黑枸杞花青素微膠囊優(yōu)化及理化特性分析

陳程莉，李豐泉，刁倩，常馨月，董全

(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715)

花青素是對(duì)人體健康有益的一種活性成分[1]，具有抗氧化、抗輻射、抗炎、防衰老和降血脂等功效，在食品工業(yè)中有廣闊的應(yīng)用前景?；ㄇ嗨匾话銇?lái)源于顏色鮮艷的蔬菜或水果。一些漿果類(lèi)植物也是花青素的良好來(lái)源，特別是黑枸杞，被稱(chēng)為花青素之王[2]。由于花青素的穩(wěn)定性較差，導(dǎo)致在食品中的應(yīng)用具有一定的局限性。花青素的穩(wěn)定性受多種環(huán)境因素影響，如pH、光照、溫度、氧和酶活性[3]。如何提高花青素在加工和貯藏過(guò)程中的穩(wěn)定性，成為其在食品工業(yè)中應(yīng)用的一項(xiàng)挑戰(zhàn)。

目前提高花青素穩(wěn)定性的方法有包封法、乳化法和冷凍干燥法。包封法是提高花青素穩(wěn)定性的先進(jìn)技術(shù)，其中最常用的封裝技術(shù)是微膠囊化。微膠囊化是提高生物活性物質(zhì)的利用度和穩(wěn)定性、控制活性物質(zhì)釋放的有效途徑[4]。微膠囊化的主要目的是保護(hù)核心材料不受環(huán)境影響，從而提高產(chǎn)品的貨架期，促進(jìn)核心材料的可控釋放。微膠囊化技術(shù)有多種類(lèi)型，如振動(dòng)噴嘴、離心擠出、噴霧干燥和共結(jié)晶[5]等。噴霧干燥由于具有連續(xù)性好、成本低、時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，是目前最常用的微膠囊制備技術(shù)[6]。

噴霧干燥制備微膠囊的關(guān)鍵是壁材的選擇，常用的壁材有明膠、麥芽糊精、阿拉伯樹(shù)膠和淀粉[7]等。明膠是一種具有良好兼容性、易溶于水和易成膜等優(yōu)點(diǎn)的水解蛋白。將淀粉作為微膠囊壁材具有價(jià)格低廉、來(lái)源廣泛、可食用等優(yōu)點(diǎn)。然而天然淀粉不溶于冷水，遇水加熱后形成高黏度的糊狀結(jié)構(gòu)，會(huì)降低噴霧干燥效率，增加表面裂紋。限制了其在噴霧干燥法制備微膠囊中的應(yīng)用。這些限制可以通過(guò)天然淀粉的改性來(lái)克服，但是將改性淀粉作為包封各種生物活性物質(zhì)的壁材[8]的研究較少。復(fù)合壁材比單一壁材更能保護(hù)生物活性物質(zhì)，提高其穩(wěn)定性。通過(guò)實(shí)驗(yàn)室前期的壁材篩選，本研究以黑枸杞花青素為原料，采用改性淀粉和明膠作為復(fù)合壁材，經(jīng)噴霧干燥法制備黑枸杞花青素微膠囊，同時(shí)以包埋率、DPPH清除活性、花青素含量和水分活度為評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)微膠囊噴霧干燥工藝進(jìn)行了優(yōu)化和驗(yàn)證，并對(duì)微膠囊化粉末的紅外光譜、X射線衍射、熱性能和形貌進(jìn)行了研究分析。旨在通過(guò)微膠囊技術(shù)改善花青素穩(wěn)定性，為花青素在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑枸杞花青素，青海秦仁堂商貿(mào)有限公司；糯米淀粉，重慶沁心食品有限公司；明膠，成都科龍化工試劑廠；DPPH，上海伊卡生物技術(shù)有限公司；鹽酸、無(wú)水乙醇、正丁醇、NaHCO3、冰乙酸、甲醇、KCl、醋酸鈉，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

