黑果枸杞酵素發(fā)酵前后主要成分分析及其體外抗氧化活性研究

高慶超，常應(yīng)九，馬蓉,曹效海,3,王樹林, 2, 3*

1(青海大學(xué) 農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧,810016) 2(省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點實驗室(青海大學(xué))，青海 西寧,810016) 3(青海-甘肅食品研發(fā)與檢測聯(lián)合實驗室，青海 西寧,810016)

酵素是微生物及相關(guān)代謝活性物質(zhì)的微生態(tài)整體[1-2]，是以果蔬、菌菇、谷物及中草藥等為原料，經(jīng)過乳酸菌、酵母菌和醋酸菌等多菌種復(fù)合發(fā)酵后，形成富含多種生物活性成分、礦物質(zhì)、酶、有機酸和少量乙醇等產(chǎn)物的可食用液態(tài)或固態(tài)食品[3-4]。隨著酵素產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，酵素中相關(guān)代謝產(chǎn)物的分析研究成為熱點，如MARISA等[5]從諾麗酵素中檢測到乙酸，抗壞血酸，琥珀酸和酒石酸等有機酸。陸雨[6]從諾麗酵素中分析鑒定出27個化合物，同時發(fā)現(xiàn)諾麗酵素具有良好的抗氧化活性。李云姣等[7]對水果酵素中的理化成分進行了分析，并發(fā)現(xiàn)水果酵素具有良好的抗氧化效果和潛在的降血糖功效。

黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr.)作為青藏高原的特色漿果資源，富含花青素等多種營養(yǎng)物質(zhì)與活性成分，具備多種生物活性，如抗氧化、抗疲勞、延緩衰老、預(yù)防癌癥等[8]。因此，利用黑果枸杞結(jié)合青海特色漿果資源制備黑果枸杞酵素，在一定程度上可以延緩加工過程中花青素的降解[9]，豐富黑果枸杞系列產(chǎn)品，進一步強化黑果枸杞在功能性食品領(lǐng)域的應(yīng)用。

目前對于黑果枸杞酵素的研究鮮有報道，為了比較與分析不同原料配比黑果枸杞酵素發(fā)酵完成后的成分差異及體外抗氧化性能，本研究以黑果枸杞為主要原料，結(jié)合其他特色植物資源，經(jīng)過90 d自然發(fā)酵，制備4種黑果枸杞酵素，測定發(fā)酵前后4種酵素中理化成分、營養(yǎng)活性成分及有機酸種類和含量，并對其體外抗氧化活性進行了研究，這對高附加值黑果枸杞酵素產(chǎn)品的研發(fā)具有一定意義。

1 材料與方法

1.1 主要試驗材料及儀器

黑果枸杞鮮果采摘于青海省格爾木市(36°25’ N，94°53’ E，海拔2 800 m)，保存于干冰保溫箱中，運回實驗室-20 ℃保藏。黑果枸杞干果、枸杞、瑪卡、蕨麻、沙棘粉等由青海千平萬安農(nóng)業(yè)科技有限公司提供。

SOD試劑盒、淀粉酶試劑盒、考馬斯亮藍(lán)試劑盒，南京建成生物工程研究所；蘆丁和沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，成都德思特生物技術(shù)有限公司；冰乙酸標(biāo)準(zhǔn)品，上海吉至生化科技有限公司；乳酸、酒石酸和琥珀酸等12種有機酸標(biāo)準(zhǔn)品、福林酚、總抗氧化能力檢測試劑盒、羥自由基清除能力檢測試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；DPPH自由基，東京化成工業(yè)株式會社。

UV-1780紫外可見分光光度計，島津儀器(蘇州)有限公司；H/T16MM臺式離心機，湖南赫西儀器裝備有限公司；Multiskan Sky全波長酶標(biāo)儀，美國Thermo Fisher；UltiMate3000高效液相色譜儀，美國Thermo Scientific。

1.2 研究內(nèi)容及實驗方法

1.2.1 黑果枸杞酵素生產(chǎn)

制備4種自然發(fā)酵黑果枸杞酵素。

(1)黑果枸杞鮮果單一酵素：稱取黑果枸杞鮮果2 000 g，打漿處理，轉(zhuǎn)至滅菌壇(121 ℃，15 min)，密封，編號為XD。

(2)黑果枸杞干果單一酵素：稱取黑果枸杞干果400 g，與1 600 mL無菌水按質(zhì)量比1∶4進行復(fù)水30 min，打漿處理，轉(zhuǎn)至滅菌壇(121 ℃，15 min)，密封，編號為GD。

