頂溫對(duì)特香型大曲理化指標(biāo)及菌群演替的影響

陳可丹，吳曉江，陳延儒，劉婷，萬(wàn)茵，劉成梅，吳酬飛，付桂明*

1(食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(南昌大學(xué))，江西 南昌，330047) 2(南昌大學(xué) 食品學(xué)院，江西 南昌，330047)3(湖州師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 湖州，313000)

大曲作為主要糖化發(fā)酵劑，被譽(yù)為酒之母、酒之骨、酒之魂，在白酒釀造過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[1]。各大名優(yōu)白酒企業(yè)均利用環(huán)境微生物自然接種發(fā)酵制備大曲，其產(chǎn)區(qū)獨(dú)特的地理氣候環(huán)境決定了曲塊上生長(zhǎng)的微生物種類(lèi)和比例，這些微生物在發(fā)酵過(guò)程中可通過(guò)代謝產(chǎn)生不同揮發(fā)性香味成分，從而形成不同的白酒香型。傳統(tǒng)大曲制作工藝通常通過(guò)室溫、水分、通風(fēng)等環(huán)境因素來(lái)調(diào)節(jié)曲溫，因此微生物受環(huán)境因素影響大，導(dǎo)致大曲發(fā)酵過(guò)程不穩(wěn)定，質(zhì)量不一致，成為制約中國(guó)白酒標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)的關(guān)鍵難題[2]。

其中，溫度是影響大曲理化指標(biāo)及微生物多樣性的重要因素[3]。根據(jù)制作頂溫的不同，大曲可分為高溫(>60 ℃)、中溫(50～60 ℃)和低溫大曲(<50 ℃)[4]。研究發(fā)現(xiàn)，大曲發(fā)酵溫度和制作工藝不同，可造成中、低、高溫大曲之間糖化力、液化力、酯化力、發(fā)酵力相差很大[5]。劉延波等[6]對(duì)中、高溫大曲進(jìn)行高通量測(cè)序，研究發(fā)現(xiàn)高溫曲中的細(xì)菌與中溫曲相比，Bacillus(芽孢桿菌屬)和Thermoactinomyces(高溫放線菌屬)顯著上升，而Kroppenstedtia和Lactobacillus(乳桿菌屬)顯著下降。

特香型白酒是江西省獨(dú)有的名優(yōu)白酒，風(fēng)味特點(diǎn)是“濃頭醬尾清中間、三香俱備猶不靠”，采用中高溫大曲進(jìn)行釀造，其頂點(diǎn)溫度一般在55 ℃左右。特香型大曲生產(chǎn)工藝是以面粉、麥麩為主要原料，其獨(dú)特之處是添加一定比例的酒糟(15～20%)以提高大曲的酸度及透氣性，從而利于耐酸性微生物的生長(zhǎng)[7]，另外本文高頂溫曲加入了豌豆粉，以提高大曲風(fēng)味層次并防止品溫過(guò)高導(dǎo)致大曲開(kāi)裂。目前關(guān)于特香型白酒大曲的研究，多集中于大曲理化指標(biāo)及采用可培養(yǎng)手段對(duì)大曲的菌落進(jìn)行分析，但未見(jiàn)不同頂溫對(duì)特香型大曲的理化指標(biāo)及微生物演替的影響報(bào)道。因此，本文通過(guò)以特香型白酒大曲為研究對(duì)象，測(cè)定其發(fā)酵過(guò)程中理化指標(biāo)及菌群演替的變化規(guī)律，揭示頂溫對(duì)大曲制作過(guò)程中理化指標(biāo)及菌群演替的影響，為提高特香型白酒大曲的質(zhì)量提供理論研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品：實(shí)驗(yàn)所用大曲為江西酒廠在相同環(huán)境制作的中頂溫曲(BM)及高頂溫曲(BH)，曲醅規(guī)格28 cm×16 cm×7 cm，重量約3.4 kg。

試劑：NaOH、H2SO4、HCl、葡萄糖、3,5-二硝基水楊酸、乙酸鈉、I2、KI、可溶性淀粉、三氯乙酸、Na2CO3(分析純)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；福林酚(分析純)，北京索萊寶科技有限公司；冰乙酸(分析純)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

分析電子天平(FA2004)，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；pH計(jì)(FE 28)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)(SP-756P)，上海光譜儀器有限公司

