γ-CGTase酶學(xué)性質(zhì)及產(chǎn)物特異性影響因素

鄭丹妮，柏玉香，紀(jì)杭燕，李曉曉，王禹，蔣彤，金征宇*

1(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122) 2(食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無(wú)錫，214122)

環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(cyclodextrin glycosyltransferase, CGTase)是一種多功能型酶，能催化4種不同的反應(yīng)：3種轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)(歧化反應(yīng)、環(huán)化反應(yīng)和偶合反應(yīng))和水解反應(yīng)?，F(xiàn)階段，歧化、偶合反應(yīng)主要用于制備甜菊糖苷[1]、葡萄糖苷[2]、L-抗壞血酸[3]，環(huán)化活力主要應(yīng)用于生產(chǎn)環(huán)糊精(cyclodextrin, CD)。根據(jù)反應(yīng)初期產(chǎn)物中主要CD的類型[4]，將CGTase分為α-CGTase、β-CGTase、γ-CGTase。由于γ-CGTase的主產(chǎn)物γ-CD存在分子空腔大、溶解性好及安全性高的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，以及在小腸中γ-CD可被淀粉酶作用后降解吸收而α-CD、β-CD不能被降解[5]，使得γ-CD在醫(yī)藥、食品、材料、環(huán)境、化妝品等領(lǐng)域有著特殊應(yīng)用[6-9]。因此，γ-CGTase作為γ-CD生產(chǎn)中的關(guān)鍵酶制劑，對(duì)其進(jìn)行篩選、改造及其生產(chǎn)γ-CD工藝條件的優(yōu)化一直是研究熱點(diǎn)。

γ-CGTase作用淀粉或其衍生物的產(chǎn)物為α-CD、β-CD、γ-CD的混合物，只在特定反應(yīng)階段中單一CD含量較高。目前已報(bào)道的γ-CGTase共有8種，來(lái)源于Bacillussp. G-825-6[10]的γ-CGTase產(chǎn)物中γ-CD占總CD比例高且不產(chǎn)生α-CD，但淀粉轉(zhuǎn)化率極低；來(lái)源于Bacillusclarkii7364[11]的γ-CGTase產(chǎn)物中γ-CD比例高，但體系中存在的α-CD因溶解度高給γ-CD實(shí)際純化帶來(lái)不便。為此，國(guó)內(nèi)外研究者在改變產(chǎn)物特異性方面進(jìn)行了相關(guān)研究。王磊[12]在來(lái)源于Bacillusclarkii7364的γ-CGTase作用淀粉反應(yīng)體系中，加入5%(m/V)環(huán)十二酮來(lái)提高γ-CD產(chǎn)率；王寧[13]也利用同樣的γ-CGTase，在反應(yīng)體系中添加2%(m/V)甘草酸改變?chǔ)?CGTase產(chǎn)物比例；李林林[14]以Bacillussp. G-825-6 γ-CGTase為基礎(chǔ)，通過(guò)將211位酪氨酸突變?yōu)榱涟彼醽?lái)改變產(chǎn)物特異性，產(chǎn)物專一性提高了40.94%。

總體而言，國(guó)內(nèi)外現(xiàn)有的γ-CGTase菌株較少，且γ-CGTase產(chǎn)物特異性較差。為此，本研究將γ-CGTase共有保守區(qū)域及特有氨基酸作為判斷指標(biāo)，在美國(guó)國(guó)家生物信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)中，通過(guò)序列比對(duì)及生物信息學(xué)分析，篩選出一種新型基因，并將其克隆表達(dá)后得到γ-CGTase；通過(guò)反應(yīng)時(shí)間、淀粉質(zhì)量濃度及乙醇濃度來(lái)改變?chǔ)?CGTase產(chǎn)物特異性，以期提供一種新型γ-CGTase以及為改變?chǔ)?CGTase產(chǎn)物特異性提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

α-CD、β-CD、γ-CD,上海阿拉丁生化科技股份有限公司；可溶性淀粉，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；溴甲酚綠，上海麥克林生化科技有限公司；BCA試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；蛋白上樣緩沖液，上海生工生物工程股份有限公司；預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，南京生興生物技術(shù)有限公司；乙腈，美國(guó)TEDIA有限公司?；瘜W(xué)試劑均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

