬鈴薯原淀粉、溶劑交換法制備的多孔淀粉及最佳吸附量0.4%Cur@PS的樣品SEM(圖2)。由圖2-a可以觀察到馬鈴薯原淀粉顆粒大小不均，多為卵形，表面光滑，顆粒完整[26]；與原淀粉相比較，多孔淀粉喪失了其原有結構，表面粗糙，顆粒形態(tài)結構發(fā)生明顯變化，布滿了大量細小的孔洞，孔的分布廣泛但不均勻，各孔的大小也有差異(圖2-b)，孔的存在導致更多的結合位點，使吸附性增強?？椎漠a(chǎn)生是因為采用溶劑交換法制備時，在90 ℃糊化過程中淀粉顆粒被破壞，大量的水分子被吸附在淀粉糊中，冷凍過程中將水變成冰晶被固定在凝膠中，隨后乙醇將冰晶交換出來從而形成了多孔結構[27]；由圖2-c可以看出，大部分孔被姜黃素填充，表明多孔淀粉具有很好的吸附姜黃素的能力，可以作為姜黃素的載體材料使用。

a-馬鈴薯原淀粉;b-馬鈴薯多孔淀粉;c-0.4%Cur@PS

2.2 FTIR分析

圖3 姜黃素、多孔淀粉及Cur@PS紅外光譜圖

對比姜黃素和多孔淀粉的特征光譜，Cur@PS大約在3 520 cm-1處的姜黃素—OH拉伸峰消失, 約3 325 cm-1處淀粉—OH拉伸寬峰隨姜黃素負載量的增加而增大。而在約1 628 cm-1和約1 514 cm-1處檢測到與姜黃素相關的弱峰，峰值信號在1 019 cm-1左右，對應于C—O—C葡萄糖單位振動。另外，淀粉的復雜指紋信號輕微移動到較高的波數(shù)，這歸因于與姜黃素的相互作用[29]。在先前的研究中，氫鍵被認為是酚類化合物與聚合物壁材料之間的主要相互作用，姜黃素的羥基和葡萄糖單位的羥基可能參與氫鍵的形成[21]。由FT-IR光譜可以得出，多孔淀粉對姜黃素的吸附作用可能是化學吸附。

2.3 DSC分析

通過DSC對姜黃素、多孔淀粉以及Cur@PS進行熱力學分析，由圖4可以看出，試驗樣品總體呈放熱效應。180 ℃為姜黃素放熱效應的最大溫度點，出現(xiàn)結晶現(xiàn)象。而多孔淀粉及Cur@PS放熱效應最大溫度點在85 ℃左右，出現(xiàn)結晶現(xiàn)象并發(fā)生熱容變化[30]。多孔淀粉并沒有顯示出特定的吸熱峰，而從約60到120 ℃的寬熱轉變歸因于游離水和結合水的蒸發(fā)[31]。在約180 ℃時0.1%、0.3%Cur@PS姜黃素晶體熔化的放熱峰消失，表明在加入多孔淀粉載體后姜黃素失去其結晶狀態(tài)[21]，但0.5%Cur@PS的吸附后出現(xiàn)了一個弱的放熱峰，這與吸附能力的結果一致，可能是由于“吸附動態(tài)平衡”的存在所導致的，有部分姜黃素與多孔淀粉為物理混合。通過DSC分析得出，多孔淀粉吸附后的姜黃素更利于被分解利用。

圖4 姜黃素、多孔淀粉及Cur@PS DSC

2.4 粒度分布

樣品的粒度分布如圖5所示，吸附后的樣品均顯示單峰分布，表明樣品具有良好的粉末均勻性。如表1所示，Cur@PS的D[4,3]為248.4～376.1 μm，其中0.4%Cur@PS的粒徑分布相對較小，說明0.4%Cur@PS做壁材效果較好，在表1中給出跨度值，TONON等研究表明，較高的跨度值是較寬的粒度分布的標志，反之亦然[32]。由表1及圖5可知，吸附后樣品的Span值粒度分布結果一致，且吸附后樣品的比表面積均減少，其中0.4%Cur@PS為20.27 m2/kg。通過以上結果可以表明多孔淀粉可作壁材吸附姜黃素。