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品采集及處理

在每個(gè)曲房的中心和兩側(cè)取等量樣品，粉碎并混合均勻于4 ℃保藏，部分于-80 ℃保藏用于菌落分析。

1.3.2 大曲理化指標(biāo)及水解酶系測(cè)定

定期用溫度計(jì)測(cè)定大曲品溫及室溫。參照QB/T4 257—2011《釀酒大曲通用分析方法》[8]，采用常壓干燥法、電位滴定法分別測(cè)定大曲的水分含量及酸度。采用DNS比色法測(cè)定大曲中還原糖含量[9]。參照GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》測(cè)定酸性蛋白酶酶活力[10]。通過(guò)DNS法測(cè)定還原糖含量間接計(jì)算糖化酶活力[11]。參照沈怡方《白酒生產(chǎn)技術(shù)全書(shū)》測(cè)定酯化力[12]。

1.3.3 大曲菌群結(jié)構(gòu)分析

將大曲樣品送至上海派森諾生物科技有限公司，使用MiSeq測(cè)序儀進(jìn)行2×300 bp的雙端測(cè)序，并進(jìn)行物種注釋及豐度等分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大曲固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中溫度及水分含量的變化

兩批大曲的溫度變化均為前期逐漸上升達(dá)到最高品溫，后期緩慢下降至室溫的過(guò)程，并且室溫的變化曲線與品溫一致(圖1)。BM發(fā)酵前期升溫速率高于BH，于7 d達(dá)到頂溫58 ℃，而B(niǎo)H于8 d達(dá)到頂溫62 ℃。研究表明大曲前期溫度上升可能是由于可溶性糖被微生物大量利用，從而大量產(chǎn)熱所致[13]。而大曲溫度逐漸達(dá)到頂溫后，導(dǎo)致大曲中部分不耐熱微生物生長(zhǎng)受到抑制甚至死亡，使大曲菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[14]。

水分含量變化均隨時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，初始含水量在45%左右，最終含水量均保持在11%左右(圖2)。發(fā)酵過(guò)程中由于微生物大量繁殖產(chǎn)熱，曲房溫度升高，尤其在頂溫區(qū)，水分被大量蒸發(fā)，造成其含量急劇降低。研究表明出房時(shí)較低的水分含量有利于降低微生物的生長(zhǎng)代謝，使得大曲易于保存[15]。同時(shí)，大曲中微生物產(chǎn)熱能力下降，導(dǎo)致品溫降低，發(fā)酵后期大曲的品溫與室溫基本一致。

a- BH;b- BM

a- BH;b- BM

2.2 Illumina MiSeq測(cè)序分析大曲固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)演變

根據(jù)OTU劃分和分類(lèi)地位鑒定結(jié)果，選取在屬分類(lèi)水平上最大相對(duì)豐度排名前20的屬，生成物種相對(duì)豐度分布柱形圖，如圖3所示，結(jié)果顯示2批大曲固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中菌群呈現(xiàn)明顯動(dòng)態(tài)演變。

a-真菌屬；b-細(xì)菌屬

如圖3-a所示，在BH發(fā)酵過(guò)程中，嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)和假絲酵母屬(Candida)為大曲發(fā)酵過(guò)程的優(yōu)勢(shì)菌。Candida與乙酸發(fā)酵密切相關(guān)，且在釀造中可產(chǎn)生乙酸乙酯等香味物質(zhì)，其在BH和BM發(fā)酵前期為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌；但后期其相對(duì)豐度均大幅下降，可能與水分或營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量下降，菌絲自溶有關(guān)[16]。Thermoascus是釀酒環(huán)境的重要酶源產(chǎn)生菌，可促進(jìn)多糖和蛋白質(zhì)的降解，有利于大曲產(chǎn)酒生香[17]，其在BH和BM發(fā)酵過(guò)程中相對(duì)豐度呈先下降、經(jīng)頂溫區(qū)后上升的趨勢(shì)，發(fā)酵后期成為優(yōu)勢(shì)菌。Diutina為BH發(fā)酵前期優(yōu)勢(shì)菌，隨溫度升高生長(zhǎng)受到抑制，可能其為不耐熱菌。嗜熱真菌屬(Thermomyces)為BH和BM發(fā)酵后期優(yōu)勢(shì)菌，出現(xiàn)于頂溫區(qū)后，BM中其相對(duì)豐度高于BH。曲霉屬(Aspergillus)能產(chǎn)生多種蛋白酶及其他分解酶類(lèi)，對(duì)大曲糖化力和生香作用均有影響，在BH發(fā)酵末期相對(duì)豐度低于BM，可能由于BH發(fā)酵過(guò)程的頂溫超過(guò)Aspergillus所耐受最高溫度。