蛋白電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)，中國(guó)天能有限公司；超聲波清洗器，上海聲譜超聲設(shè)備廠；高速冷凍離心機(jī)5804R，艾本德國(guó)貿(mào)易有限公司；酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices公司；超聲波細(xì)胞破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；pH計(jì)，Mettler Toledo公司；電子天平，Mettler Toledo公司；高效液相色譜，日本島津公司；Milli-Q-超純水制備儀，默克有限公司；超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用，美國(guó)waters公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因挖掘及序列分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中，以目前報(bào)道的γ-CGTase為模板，進(jìn)行序列相似性比較，選擇比對(duì)結(jié)果中相似度在30% ～ 90%的序列進(jìn)一步分析。以6個(gè)保守區(qū)域、3個(gè)關(guān)鍵氨基酸為CGTase的基本判斷指標(biāo)，-3亞位點(diǎn)47位氨基酸Thr、-3亞位點(diǎn)序列HP_G(E)GF_、-7亞位點(diǎn) (145-152) D-----I區(qū)域?yàn)棣?CGTase特征鑒定依據(jù)，最終篩選得到來(lái)自于Bacillussp. FJAT-44876的一段基因序列。利用MEGA6軟件的Muscle模式和現(xiàn)有α-、β-、γ-CGTase進(jìn)行序列比對(duì)，并繪制γ-CGTase保守區(qū)域及關(guān)鍵序列比對(duì)圖。

1.2.2 酶的克隆表達(dá)

在北京華大基因公司合成來(lái)自于Bacillussp. FJAT-44876的基因序列(NCBI登錄號(hào)：WP 096185680)，以pET-15b為載體，轉(zhuǎn)至E.coliBL21(DE3)進(jìn)行表達(dá)。將E.coliBL21(DE3)置于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB肉湯培養(yǎng)基中，在37 ℃、200 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)直至OD600達(dá)到0.4～0.6。隨后，加入終濃度為40 μmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，于18 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)24 h。在4 ℃、10 000 r/min的條件下離心8 min獲得菌體，隨后用20 mmol/L Tris-HCl (250 mmol/L NaCl, pH 7.5)溶液洗滌2次并采用上述條件離心。將離心后的菌體置于冰水混合物中超聲破碎20 min，最終4 ℃、10 000 r/min的條件下離心30 min獲得粗酶液。

1.2.3 酶的分離純化

首先利用去離子水和20 mmol/L Tris-HCl (250 mmol/L NaCl, pH 7.5)對(duì)鎳親和凝膠進(jìn)行清洗和平衡，上樣粗酶液，重力流穿后再依次利用含不同摩爾濃度咪唑溶液的20 mmol/L Tris-HCl (250 mmol/L NaCl, pH 7.5)進(jìn)行洗脫，并收集洗脫液，最后對(duì)鎳親和凝膠進(jìn)行平衡及保存，以上操作均在冰水浴條件下進(jìn)行。隨后采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測(cè)定酶分子量和Bradford法測(cè)定酶濃度。

1.2.4 酶活力測(cè)定方法

參考FUWA[15]溴甲酚綠 (BCG)法并稍作改進(jìn)，對(duì)上述步驟制得CGTase的環(huán)化活力進(jìn)行測(cè)定。將900 μL 15 mg/mL可溶性淀粉和100 μL CGTase在50 ℃、pH 10.0條件下保溫10 min，沸水浴10 min滅酶，再向上述體系中加入50 μL 1 mol/L HCl，100 μL 5 mol/L BCG以及2 mL 0.2 mol/L檸檬酸緩沖液 (pH 4.2)，將反應(yīng)混合物在室溫下放置20 min后于630 nm處測(cè)定吸光值，其中空白不添加酶液。

酶活力單位定義為：每分鐘生成1 mg γ-CD所需加酶量為1個(gè)酶活力單位 (U)。

1.2.5 γ-CGTase最適溫度測(cè)定

將900 μL 15 mg/mL可溶性淀粉和100 μL (0.09 U) γ-CGTase混合，分別將反應(yīng)溫度設(shè)置在30～70 ℃范圍內(nèi)，間隔10 ℃，在pH 10.0條件下保溫10 min，沸水浴10 min滅酶，測(cè)定不同溫度下γ-CGTase酶活力。將最大酶活力者定義為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力。以溫度為橫坐標(biāo)，相對(duì)酶活力為縱坐標(biāo)繪制溫度-相對(duì)酶活力曲線。