(3)黑果枸杞鮮果復(fù)合酵素：稱取黑果枸杞鮮果1 200 g、枸杞160 g、蕨麻100 g、瑪咖60 g、沙棘粉20 g、紅糖100 g和無菌水640 mL，將枸杞用無菌水沖洗后按質(zhì)量比1∶4與無菌水復(fù)水30 min，同時把瑪咖和蕨麻清洗后水煮60 min至變軟，將全部原料打漿處理，轉(zhuǎn)至滅菌壇(121 ℃，15 min)，密封，編號為XF。

(4)黑果枸杞干果復(fù)合酵素：稱取黑果枸杞干果240 g、枸杞160 g、蕨麻100 g、瑪咖60 g、沙棘粉20 g、紅糖100 g和無菌水1 600 mL，將黑果枸杞和枸杞用無菌水沖洗后按質(zhì)量比1∶4分別與無菌水進行復(fù)水30 min，同時把瑪咖和蕨麻清洗后水煮60 min至變軟，將全部原料打漿處理，轉(zhuǎn)至滅菌壇(121 ℃，15 min)，密封，編號為GF。

所有操作均在超凈工作臺進行，所有發(fā)酵壇置于28 ℃培養(yǎng)箱中避光發(fā)酵，分別于未發(fā)酵前和自然發(fā)酵90 d后取樣，平行3次，經(jīng)4層紗布過濾后，3 000 r/min離心10 min，取上清液，置于-80 ℃冰箱中待測。

1.2.2 理化成分的測定

可滴定酸測定(以乳酸計)：按照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》測定[10]。pH值測定：采用pH計測定。總糖測定：取樣品0.1 mL，稀釋至不同倍數(shù)，采用蒽酮-硫酸法，參考文獻(xiàn)[11]中的步驟，在波長625 nm處測定吸光值，計算總糖含量，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，制作總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線y=7.356 7x-0.012(mg/mL，R2=0.990 6)。還原糖測定：取樣品0.1 mL，稀釋至不同倍數(shù)，采用3,5-二硝基水楊酸顯色法，參考文獻(xiàn)[12]中的步驟，在波長485 nm處測定吸光值，計算還原糖含量，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，制作還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線y=2.159 3x-0.007 4(mg/mL，R2=0.995 8)。

1.2.3 營養(yǎng)及活性成分測定

總蛋白測定：取50 μL樣品，采用考馬斯亮藍(lán)試劑盒測定?；ㄇ嗨睾繙y定：取樣品0.1 mL，采用pH示差法[13]，分別在535 nm和700 nm處測定吸光值，計算花青素含量?？傸S酮測定：取樣品0.5 mL，稀釋至不同倍數(shù)，采用硝酸鋁比色法，參考文獻(xiàn)[14]中的方法，于502 nm波長處測定吸光值，計算總黃酮含量，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，制作蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線y=11.403x+0.018 2(mg/mL，R2=0.996 8)?？偡訙y定：取樣品0.5 mL，稀釋至不同倍數(shù)，采用福林酚法，參考文獻(xiàn)[14]中的方法，在760 nm處測吸光值，計算總酚含量，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，制作沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.101 4x+0.044 4(μg/mL，R2=0.999 4)。SOD酶活力測定：取50 μL樣品，采用SOD試劑盒測定。淀粉酶活力測定：取50 μL樣品，采用淀粉酶試劑盒測定。

1.2.4 有機酸種類及含量測定

色譜條件：參考GB/T 5009.157—2016《食品中有機酸的測定》中的方法[15]，并有所改進。具體條件如下：色譜柱：CAPECELLPAK MGS5C18柱，4.6 mm×250 mm，5 μm；流動相：體積分?jǐn)?shù)0.1%磷酸溶液；液相條件：等梯度洗脫30 min；流速0.7 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量50 μL；檢測波長210 nm。

準(zhǔn)確稱取乳酸8.5 mg，用超純水溶于10 mL棕色容量瓶，搖勻，即為0.85 mg/mL乳酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，以相同的方法配制沒食子酸、延胡索酸、山梨酸、抗壞血酸、琥珀酸、草酸、醋酸、莽草酸、蘋果酸、檸檬酸、酒石酸和γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，其質(zhì)量濃度分別為0.009 8、0.011 6、1、0.108、1.07、0.107 6、1.63、0.017 15、0.135、0.029 8、0.100 9和1.131 mg/mL，以質(zhì)量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品用超純水稀釋一定倍數(shù)，用0.22 μm濾膜過濾后直接進樣。13種有機酸標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果見表1。