表1 姜黃素與多孔淀粉及Cur@PS粒徑分析

圖5 姜黃素與多孔淀粉及Cur@PS粒徑分布

2.5 姜黃素標準曲線

將配制的 2～6 μg/mL的姜黃素溶液在425 nm處分別測定其吸光度，結果如圖6所示。姜黃素溶液在427 nm處的回歸方程為y=0.204 6x-0.001 9，R2=0.998 3>0.99，由標準曲線可知，姜黃素在2～6 μg/mL范圍內具有可行度和良好的線性關系。

圖6 姜黃素標準曲線

2.6 姜黃素吸附能力

從SEM圖中可以直觀看到多孔淀粉對姜黃素的吸附，為了進一步考察吸附量，實驗設置了不同濃度Cur@PS的吸附試驗。如圖7所示，隨著姜黃素含量的增加，多孔淀粉的吸附量也在增加，姜黃素量為0.4%時，吸附量達到最大(3.67 mg/g),較0.3%吸附量(1.06 mg/g)增加3.46倍(圖7)，這歸因于多孔淀粉的蜂窩結構可以提高材料的吸收性和黏合性[33]。當姜黃素質量分數(shù)為0.4%與0.5%時實現(xiàn)了較高的吸附能力；質量分數(shù)超過0.4%后，吸附能力不再繼續(xù)升高反而開始降低，可能由于“吸附動態(tài)平衡”的存在，使過多的姜黃素無法完全填充到孔隙中，從而使其吸附能力降低。

圖7 Cur@PS吸附結果

2.7 DPPH自由基清除能力測定

姜黃素具有很強的抗氧化能力，能有效清除DPPH自由基。對于Cur@PS材料來說，保持抗氧化能力并有效釋放姜黃素以減少自由基是至關重要的[31]。從圖8可以看出，隨著姜黃素吸附量的增加，清除自由基的能力也在增強，姜黃素吸附量在0.4%Cur@PS時，清除自由基的能力最高達到85.1%，較0.1%Cur@PS(59.2%)提高約1.4倍，其次為0.5%Cur@PS達到82.9%，0.3%Cur@PS為70.3%，0.2%Cur@PS為68.7%。這與多孔淀粉對姜黃素的吸附能力一致，說明多孔淀粉不但能吸附姜黃素，而且能較好的保留大部分抗氧化能力。

圖8 姜黃素及Cur@PS DPPH自由基清除能力

2.8 體外釋放試驗

為進一步確定Cur@PS的釋放行為，試驗設計了0.4%Cur@PS在SGF和SIF中的姜黃素釋放試驗，結果顯示，姜黃素在SIF和SGF中表現(xiàn)出“爆發(fā)釋放”(圖9)，這是因為在冷凍干燥除去水分子的方式使樣品具有多孔性，易于溶解在溶液中[34]。SIF中的釋放較SGF中的快，不同pH值可能是釋放速度存在差異的原因，因為姜黃素和淀粉之間的H鍵很大程度上受環(huán)境pH值的影響[35]，但在酸性環(huán)境中復合物是否更穩(wěn)定還需進一步研究。在SGF和SIF中，部分姜黃素被吸附在多孔淀粉孔隙中，因此即使延長釋放時間也未觀察到姜黃素的完全釋放，姜黃素與多孔淀粉的結合方式還需更進一步研究。

圖9 0.4%Cur@PS在SGF和SIF中的釋放

2.9 水溶性

由于內部氫鍵的結合，姜黃素在水性介質中具有非常低的溶解度[5]。由圖10可知，通過多孔淀粉對姜黃素進行吸附后，其水溶性得到了明顯改善，與純姜黃素相比，Cur@PS水溶性得到了大大的提高。綜上，用于姜黃素的多孔淀粉顆粒有望用于食品和相關領域應用。

圖10 姜黃素及Cur@PS水溶性檢測

3 結論

馬鈴薯多孔淀粉能較好地吸附姜黃素，吸附量隨姜黃素占比而增加，姜黃素吸附量在0.4%Cur@PS時，吸附量達到最大值；姜黃素充填在多孔淀粉的孔隙中及吸附在其表面，使粒徑增大，比表面積減小，復合物的水溶性顯著提高，也較姜黃素更容易被熱分解，能較好地保持抗氧化能力，有利于姜黃素的利用，但在模擬胃液(SGF)和腸液(SIF)中釋放效率較低。