1.2.6 γ-CGTase最適pH測(cè)定

配制20 mmol/L pH 3.0～12.0的緩沖溶液(pH 3.0～5.0醋酸鹽緩沖液，6.0～8.0磷酸鹽緩沖液，8.5～12.0甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液)，使用該緩沖溶液配制不同pH下的15 mg/mL可溶性淀粉，取900 μL上述可溶性淀粉與100 μL (0.09 U) γ-CGTase混合，在50 ℃下保溫10 min，沸水浴10 min滅酶，測(cè)定不同pH下γ-CGTase酶活。將最大酶活力者定義為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力。以pH為橫坐標(biāo)，相對(duì)酶活力為縱坐標(biāo)繪制pH-相對(duì)酶活力曲線。

1.2.7 動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

以1、2、5、7.5、10、15、18、20 mg/mL不同質(zhì)量濃度的可溶性淀粉作底物，在最適溫度50 ℃、最適pH 10.0的條件下反應(yīng)，測(cè)定酶學(xué)動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

1.2.8 有機(jī)溶劑對(duì)γ-CGTase酶活影響

將最終體積分?jǐn)?shù)為1%的甲醇、乙醇、異丙醇、正丁醇、環(huán)己烷、十二醇加入到γ-CGTase中，4 ℃條件下放置1 h，測(cè)定不同有機(jī)溶劑作用下殘余酶活力，將未添加有機(jī)溶劑的γ-CGTase酶活力定義為100%。

1.2.9 不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)γ-CGTase產(chǎn)物特異性影響

將15 mg/mL可溶性淀粉和γ-CGTase (5.23 U/g干基淀粉) 按比例混合，在pH 10.0、50 ℃的條件下保溫2、4、6、8、10、15、20、30、40、50、60、90、120、150、180、240、300、360、420 min，利用HPLC測(cè)定不同時(shí)間下產(chǎn)物的生成。

1.2.10 不同淀粉濃度對(duì)γ-CGTase產(chǎn)物特異性影響

將10、15、30、50、70、100 mg/mL可溶性淀粉和γ-CGTase (5.23 U/g干基淀粉) 按比例混合，在pH 10.0、50 ℃的條件下反應(yīng)6 h，利用HPLC測(cè)定最終產(chǎn)物。

1.2.11 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)數(shù)對(duì)γ-CGTase產(chǎn)物特異性的影響

以50 mg/mL可溶性淀粉為底物，添加γ-CGTase (5.23 U/g干基淀粉) 和最終體積分?jǐn)?shù)為1%、1.5%、3%、5%、7%、10%的乙醇，在最適溫度50 ℃、最適pH 10.0的條件下反應(yīng)6 h，利用HPLC測(cè)定最終產(chǎn)物。

1.2.12 高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定

參考JI[16]的方法并稍作修改。HPLC色譜條件為：XBridge Amide (4.6 mm × 250 mm, 5 μm) 分析柱；流動(dòng)相為V(乙腈)∶V(水)=65∶35；柱溫30 ℃；流速0.8 mL/min；進(jìn)樣量20 μL。

1.2.13 超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-MS)測(cè)定

UPLC使用條件為：Waters-Acquity UPLC色譜儀；BEH Aminde (2.1 mm×100 mm, 1.7 μm)分析柱；流動(dòng)相為純乙腈(A液)，0.1%氨水(B液)；洗脫條件為75% A液與25% B液平衡5 min后洗脫15 min，65% A液與35% B液洗脫15 min，50% A液與50% B液洗脫15 min，最終使用100% A液保存柱子；柱溫40 ℃；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量1 μL。MS使用條件：ESI-離子方式；毛細(xì)管電壓3.0 V；離子源溫度100 ℃；碰撞能量6 V；質(zhì)譜范圍(m/z)100～3 000。

1.2.14 數(shù)據(jù)處理方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果為3次數(shù)據(jù)的平均值，以其標(biāo)準(zhǔn)偏差表示誤差線，利用Origin軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 γ-CGTase生物信息學(xué)分析