表1 十三種有機酸標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.5 體外抗氧化活性測定

DPPH自由基清除能力測定：分別取2 mL不同體積分?jǐn)?shù)的樣品，參考文獻(xiàn)[16]中的方法，以蒸餾水為參比，以不同濃度的Vc溶液作對照，在517 nm 處測定吸光值，利用SPSS軟件計算半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)。

式中：A1,樣品吸光值；A2,用無水乙醇代替DPPH 時測得對應(yīng)濃度的本底吸光值；A0,空白吸光值。

總抗氧化能力的測定：分別取6 μL不同體積分?jǐn)?shù)的樣品，按總抗氧化能力檢測試劑盒中的方法測定。以不同濃度的Vc溶液作對照。

羥自由基清除能力的測定：分別取75 μL不同體積分?jǐn)?shù)的樣品，按羥自由基清除能力檢測試劑盒中的方法測定。以不同濃度的Vc溶液作對照，利用SPSS軟件計算IC50。

還原力的測定：分別取1 mL不同濃度的樣品，參考文獻(xiàn)[17]中的方法測定，以蒸餾水為參比，以不同濃度的Vc溶液作對照。在700 nm處測定吸光值。吸光值越高，還原力越強，利用SPSS軟件計算IC50。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 四種黑果枸杞酵素理化成分測定

經(jīng)過90 d發(fā)酵，4種黑果枸杞酵素的理化成分測定結(jié)果見表2。由表2可知，經(jīng)過90 d發(fā)酵，XD、GD、XF和GF可滴定酸含量均有增加，分別增加了109.73%、122.05%、166.67%和125.52%；總糖含量均有所減少，分別減少了94.90%、83.52%、55.16%和85.58%；還原糖含量均有減少，分別減少了97.51%、84.79%、73.30%和93.19%；pH值均下降，分別下降了0.810、1.200、0.950和1.100。90 d發(fā)酵完成后，4種酵素的pH值基本無差別，XF中可滴定酸含量顯著高于XD和GD(P<0.05)，且高于GF(P>0.05)，XF中總糖和還原糖含量均顯著高于XD、GD和GF(P<0.05)，XD中可滴定酸、總糖和還原糖含量均顯著低于GD、XF和GF(P<0.05)。

表2 理化成分測定結(jié)果

注：同行相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

通過比較發(fā)現(xiàn)，4種酵素未發(fā)酵前各成分含量的高低與發(fā)酵90 d后的成分含量高低不一致，同時，利用鮮果制作的2種酵素(XD和XF)中理化成分含量差異顯著(P<0.05)，利用干果制作的2種酵素(GD和GF)中理化成分含量(除發(fā)酵90 d后的還原糖)差異顯著(P<0.05)，說明4種酵素發(fā)酵過程中糖酸類物質(zhì)的消耗與積累主要是由于自然發(fā)酵方式產(chǎn)生的微生物菌群的代謝作用不同導(dǎo)致。

2.2 四種黑果枸杞酵素活性成分測定

測定結(jié)果見表3。

表3 活性成分測定結(jié)果

由表3可知，經(jīng)過90 d發(fā)酵，XD、GD、XF和GF總蛋白含量均減少，分別減少了64.55%、51.39%、69.12%和56.15%，可能與微生物利用氮源物質(zhì)有關(guān),或者是由于樣品經(jīng)過離心處理后，微生物菌體蛋白被沉淀除去，導(dǎo)致總蛋白的檢測含量較低?；ㄇ嗨睾烤兴鶞p少，分別減少了60.17%、59.41%、91.77%和86.80%，主要是由于花青素極不穩(wěn)定，導(dǎo)致花青素含量有所下降?？傸S酮含量均增加，分別增加了19.96%、26.76%、42.28%和94.44%，總酚含量均增加，分別增加了16.83%、25.34%、44.04%和40.00%，主要是因為在微生物產(chǎn)生的酶類及有機酸的作用下，總酚和總黃酮溶出并呈游離態(tài)，大分子物質(zhì)分解為簡單的小分子物質(zhì)[18]，從而引起總酚和總黃酮含量增加。SOD酶活性均升高，分別升高了1.03%、11.00%、21.33%和22.28%，XD、GD和XF中淀粉酶活性均升高，分別升高了9.94%、29.88%和1.73%，而GF中淀粉酶活性下降了70.39%，SOD酶和淀粉酶活性的變化主要是由微生物的代謝活動引起的，而SOD酶含量升高不明顯，可能與酵素體系中的pH值有關(guān)[19]。