GP-P2000 噴霧干燥儀，上海顧信生物科技有限公司；X′Pert3 Powder X射線衍射，荷蘭帕納特公司；Phenom Pro 掃描電鏡，Phenom World 公司；721G 紫外分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司；Spectrun100 傅里葉紅外光譜儀、DSC4000差示掃描量熱儀，美國(guó)PerkinElmer公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 微膠囊的制備

1.3.1.1 改性淀粉的制備

根據(jù)DAS等[9]方法，對(duì)天然糯米淀粉進(jìn)行改性。稱(chēng)取25 g糯米淀粉加入100 mL 正丁醇中，加入1 mL HCl(質(zhì)量分?jǐn)?shù)36%)，在磁力攪拌器中于30 ℃條件下攪拌2 h。加入14 mL 1 mol/L NaHCO3終止反應(yīng)，冰浴冷卻15 min。5 000 r/min離心5 min，用體積分?jǐn)?shù)50%乙醇洗滌沉淀4次,可脫除游離的正丁醇及NaCl，45 ℃干燥備用。

1.3.1.2 微膠囊的制備及工藝優(yōu)化

以改性淀粉和明膠為壁材，黑枸杞花青素為芯材，對(duì)花青素提取物進(jìn)行微膠囊化。在水中制備不同質(zhì)量濃度(40～80 g/L)的壁材[m(改性淀粉)∶m(明膠)=2∶1]分散體，加入黑枸杞花青素[m(芯材)∶m(壁材)=1∶20]，采用噴霧干燥機(jī)對(duì)花青素提取物進(jìn)行包封。噴霧干燥時(shí)，入口空氣溫度為140～180 ℃，進(jìn)樣泵速為6%～14%。對(duì)微膠囊的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化試驗(yàn)的因素水平如表1所示。

表1 因素水平編碼表

1.3.2 包埋率測(cè)定

采用MAHDAVI等[7]描述的方法測(cè)定微膠囊的包埋率，計(jì)算如公式(1):

(1)

式中：TAC,總花青素含量，mg/L;SAC,表面花色苷含量，mg/L。

總花色苷(TAC)提取：1 mL蒸餾水加到100 mg樣品研碎，加入10 mL乙醇提取5 min。20 ℃，5 000 r/min離心3 min，上清液用0.45 μm濾膜過(guò)濾測(cè)花色苷。

表面花色苷(SAC)提?。悍Q(chēng)取100 mg樣品，加入10 mL乙醇漩渦10 s。20 ℃，5 000 r/min離心3 min，上清液用0.45 μm濾膜過(guò)濾測(cè)花色苷。

1.3.3 DPPH清除活性

稱(chēng)取30 mg微膠囊溶解于3 mLV(乙醇)∶V(乙酸)∶V(水)=50∶8∶42溶液中，混合物用0.45 μm的濾膜過(guò)濾，取上清液并用甲醇稀釋?zhuān)?00 μL濾液加入3.8 mL DPPH的甲醇溶液(6×10-5mol/L)，30 ℃保溫避光靜置40 min，在517 nm下測(cè)定吸光度。并做空白試驗(yàn)。根據(jù)公式(2)計(jì)算DPPH清除率[10]。

(2)

式中：A0，空白吸光度；As，樣品吸光度。

1.3.4 花青素含量測(cè)定

花青素含量用差示法進(jìn)行測(cè)量，用KCl和CH3COONa分別配制成pH1.0和pH4.5的緩沖溶液，將待測(cè)液用乙醇定容至10 mL，緩沖液稀釋10倍，分別于520 nm和700 nm下測(cè)吸光度?；ㄉ蘸康挠?jì)算見(jiàn)公式(3):

花青素含量/(mg·L-1)=

(3)