從圖3-b中可知，糖多孢菌屬(Saccharopolyspora)、魏斯氏菌屬(Weissella)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、片球菌屬(Pediococcus)、放線多孢菌屬(Actinopolyspora)和腸桿菌(Enterobacter)是BH和BM發(fā)酵中的優(yōu)勢(shì)菌。Saccharopolyspora能產(chǎn)生酶類(lèi)和纖維素降解促進(jìn)因子，是安全的生物資源菌[18]，其在BM中的相對(duì)豐度高于BH，BM發(fā)酵中其相對(duì)豐度在中期上升之后下降；BH發(fā)酵過(guò)程中其在22 d成為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌而后下降。Lactobacillus、Weissella、Pediococcus作為乳酸菌，被認(rèn)為是白酒發(fā)酵過(guò)程中重要的產(chǎn)風(fēng)味菌屬，可代謝產(chǎn)生乳酸、乙酸等有機(jī)酸，為白酒中風(fēng)味物質(zhì)的形成提供前體[19]。Weissella在BM發(fā)酵前期的相對(duì)豐度高于BH。在1～4 d時(shí)，BM發(fā)酵過(guò)程中Pediococcus的相對(duì)豐度明顯升高，而在BH中其相對(duì)豐度僅為1.1～3.6%。進(jìn)入頂溫區(qū)之后，Weissella和Pediococcus受熱失活，因此相對(duì)豐度有一定的降低。Lactobacillus在BH中相對(duì)豐度遠(yuǎn)高于BM。由于乳酸菌具有一定耐熱性，在進(jìn)入頂溫區(qū)之后，其失活速度低于其他不耐熱菌，因此在BH中其相對(duì)豐度仍高于BM。同時(shí)Enterobacter在BH中相對(duì)豐度低于BM，且經(jīng)過(guò)頂溫區(qū)后均下降，這與Enterobacter耐高溫性能較低有關(guān)。

2.3 大曲固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中酸度及還原糖的變化

如圖4所示，BH的酸度在發(fā)酵前2 d迅速上升，可能是由于產(chǎn)酸細(xì)菌(如Lactobacillus)代謝旺盛(圖3-b)[20]。初始酸度BH高于BM，但BH的酸度下降緩慢，說(shuō)明起始產(chǎn)酸微生物具有一定的耐熱性。而B(niǎo)M的酸度下降迅速，可能是由于前期溫度上升至超過(guò)產(chǎn)酸細(xì)菌的耐熱溫度，與Weissella、Lactobacillus、Pediococcus相對(duì)豐度的變化相符(圖3)。然而，在發(fā)酵7～24 d BH的酸度要高于BM，可能是由于發(fā)酵中期較高品溫抑制其他微生物生長(zhǎng)，且耐熱芽孢桿菌(Bacillus)僅在BH此階段出現(xiàn)，可代謝產(chǎn)生有機(jī)酸。后期酸度的下降可能是由于有機(jī)酸降解或與醇反應(yīng)生成酯類(lèi)等。

a- BH;b- BM

a- BH;b- BM

大曲中還原糖含量均處于動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程(圖5)，可能是因?yàn)槲⑸锷L(zhǎng)以還原糖作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的同時(shí)，代謝產(chǎn)淀粉酶、糖化酶降解原料中的淀粉等物質(zhì)生成還原糖[21]。初始還原糖含量BH低于BM，且BH在發(fā)酵前8 d呈上升趨勢(shì)，可能是由于僅在BH原料中添加的豌豆粉含有豐富的糖化酶，且從圖5可知BH糖化酶活力在4～6 d上升，同時(shí)其還原糖含量再次急劇升高。而B(niǎo)M還原糖含量呈下降趨勢(shì)，可能是由于溫度迅速上升，糖化酶活力下降，微生物的消耗速率大于其降解產(chǎn)還原糖的速率。進(jìn)入頂溫區(qū)后，BH和BM的還原糖含量急劇下降，可能是糖化酶活力均處于較低水平及微生物生長(zhǎng)大量消耗。

2.4 大曲固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中酸性蛋白酶活力、糖化力及酯化力的變化

白酒發(fā)酵在酸性環(huán)境下進(jìn)行，許多香味物質(zhì)來(lái)自蛋白質(zhì)的分解產(chǎn)物及美拉德反應(yīng)，所以酸性蛋白酶對(duì)白酒風(fēng)味的形成具有直接影響[15]。如圖6-a、6-b所示，BH酸性蛋白酶活性在1～4 d上升，而B(niǎo)M酸性蛋白酶活力只在1～2 d上升，且BM下降速率要高于BH。這可能是由于大曲發(fā)酵前期BH和BM中Lactobacillus和Weissella的豐度均較高(圖3-b)，產(chǎn)酸能力較高，故保持較高酶活。但隨著大曲發(fā)酵，產(chǎn)酸細(xì)菌逐漸減少，BM中變化尤為明顯，從而造成BM中酶活更快地下降。經(jīng)過(guò)頂溫區(qū)后，大部分微生物生長(zhǎng)受到抑制，BH和BM的酸性蛋白酶活力趨于平穩(wěn)。Aspergillusniger、Monascus和Aspergillusoryzae是代謝產(chǎn)酸性蛋白酶的重要微生物[22]。出房時(shí)BM和BH的蛋白酶活力分別控制在33和23 U/g，且BM中Aspergillus的豐度明顯高于BH。這些結(jié)果說(shuō)明Aspergillus可能是導(dǎo)致BM發(fā)酵后期酸性蛋白酶活性更高的原因。