經(jīng)過90 d發(fā)酵之后，GD的總蛋白、花青素、總黃酮和總酚含量均顯著高于XD、XF和GF(P<0.05)，XF的總蛋白、花青素、總黃酮和總酚含量均顯著低于XD、GD和GF(P<0.05)；XF的SOD酶含量相對最高(P<0.05)，GD的SOD酶含量相對最低(P<0.05)；XD的淀粉酶含量顯著高于XF和GF(P<0.05)，且高于GD(P>0.05)，GF的淀粉酶含量相對最低(P<0.05)。綜合發(fā)酵之后的各項活性成分指標(biāo)來看，GD的質(zhì)量水平較好。

2.3 四種黑果枸杞酵素有機酸種類及含量分析

13種有機酸標(biāo)準(zhǔn)品及發(fā)酵90 d后的XD中有機酸的HPLC色譜圖見圖1。

4種黑果枸杞酵素中的有機酸種類及含量檢測結(jié)果見表4。

a-13種有機酸標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖；b-XD中有機酸的HPLC色譜圖;1-γ-氨基丁酸;2-酒石酸;3-檸檬酸;4-蘋果酸;5-莽草酸;6-乳酸; 7-醋酸;8-草酸;9-琥珀酸;10-抗壞血酸;11-山梨酸;12-延胡索酸;13-沒食子酸

表4 四種黑果枸杞酵素中有機酸種類及含量分析

續(xù)表4

有機酸種類時間/d有機酸質(zhì)量濃度/(mg·mL-1)XDGDXFGF醋酸024.650±0.129a11.415±0.134b26.292±0.072c4.403±0.155d903.620±0.009a17.945±0.021b7.296±0.004c31.390±0.170d草酸03.195±0.042a1.586±0.015b2.083±0.122c11.465±0.035d902.794±0.001a3.972±0.000b2.144±0.001c0.050±0.000d琥珀酸01.200±0.007a1.217±0.007a1.955±0.011b5.640±0.096c9013.215±0.007a8.585±0.000b-0.290±0.001c抗壞血酸04.910±0.049a17.418±1.228b1.323±0.000c6.777±0.268d900.093±0.000a5.628±0.000b0.189±0.000c0.561±0.000d山梨酸0-0.003±0.000-0.002±0.000900.279±0.001a0.603±0.000b0.159±0.000c0.401±0.000d延胡索酸00.010±0.001a0.019±0.000b0.016±0.000c0.018±0.000bc90-0.001±0.000a0.014±0.000b-沒食子酸00.024±0.001a0.044±0.000b0.007±0.000c0.028±0.001d900.148±0.000a0.185±0.008b0.075±0.006c0.055±0.003d總計041.46034.27138.89830.6479044.78272.10228.41862.502

注：“—”表示未檢出

由表4可知，由于原料配比不同，4種酵素中的有機酸種類及含量有所不同。在XD中，未發(fā)酵前檢測到11種有機酸，總量為41.460 mg/mL，主要以醋酸為主，未檢測到蘋果酸和山梨酸，90 d發(fā)酵后檢測到12種有機酸，總量為44.782 mg/mL，比未發(fā)酵前增加了8.01%，主要以乳酸和琥珀酸為主，未檢測出延胡索酸。在GD中，未發(fā)酵前檢測到12種有機酸，總量為34.271 mg/mL，主要以醋酸和抗壞血酸為主，未檢測到蘋果酸，90 d發(fā)酵后檢測到13種有機酸，總量為72.102 mg/mL，比未發(fā)酵前增加了110.39%，主要以乳酸、醋酸和琥珀酸為主。在XF中，未發(fā)酵前檢測到12種有機酸，總量為38.898 mg/mL，主要以醋酸為主，未檢測到山梨酸，90 d發(fā)酵后檢測到12種有機酸，總量為28.418 mg/mL，比未發(fā)酵前減少了26.94%，主要以乳酸和醋酸為主，未檢測出琥珀酸。在GF中，未發(fā)酵前檢測到13種有機酸，總量為30.647 mg/mL，主要以草酸和抗壞血酸為主，90 d發(fā)酵后檢測到12種有機酸，總量為62.502 mg/mL，比未發(fā)酵前增加了103.94%，主要以醋酸和乳酸為主，未檢測出延胡索酸。根據(jù)以上結(jié)果可知，經(jīng)過90 d發(fā)酵完成后，以黑果枸杞鮮果或干果為原料的單一酵素(XD和GD)中有機酸主要以乳酸、醋酸和琥珀酸為主。以黑果枸杞鮮果或干果+其他輔料為原料的復(fù)合酵素(XF和GF)中有機酸主要以乳酸和醋酸為主，其中，GD有機酸含量最高，且種類最全。