采用MEGA6軟件將NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中Bacillussp. FJAT-44876的蛋白序列與已知表達(dá)α-CD、β-CD和γ-CD的CGTase序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果如圖1-A所示。來(lái)源于Bacillussp. FJAT-44876的蛋白序列共有5個(gè)結(jié)構(gòu)域(數(shù)據(jù)未體現(xiàn))[17]、6個(gè)保守區(qū)域、3個(gè)關(guān)鍵氨基酸，保守區(qū)Ⅲ、Ⅴ的Asp和保守區(qū)Ⅳ的Glu是 CGTase參與催化的保守殘基[18]，其中保守區(qū)Ⅲ的Asp為親核基團(tuán)，可作為穩(wěn)定中間體，保守區(qū)Ⅳ的Glu 為可能的質(zhì)子供體，保守區(qū)Ⅴ的Asp為底物結(jié)合位點(diǎn)。研究表明，CGTase在-3、-7亞位點(diǎn)特有氨基酸的差異將導(dǎo)致產(chǎn)物特異性不同[19]，來(lái)源于Bacillussp. FJAT-44876的蛋白序列與已知CGTase特有序列比對(duì)結(jié)果如圖1-B所示。-3亞位點(diǎn)47位氨基酸是區(qū)分α-、β-、γ-CGTase的關(guān)鍵位點(diǎn)，來(lái)源于Bacillussp. FJAT-44876的蛋白序列在該位點(diǎn)存在γ-CGTase特有氨基酸Thr，而α-、β-CGTase在相應(yīng)位點(diǎn)主要為L(zhǎng)ys或Arg，表明47位氨基酸在CGTase產(chǎn)物特異性中扮演著重要角色[20]，同時(shí)，相比于α-、β-CGTase，γ-CGTase為具備更多空間結(jié)合糖基鏈以形成CD8，在-3亞位點(diǎn)存在序列HP_G(E)GF_，而α-、β-CGTase擁有序列INYSGVN(N)[21]。此外，為了擁有更大的空間，γ-CGTase在-7亞位點(diǎn)(145-152)缺失6個(gè)氨基酸形成D------I區(qū)域，以便促使γ-CD環(huán)的形成，而α-、β-CGTase分別為SSTDPSFA、SSDQPSFA。將基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)序列進(jìn)行BLAST比較，發(fā)現(xiàn)該序列與已知的γ-CGTase：Bacillussp. G-825-6和Bacillusclarki7364相似度均為70%，依據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果，初步判斷克隆表達(dá)的酶為γ-CGTase。

圖1 γ-CGTase保守區(qū)域及關(guān)鍵序列分析

2.2 重組蛋白質(zhì)的分離純化

利用SDS-PAGE對(duì)鎳親和凝膠純化后的γ-CGTase進(jìn)行分子量測(cè)定。來(lái)源于Bacillussp. FJAT-44876編碼的蛋白質(zhì)由711個(gè)氨基酸組成，氨基酸序列計(jì)算的理論分子量為80.039 kDa。SDS-PAGE結(jié)果顯示目的條帶分子量大約為80 kDa(圖2)，與理論值相近，表明重組酶成功表達(dá)。

2.3 γ-CGTase定性分析

圖2 純化后γ-CGTase的SDS-PAGE分析

以900 μL 15 mg/mL可溶性淀粉為底物，加入γ-CGTase (0.09 U) 在50 ℃、pH 10.0條件下反應(yīng)2 h，利用HPLC對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定性分析，結(jié)果如圖3所示。HPLC圖譜顯示，反應(yīng)2 h時(shí)主要產(chǎn)物為γ-CD；此外，利用UPLC-MS (圖4) 進(jìn)一步驗(yàn)證，保留時(shí)間為8.370的質(zhì)譜表明，此物質(zhì)的[M-H]-=1 295.5，則其相對(duì)分子質(zhì)量為1 297，與γ-CD標(biāo)準(zhǔn)品出峰位置及相對(duì)分子質(zhì)量一致(數(shù)據(jù)未顯示)，確定該物質(zhì)為γ-CD。由于CGTase種類依據(jù)反應(yīng)初期其主產(chǎn)物類型進(jìn)行判斷[4]，故進(jìn)一步確定該酶為γ-CGTase。