a- BH;b- BM;c- BH;d- BM;e- BH;f- BM

大曲中糖化力的變化是由小麥本身糖化酶活力的破壞和微生物糖化酶的生成共同作用[23]。如圖6-c, 6-d所示，大曲起始較高的糖化酶活力主要來(lái)自于大曲原料小麥等，之后在發(fā)酵過(guò)程被破壞，失活程度大于微生物代謝生成量。BH糖化力在3～6 d急劇上升，可能是由于此階段還未到高溫期，且大曲原料中的淀粉不能被大多數(shù)酵母和細(xì)菌直接利用，因此需通過(guò)絲狀真菌產(chǎn)生的α-淀粉酶和葡糖淀粉酶將其水解為可發(fā)酵的糖[24]，如Monascus在BH此發(fā)酵階段相對(duì)豐度從0.1%上升至0.5%，其作為糖化菌能利用各種糖類(lèi)。BM由于前期溫度上升較快及微生物的消耗，糖化酶活力下降，BM在7～15 d高品溫區(qū)后糖化酶活力下降緩慢，而B(niǎo)H經(jīng)過(guò)8～16 d高品溫區(qū)后糖化酶活力下降較多，可能由于高品溫使霉菌生長(zhǎng)代謝受到抑制，產(chǎn)糖化酶的量減少，且糖化酶活性的耐熱性不強(qiáng)[25]，活力受到抑制。有研究表明，根毛霉(Rhizomucor)和Aspergillus是大曲中淀粉酶、葡糖淀粉酶和纖維素酶的主要生產(chǎn)者[21]。而Rhizomucor和Aspergillus在BM中相對(duì)豐度高于BH(圖3)，因此造成BM發(fā)酵后期糖化力高于BH的現(xiàn)象。且BM在發(fā)酵后期，還原糖含量有明顯的上升，可能與其糖化力較高有關(guān)。

酯化力是反應(yīng)大曲生香能力的重要指標(biāo)，是指酸和醇結(jié)合，脫去1個(gè)水分子形成酯的能力[26]。酯化力主要由大曲中霉菌、酵母生成，發(fā)酵前期它們大量生長(zhǎng)繁殖并啟動(dòng)代謝酯化酶[27]，從圖6可知，BH和BM在高品溫區(qū)時(shí)，代謝酯化酶達(dá)到高峰并催化酯化反應(yīng)，促進(jìn)香味物質(zhì)的積累。研究發(fā)現(xiàn)Candida在醬香型大曲中不僅具有醇類(lèi)發(fā)酵的作用，且其豐度也與酯酶的含量呈正相關(guān)[28]。Candida是BM和BH發(fā)酵前期優(yōu)勢(shì)真菌，對(duì)特香型大曲的酯化力可產(chǎn)生較大影響。經(jīng)過(guò)高品溫區(qū)后，隨著Candida豐度下降，大曲的酯化力下降。同樣，有研究表明，Rhizomucor和Thermomyces在不同大曲中對(duì)酯類(lèi)物質(zhì)的增加具有重要的作用[2, 28]。而圖6-e、6-f顯示出房時(shí)BM酯化力高于BH，這可能是由于發(fā)酵后期BM中Rhizomucor和Thermomyces的相對(duì)豐度高于BH(圖3-a)。

3 結(jié)論

大曲在白酒釀造中具有提供微生物來(lái)源，糖化發(fā)酵、投糧及生香作用。品溫被認(rèn)為是評(píng)估大曲固態(tài)發(fā)酵過(guò)程的關(guān)鍵環(huán)境變量之一。Illumina MiSeq測(cè)序結(jié)果表明，2批大曲發(fā)酵過(guò)程中優(yōu)勢(shì)菌相似但動(dòng)態(tài)變化存在明顯差異。同時(shí)發(fā)現(xiàn)由于頂溫的不同，大曲理化指標(biāo)的變化趨勢(shì)也存在部分差異。該文通過(guò)研究不同頂溫對(duì)大曲微生物群落及理化指標(biāo)的影響，有利于酒曲功能微生物的篩選與其在特香型白酒中的高效利用，對(duì)提高酒曲生產(chǎn)質(zhì)量及特香型白酒的釀造控制具有良好的理論指導(dǎo)，在一定程度上推動(dòng)特香型白酒行業(yè)的發(fā)展。