由表4可以發(fā)現(xiàn)，4種酵素的有機酸組成及含量各有不同，通過發(fā)酵，以黑果枸杞鮮果為原料制作的酵素(XD和XF)中，醋酸被大量消耗，乳酸被大量積累。以黑果枸杞干果為原料制作的酵素(GD和GF)中，乳酸和醋酸被大量積累。自然發(fā)酵過程就是利用原料本身的混菌復(fù)合發(fā)酵的過程,因此，由于原料本身及表面微生物的不同，必定會出現(xiàn)不同的生長代謝活動及各物質(zhì)間相互轉(zhuǎn)化的情況[20]，比如醋酸的消耗可能是由于某些細(xì)菌(如光合細(xì)菌)的乙醛酸循環(huán)作用，使得醋酸被大量消耗[21]；乳酸的形成可能是由于乳酸菌代謝及蘋果酸-乳酸發(fā)酵作用[19]；醋酸的生成可能是由于乳酸菌降解乳酸產(chǎn)生醋酸[22]，從而導(dǎo)致4種酵素中的主要呈味物質(zhì)—有機酸會不盡相同。而XF自發(fā)酵后，有機酸含量比未發(fā)酵前減少了26.94%，且XD中有機酸含量增幅偏小，猜測原因為以黑果枸杞鮮果制作的酵素在發(fā)酵過程中轉(zhuǎn)化生成了其他種類的有機酸，不在檢測的13種有機酸類型當(dāng)中。

2.4 四種黑果枸杞酵素對DPPH自由基清除能力的測定

由圖2可知，XD、GD、XF、GF對DPPH自由基的清除能力在一定體積分?jǐn)?shù)范圍(0.02%～0.75%)內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)，DPPH自由基清除率分別從20.61%、24.88%、14.51%、15.56%上升到91.98%、91.76%、92.43%、92.99%。VC在0.02～0.12 mg/mL范圍內(nèi)，清除率從41.44%上升到63.98%。經(jīng)SPSS軟件計算，4種酵素的IC50為0.049 mg VC/mL，且XD、GD、XF、GF的IC50分別為0.071%、0.055%、0.082%、0.066%，其中，GD的IC50最低，說明在一定體積分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)，GD清除DPPH自由基的能力相對較強。

圖2 四種黑果枸杞酵素的DPPH自由基清除能力

2.5 四種黑果枸杞酵素總抗氧化能力的測定

由圖3可知，XD、GD、XF、GF的總抗氧化能力在一定體積分?jǐn)?shù)范圍(0.25%～1.5%)內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)，總抗氧化能力分別從0.230、0.300、0.156、0.190 U/mL上升到1.485、1.548、0.682、1.085 U/mL，VC在0.02～0.2 mg/mL范圍內(nèi)，總抗氧化能力從0.253 U/mL上升到2.264 U/mL。體積分?jǐn)?shù)為1.5%的XD和GD與0.12 mg/mL VC溶液(1.516 U/mL)總抗氧化能力相當(dāng)，體積分?jǐn)?shù)為1.25%的XF(0.571 U/mL)與0.04 mg/mL VC溶液(0.537 U/mL)總抗氧化能力相當(dāng)，體積分?jǐn)?shù)為1.5%的GF(1.085 U/mL)與0.08 mg/mL VC溶液(0.999 U/mL)總抗氧化能力相當(dāng)。綜合以上結(jié)果可知，在一定濃度范圍內(nèi)，GD的總抗氧化能力相對較強。

圖3 四種黑果枸杞酵素的總抗氧化能力

2.6 四種黑果枸杞酵素對羥自由基清除能力的測定

由圖4可知，XD、GD、XF、GF對羥自由基的清除能力在一定體積分?jǐn)?shù)范圍(0.5%～2.5%)內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)，羥自由基清除率分別從52.37%、45.25%、54.45%、49.85%上升到79.23%、90.95%、85.01%、87.09%。VC在0.02～0.2 mg/mL范圍內(nèi)，清除率從56.68%升到97.92%。經(jīng)SPSS軟件計算，4種酵素的IC50為0.017 mg VC/mL，且XD、GD、XF、GF的IC50分別為0.536%、0.738%、0.488%、0.606%，其中，XF的IC50最低，說明在一定濃度范圍內(nèi)，XF清除羥自由基的能力相對較強。