式中：MW，分子量，449.2 g/mol；DF，稀釋倍數(shù)；ε，消光系數(shù)，26 900 L/(mol·cm)；L，比色皿距離，1 cm。

1.3.5 水分活度

用水分活度計(jì)測(cè)量水分活度。測(cè)定條件：溫度為20 ℃，時(shí)間為10 min。

1.3.6 黑枸杞花青素微膠囊理化性質(zhì)分析

1.3.6.1 紅外分析

分別稱(chēng)取2 mg黑枸杞花青素、改性淀粉、明膠、花青素微膠囊，加入100 mg溴化鉀(105 ℃烘干)研磨壓片，使用傅里葉紅外光譜儀進(jìn)行掃描并進(jìn)行紅外光譜分析。掃描范圍4 000～400 cm-1，光譜分辨率1 cm-1，掃描次數(shù)32次。

1.3.6.2 X射線衍射

將2 g左右改性淀粉、明膠、微膠囊進(jìn)行壓片，用X射線衍射儀進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。掃描條件：掃描范圍5～50°(2θ)，掃描速率2 °/min。

1.3.6.3 微膠囊形貌

在樣品架上貼一層導(dǎo)電膠帶，將微膠囊均勻平鋪在導(dǎo)電膠帶上，噴灑一層薄金后用掃描電鏡觀察微膠囊的微觀形貌。測(cè)量條件：電壓15 KV，放大倍數(shù)10 000倍。

1.3.6.4 DSC測(cè)定

在鋁坩堝中分別稱(chēng)取2～5 g左右改性淀粉、明膠、微膠囊，壓片后用差示掃描量熱儀進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定條件：測(cè)定范圍30～250 ℃，升溫速率為10 ℃/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 二次回歸模型及方差分析

采用響應(yīng)面Box-Behnken Design對(duì)微膠囊進(jìn)行優(yōu)化，黑枸杞花青素微膠囊的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

續(xù)表2

從表3可以看出包埋率、DPPH清除活性、花青素含量、水分活度的二次回歸模型顯著(0.001 2, 0.000 6, <0.000 1, 0.008 2)，失擬項(xiàng)不顯著(0.104 7, 0.472 0, 0.943 0, 0.987 1)，R2分別為0.945 5、0.956 6、0.978 8、0.902 3。證明二次回歸方程可以較好的擬合壁材濃度、溫度、進(jìn)樣泵速與微膠囊包埋率、花青素含量、DPPH清除活性、水分活度之間的關(guān)系。所以這4個(gè)二次回歸模型可以用來(lái)預(yù)測(cè)花青素微膠囊的包埋率、花青素含量、DPPH清除活性和水分活度。

表3 擬合二次多項(xiàng)式模型的方差分析

注：*表示差異顯著(0.01

2.1.2 各因子間交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響

圖1-a,圖1-b描述了黑枸杞花青素微膠囊化過(guò)程中的制備參數(shù)與包埋率之間的關(guān)系。隨著進(jìn)氣溫度的升高，包埋率先升高后下降。噴霧干燥過(guò)程中，隨著入口空氣溫度的升高，霧滴的干燥速度加快，快速形成外殼，包裹花青素并防止花青素浸出和滲透到液滴中。而隨著溫度持續(xù)升高，高溫致使外殼爆裂，包裹住的花青素重新裸露在空氣中，包埋率降低。隨著壁材濃度的增加，花青素有更大的機(jī)會(huì)被壁材包裹，但過(guò)高的壁材濃度反而會(huì)降低微膠囊的包埋率。芯材的保留率在很大程度上取決于初始溶液的黏度。隨著固體濃度的增加，黏度也隨著增加，最終導(dǎo)致顆粒開(kāi)裂，增加花青素從核向壁的擴(kuò)散。

圖1-c,圖1-e描述了溫度、壁材濃度的變化對(duì)花青素含量、DPPH清除率的影響。由于黑枸杞花青素是熱敏性物質(zhì)，所以當(dāng)出口溫度增加時(shí)花青素含量下降，DPPH清除率降低。壁材濃度的增加會(huì)導(dǎo)致溶液黏度的增加，限制了內(nèi)部的流動(dòng)和循環(huán)，致使花青素含量和DPPH清除率均增加。但當(dāng)壁材濃度較高時(shí)，由于顆粒的開(kāi)裂，部分花青素從核心轉(zhuǎn)移到表面，造成花青素降解，并致使花青素含量和DPPH清除率均降低。而圖1-d,圖1-f中，隨著進(jìn)樣速度增加，花青素在高溫下會(huì)經(jīng)歷更短的時(shí)間，更大程度地避免了花青素的降解，所以花青素含量和DPPH都有所升高。而當(dāng)進(jìn)樣泵速的過(guò)度加快，霧化后的霧滴增多，水分無(wú)法快速蒸發(fā)，不能很好的形成微膠囊，降低了微膠囊中花青素的保留率和DPPH的清除活性。