圖3 γ-CGTase產(chǎn)物高效液相色譜圖

圖4 γ-CGTase產(chǎn)物的超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用圖

2.4 γ-CGTase的最適溫度

溫度是影響酶催化作用的一個(gè)重要因素，在最適溫度下，酶催化活性最強(qiáng)，酶促反應(yīng)速率最大，當(dāng)反應(yīng)溫度高于或低于最適溫度時(shí)，酶活力均會(huì)降低進(jìn)而影響酶促反應(yīng)速率。由圖5可知，γ-CGTase的最適溫度為50 ℃，與現(xiàn)有報(bào)道的γ-CGTase最適溫度40～65 ℃接近[22-23]。γ-CGTase酶活力隨反應(yīng)溫度的升高而呈上升趨勢(shì)，當(dāng)溫度達(dá)到50 ℃時(shí)，其酶活力最大，酶促反應(yīng)速率最快，隨后，溫度的不斷升高導(dǎo)致酶活力持續(xù)下降，最直接原因是高溫使酶空間結(jié)構(gòu)破壞，酶活力降低。

圖5 溫度對(duì)γ-CGTase酶活力的影響

2.5 γ-CGTase的最適pH

pH是影響酶催化活性的另一個(gè)重要因素，主要原因是不同pH環(huán)境可影響酶活性中心構(gòu)象，使其發(fā)生輕微變化最終導(dǎo)致酶催化活性改變[24]，由圖6可知，γ-CGTase最適pH為10.0，同時(shí)在7.0～11.0范圍內(nèi)有80%以上的相對(duì)酶活力，表明γ-CGTase在堿性條件下酶活力較高，與其來(lái)源于堿性芽孢桿菌屬有關(guān)。就目前報(bào)道而言，γ-CGTase最適pH與Bacillussp. G-825-6[10]、Bacillusclarkii7364[11]相近，而比Bacillussp. AL-6[22]、Bacillusfirmus/lentus290-3[23]最適pH值更高，這有利于高濃度淀粉底物的糊化。此外，γ-CGTase在pH 6～11范圍內(nèi)，殘余酶活力均大于70%，最適pH范圍較廣，與CGTase相關(guān)報(bào)道一致[25-26]。

圖6 pH對(duì)γ-CGTase酶活力的影響

2.6 γ-CGTase動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)可表征一個(gè)酶的基本性質(zhì)，米氏常數(shù)(Km)、轉(zhuǎn)化數(shù)(kcat)及最大反應(yīng)速率(Vmax)不僅可判斷酶的最適底物、酶與底物親和力大小，還能確定酶促反應(yīng)速率，結(jié)果如表1所示。與王磊[12]報(bào)道的來(lái)源于Bacillusclarkii7364的γ-CGTase動(dòng)力學(xué)參數(shù)相比，kcat值較高，說(shuō)明γ-CGTase與可溶性淀粉親和力較高。

表1 γ-CGTase的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

2.7 有機(jī)溶劑對(duì)γ-CGTase酶活力的影響

有機(jī)溶劑在當(dāng)前環(huán)糊精生產(chǎn)中必不可少，其不僅可改變產(chǎn)物比例，還對(duì)CGTase酶活力產(chǎn)生一定影響。如圖7所示，甲醇、乙醇、環(huán)己烷、十二醇對(duì)γ-CGTase酶活力有一定的提高作用，相對(duì)而言，乙醇對(duì)γ-CGTase酶活力提高效果更為明顯，而異丙醇和正丁醇使γ-CGTase酶活力降低，主要原因是不同CGTase對(duì)有機(jī)溶劑具有不同耐受性，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變程度不同，進(jìn)而導(dǎo)致酶活力不同。