圖4 四種黑果枸杞酵素的羥自由基清除能力

2.7 四種黑果枸杞酵素還原力的測定

由圖5可以看出，XD、GD、XF、GF的還原力在一定體積分?jǐn)?shù)范圍(0.25%～1.5%)內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)，還原力分別從0.098、0.180、0.116、0.176上升到0.615、1.090、0.814、1.142。VC在0.02～0.12 mg/mL范圍內(nèi)，還原力從0.114升到0.799。經(jīng)SPSS軟件計算，4種酵素的IC50為0.071 mg VC/mL，且XD、GD、XF、GF的IC50分別為1.251%、0.596%、0.938%、0.640%，其中，GD的IC50最低，說明在一定濃度范圍內(nèi)，GD的還原能力相對較強。

圖5 四種黑果枸杞酵素的還原力

2.8 代謝物質(zhì)及抗氧化能力的相關(guān)性分析

采用Pearson法對4種黑果枸杞酵素中的相關(guān)代謝物質(zhì)及抗氧化能力進行相關(guān)性分析，結(jié)果見表5。

表5 相關(guān)性分析結(jié)果

注：*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)

由表5可知，DPPH自由基清除與總蛋白、花青素、總黃酮、總酚及有機酸均呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，說明DPPH自由基清除主要受總蛋白、花青素、總黃酮、總酚及有機酸的影響?？偪寡趸芰εc總蛋白、花青素、總黃酮、總酚及淀粉酶均呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與有機酸呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，說明總抗氧化能力主要受總蛋白、花青素、總黃酮、總酚、淀粉酶及有機酸的影響。羥自由基清除與SOD酶呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，說明羥自由基清除主要受SOD酶的影響。還原力與有機酸呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，說明還原力主要受有機酸的影響。

3 討論

通過比較4種酵素發(fā)酵完成后的活性成分含量差異發(fā)現(xiàn)(表3)，除了微生物代謝作用這一主要變化因素之外，XD和GD的成分含量分別高于XF和GF(除SOD酶外)，說明由于黑果枸杞的極高營養(yǎng)價值，導(dǎo)致了單一酵素的質(zhì)量水平比復(fù)合酵素相對較好，而SOD酶活性差異，可能是由于其他輔料添加而導(dǎo)致的。GD和GF的成分含量分別高于XD和XF(除SOD酶和淀粉酶外)，可能是由于干果與水比例偏大，導(dǎo)致干果酵素質(zhì)量水平高于鮮果酵素，而SOD酶和淀粉酶活性差異，猜測原因為黑果枸杞在干制過程中多種酶活性被破壞所致。

4種酵素在一定的試驗濃度范圍內(nèi)，具有良好的體外抗氧化效果，且呈劑量依賴效應(yīng)，這與程勇杰等[23]研究結(jié)果類似。經(jīng)過SPSS計算IC50后，GD在清除DPPH自由基、總抗氧化能力和還原力方面相對較強，同時根據(jù)相關(guān)性分析結(jié)果(表5)，分析原因主要是由于GD中花青素、總黃酮、總酚、維生素和有機酸含量相對較高，這些物質(zhì)的作用取決于其分子質(zhì)量、芳香環(huán)的多少及羥基取代基等相關(guān)性質(zhì)[24]，尤其會受有機酸的影響[25]。XF在羥自由基清除能力方面相對較強，根據(jù)相關(guān)性分析結(jié)果(表5)，推測原因可能是XF中SOD酶含量較高或者存在高效清除羥自由基的活性物質(zhì)[26]。

4 結(jié)論

本文針對黑果枸杞酵素中主要成分的變化情況及清除自由基能力的強弱進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黑果枸杞酵素經(jīng)自然發(fā)酵之后，品質(zhì)良好，并具有很好的抗氧化活性，同時由于鮮果受季節(jié)性和貯藏條件的影響，以干果為主要原料制備酵素(GD和GF)能夠相對較好地適用于企業(yè)生產(chǎn)加工。但是由于自然發(fā)酵方式不能完全準(zhǔn)確地調(diào)控菌群結(jié)構(gòu)，可能會導(dǎo)致雜菌污染，因此，從自然發(fā)酵酵素中分離出優(yōu)勢菌種，再用于酵素接種發(fā)酵加工生產(chǎn)中，將對酵素的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展起到推動作用。