圖1 壁材濃度、溫度、進(jìn)樣泵速對(duì)花青素微膠囊的影響

圖1-g,圖1-h描述了黑枸杞花青素微膠囊制備工藝參數(shù)的變化對(duì)水分活度的影響。在高進(jìn)口溫度條件下，微膠囊化過(guò)程中的空氣溫度也隨之增加，干燥加快，水分活度降低。溶液中固形物含量越多，總水分越少，顆粒的水分活度越低。進(jìn)樣泵速提高，霧化后的霧滴增多，并且顆粒在干燥室內(nèi)的停留時(shí)間縮短，從而提高了微膠囊顆粒的水分活度。

2.1.3 優(yōu)化與驗(yàn)證

本次實(shí)驗(yàn)的目的是找出微膠囊化噴霧干燥的最優(yōu)參數(shù)，得到包埋率高、花青素含量高、DPPH清除活性高和低水分活度的微膠囊粉末。從而在優(yōu)化過(guò)程中設(shè)定目標(biāo)，達(dá)到最大包埋率、最大花青素含量、最高DPPH清除活性和最小的水分活度。根據(jù)優(yōu)化分析后，最優(yōu)工藝條件為：壁材濃度61.4 g/L、溫度157.03 ℃、進(jìn)樣泵速6.10%，優(yōu)化預(yù)測(cè)值為包埋率93.4%、DPPH清除率45.45%、花青素含量62.87 mg/L、水分活度0.49。Desirability值為0.824，接近1，證明有很好的可行性?？紤]到實(shí)際操作的可行性，將最優(yōu)工藝修正為：壁材濃度60 g/L、溫度157 ℃、進(jìn)樣泵速6%。對(duì)修正參數(shù)進(jìn)行3次重復(fù)測(cè)定，得到包埋率93.4%、DPPH清除率45.41%、花青素含量63.04、水分活度0.49，與預(yù)測(cè)值接近。

2.2 微膠囊紅外光譜分析

黑枸杞花青素、改性淀粉、明膠和微膠囊的紅外光譜如圖2所示。

圖2 花青素微膠囊紅外光譜

2.3 微膠囊X射線衍射分析

圖3是花青素微膠囊、改性淀粉、明膠的X射線衍射圖。由改性淀粉的X射線衍射圖可知,在15°附近觀察到1個(gè)強(qiáng)衍射峰，這表明淀粉具有一定的結(jié)晶度，在17°和18°處存在1個(gè)雙峰，23°有1個(gè)衍射峰，這些都是典型的淀粉衍射峰[14]。明膠的X射線衍射圖可知，在8°和21°分別有1個(gè)衍射峰，這是明膠的典型衍射峰[15]。通過(guò)微膠囊的X射線衍射圖可知，微囊化后淀粉峰和明膠峰都有一定程度的減弱或消失。因?yàn)楹饔?，微膠囊化粉末結(jié)晶度下降并表現(xiàn)出無(wú)定型性質(zhì)。在20°觀察到一個(gè)尖峰，這可能是由于形成了具有無(wú)定形結(jié)構(gòu)的生物聚合物[16]。這個(gè)峰可能是花青素中的某些生物活性物質(zhì)與直鏈淀粉或明膠形成的化合物[17-18]。除此之外，這個(gè)峰也有可能是噴霧干燥過(guò)程對(duì)花青素微膠囊的影響所致。