圖7 有機(jī)溶劑對(duì)γ-CGTase酶活力的影響

2.8 反應(yīng)時(shí)間及淀粉濃度對(duì)γ-CGTase產(chǎn)物特異性影響

在實(shí)際反應(yīng)過(guò)程中，因CGTase還存在偶合、水解、歧化活力，使生成的CD可被作為底物繼續(xù)反應(yīng)，導(dǎo)致不同反應(yīng)時(shí)間、不同淀粉濃度下的產(chǎn)物比例不同。如圖8-A所示，在0～6 h內(nèi)，γ-CGTase反應(yīng)體系中主產(chǎn)物為γ-CD且γ-CD產(chǎn)量呈上升趨勢(shì)，β-CD含量緩慢增加。6～7 h，γ-CD含量減少，而β-CD仍在增加，產(chǎn)物比例發(fā)生明顯變化，主要原因[27]可能是在環(huán)化反應(yīng)進(jìn)行的同時(shí)，γ-CGTase將反應(yīng)生成的CD和麥芽低聚糖作為底物，通過(guò)偶合反應(yīng)使CD生成線性麥芽低聚糖，而γ-CD比β-CD更適合作為γ-CGTase偶合反應(yīng)底物，最終導(dǎo)致6～7 h內(nèi)，γ-CD含量減少而β-CD含量增加。圖8-B的結(jié)果表明，高濃度淀粉反應(yīng)的產(chǎn)物中γ-CD含量小于β-CD，而相同反應(yīng)條件下，低濃度淀粉產(chǎn)物中γ-CD含量遠(yuǎn)大于β-CD，主要因?yàn)榉磻?yīng)體積一定時(shí)，高濃度淀粉分子與酶相互碰撞幾率增大，反應(yīng)速率加快，生成較多的麥芽低聚糖；產(chǎn)物中麥芽低聚糖可進(jìn)一步與CD發(fā)生偶合反應(yīng)，由于γ-CD偶合速率比β-CD快，使得高濃度淀粉反應(yīng)體系中生成的γ-CD含量小于β-CD。

圖8 反應(yīng)時(shí)間(A)、淀粉濃度(B)對(duì)γ-CGTase產(chǎn)物特異性影響

2.9 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)γ-CGTase產(chǎn)物特異性影響

乙醇因其危害性低、揮發(fā)性良好且抑菌性效果明顯，在改變CGTase產(chǎn)物特異性中得到廣泛應(yīng)用[28]。為了更好地探究乙醇對(duì)改變產(chǎn)物特異性的效果，選擇生成β-CD含量相對(duì)較高的淀粉濃度作為底物，最終以50 mg/mL淀粉為研究對(duì)象。如圖9所示，對(duì)照組中γ-CGTase反應(yīng)6 h后β-CD比γ-CD含量更多，主要因?yàn)棣?CGTase的偶合作用使γ-CD含量減少；與對(duì)照組相比，乙醇的添加明顯使γ-CD得到有效保留，原因可能是極性較高的乙醇會(huì)排除水分子進(jìn)入γ-CGTase活性中心，減弱水解反應(yīng)，從而減少麥芽低聚糖的產(chǎn)生[29]，以及乙醇與麥芽低聚糖結(jié)合減弱γ-CGTase偶合作用[30]，使γ-CD比例提高?？傮w來(lái)看，γ-CD含量隨乙醇最終體積分?jǐn)?shù)的增加呈上升趨勢(shì)，當(dāng)乙醇最終體積分?jǐn)?shù)大于5%時(shí)，γ-CD含量有微弱減少，主要因?yàn)楦邼舛纫掖辑h(huán)境中，γ-CGTase酶活損失和淀粉底物利用度降低。此外，由表2可知，與對(duì)照組相比，添加乙醇后γ-CD占總CD的比例明顯增大，尤其是在10%的乙醇最終體積分?jǐn)?shù)下，該比例由40.11%增加至78.20%，專一性提高了94.96%，表明乙醇在改變?chǔ)?CGTase產(chǎn)物特異性方面具有廣泛前景。

圖9 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)γ-CGTase產(chǎn)物特異性影響

表2 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇作用下γ-CGTase產(chǎn)物比例

3 結(jié)論

將來(lái)源于Bacillussp. FJAT-44876的一段基因進(jìn)行克隆，并在E.coliBL21(DE3)異源表達(dá)，經(jīng)鎳柱純化后，對(duì)γ-CGTase進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定及產(chǎn)物特異性影響因素研究。該酶分子質(zhì)量大約為80 kDa，最適溫度50 ℃，最適pH 10.0。反應(yīng)時(shí)間、淀粉質(zhì)量濃度及乙醇濃度均對(duì)γ-CGTase產(chǎn)物特異性有影響，其中乙醇影響效果顯著。與對(duì)照組相比，10%乙醇最終體積分?jǐn)?shù)下，γ-CGTase作用生成的CD中γ-CD所占比例由40.11%增加至78.20%，專一性提高了94.96%。這將為γ-CD生產(chǎn)提供一種新型γ-CGTase，并為改變?chǔ)?CGTase產(chǎn)物特異性提供基礎(chǔ)。