圖3 X-射線衍射

2.4 微膠囊形貌分析

對(duì)最佳噴霧干燥條件下得到的微膠囊化粉體進(jìn)行了表面形貌觀察，如圖4所示。花青素是親水性著色劑，特別適合與果膠、樹(shù)膠等水基凝膠制劑和麥芽糊精、淀粉等作為極性固體基質(zhì)的包覆材料相結(jié)合[7]。噴霧干燥后形成的花青素微膠囊為紫紅色粉末(圖4-a)?；ㄇ嗨匚⒛z囊中未見(jiàn)顆粒聚集，呈現(xiàn)較多的圓球形微膠囊，表面均未發(fā)現(xiàn)裂紋或孔洞(圖4-b)。KANAKDANDE等[19]建議微膠囊化粉末應(yīng)呈微球形，壁面裂紋和孔洞最小，而黑枸杞花青素微膠囊與其建議的一致。粒徑大約在2～20 μm左右。褶皺的壁是由噴霧干燥極具失水造成的，而較大顆粒的圓球形可能是多個(gè)改性淀粉顆粒共同被明膠包覆，形成了一層保護(hù)膜，對(duì)黑枸杞花青素起到了雙層保護(hù)，更增加了花青素的穩(wěn)定性。

a-微膠囊粉末;b-掃描電鏡

2.5 DSC分析

通過(guò)差示掃描量熱法研究壁材和花青素微膠囊的熱特性，并利用軟件Trios對(duì)DSC曲線進(jìn)行分析比較。由圖5可知，黑枸杞花青素、改性淀粉、明膠和微膠囊熱熔解的起始溫度分別為67.26、88.71、94.51和98.71 ℃?；ㄇ嗨匚⒛z囊化能夠明顯地改善天然花青素?zé)崛劢獾钠鹗紲囟?，提高花青素的熱穩(wěn)定性。這是由于淀粉-酚類(lèi)化合物-蛋白形成長(zhǎng)鏈復(fù)合體，需要更高的溫度才能打破，也可能是由于改性后的支鏈淀粉雙螺旋比未水解支鏈淀粉分子長(zhǎng)很多，雙螺旋結(jié)構(gòu)長(zhǎng)度增加，穩(wěn)定性也會(huì)隨之增強(qiáng)。改性淀粉、明膠的吸熱峰在133.40 ℃和123.88 ℃，花青素微膠囊在133.52 ℃處出現(xiàn)吸熱峰。由于花青素微膠囊的熱熔解溫度較高，在食品工業(yè)中能夠穩(wěn)定存在，在常規(guī)的食品加工過(guò)程中不易受熱而分解[20]。

圖5 花青素微膠囊DSC分析

熱焓在一定程度上可以反映樣品的穩(wěn)定性。未包埋的花青素與微膠囊的熱焓分別為183.16 J/g和274.03 J/g，微膠囊化后的熱焓值顯著提高，這說(shuō)明其發(fā)生相變所需的熱量變高，即黑枸杞花青素微膠囊的熱穩(wěn)定性較好。

3 結(jié)論

為獲得最大包埋率、最大花青素含量、最高DPPH清除活性和最小水分活度的黑枸杞花青素微膠囊。最優(yōu)工藝條件為：壁材濃度60 g/L、溫度157 ℃、進(jìn)樣泵速6%。在此條件下的微膠囊包埋率為93.4%、DPPH清除率為45.41%、花青素含量為63.04 mg/L、水分活度為0.49?；ㄇ嗨匚⒛z囊紅外圖譜中花青素吸收峰強(qiáng)度有所減弱，表明花青素進(jìn)入了微膠囊內(nèi)腔，證明包埋成功。微囊化后，微膠囊的X射線圖譜并不是改性淀粉和明膠的簡(jiǎn)單相加，而是出現(xiàn)了新的衍射峰，形成了淀粉-花青素-蛋白的聚合體。微膠囊的形貌為圓球狀，表面無(wú)孔洞和裂紋。熱溶解的起始溫度和峰值溫度均有所增加，其熱穩(wěn)定性有所提高。