單/雙磷酸化酪氨酸底物與蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B相互作用分子動力學(xué)研究

董振科，劉夢源，程先超，王潤玲

（天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，天津市臨床藥物關(guān)鍵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300070）

蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B（protein tyrosine phosphatase 1B,PTP1B）是第一個(gè)被分離、純化并得到晶體結(jié)構(gòu)的蛋白酪氨酸酯酶[1-2]。PTP1B是一個(gè)分子量為37 kD的胞內(nèi)酶，由PTP1N編碼，含435個(gè)氨基酸殘基。其中30~278個(gè)氨基酸組成了催化活性部位[3]。在生理?xiàng)l件下PTP1B起著負(fù)反饋調(diào)節(jié)胰島素和瘦素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用。當(dāng)其活性增強(qiáng)時(shí)，可促使磷酸化的胰島素受體（IR）和它的底物（IRS）以及磷酸化瘦素去磷酸化，從而下調(diào)胰島素和瘦素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，減弱胰島素和瘦素的作用[4-5]。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)了PTP1B與癌癥治療密切相關(guān)[6-7]。因此，以PTP1B作為藥物治療靶點(diǎn)，開發(fā)高親和力的新型PTP1B抑制劑，已成為最近幾年研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。Salmeen等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，雙磷酸化酪氨酸底物與PTP1B親和能力要比單磷酸化酪氨酸底物高70%。Puius等[9]的研究表明，雙磷酸化酪氨酸底物擬似物抑制劑與PTP1B結(jié)合能要比單磷酸化酪氨酸底物擬似物抑制劑高。所以，進(jìn)一步研究上述兩種不同底物與PTP1B相互作用模式的差異，發(fā)現(xiàn)雙磷酸化酪氨酸底物與PTP1B高親和力的原因，可以為開發(fā)PTP1B抑制劑提供新的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 構(gòu)建分子動力學(xué)模擬起始結(jié)構(gòu) 從RCSB蛋白數(shù)據(jù)庫下載人的單磷酸化酪氨酸底物與PTP1B復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID:1G1G）和人的雙磷酸化酪氨酸底物與PTP1B復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID:1G1H）。去除晶體結(jié)構(gòu)中的水分子和其它與分子動力學(xué)模擬無關(guān)的雜分子，將PTP1B中的Ala215修改為Cys215（野生型PTP1B第215號殘基為半胱氨酸）。

利用Desmond 9.0分子動力學(xué)軟件包[10-11]向上述兩個(gè)模型中加入簡單點(diǎn)電荷水分子（SPC水分子），周期邊界條件中將生成的盒子形狀定為Cubic，盒子的Buffer值為10魡。向體系中加入反離子，使模擬體系達(dá)到電中性，同時(shí)再向體系中加入0.15 mol/L的氯化鈉，使整個(gè)體系與人體體液環(huán)境等滲。

1.2 分子動力學(xué)模擬參數(shù) 分子動力學(xué)模擬采用NPT系綜，鍵長限制算法為SHAKE，溫度耦合方法為Nose-Hoover，模擬溫度為300K。壓力耦合方法為Martyna-Tobias-Klein，弛豫時(shí)間為2 ps，模擬壓力為 1.01325bar，Coupling style 為 Isotropic，可壓系數(shù)為4.5×10-5。短程靜電相互作用閾值為9魡，長程靜電作用計(jì)算采用Smooth particle mesh Ewald(PME)[12-13]。分子動力學(xué)積分步長為2 fs，首先平衡2 ns，，然后進(jìn)行10 ns的正式分子動力學(xué)模擬，每2 ps記錄一次軌跡文件。

2 結(jié)果

2.1 單磷酸化酪氨酸底物和雙磷酸化酪氨酸底物對PTP1B蛋白骨架運(yùn)動的影響 見圖1、2。

由圖1可知，在10 ns的分子動力學(xué)模擬過程中，單磷酸化酪氨酸底物（1G1G）和雙磷酸化酪氨酸底物（1G1H）的存在對于PTP1B蛋白骨架Cα的均方根偏差數(shù)值變化影響不大，均在0.6～1.4魡范圍內(nèi)波動。

此外，通過計(jì)算兩種不同底物作用下，PTP1B的旋轉(zhuǎn)半徑隨時(shí)間變化的曲線（圖2），可以看出，在整個(gè)分子動力學(xué)模擬的過程中，單磷酸化酪氨酸底物與PTP1B復(fù)合物（1G1G）和雙磷酸化酪氨酸底物與PTP1B復(fù)合物（1G1H）的旋轉(zhuǎn)半徑隨時(shí)間變化的差異不大，在19.2～19.5魡的范圍內(nèi)保持穩(wěn)定波動變化。

通過計(jì)算兩種不同底物在分子動力學(xué)模擬過程中對PTP1B骨架Cα運(yùn)動和旋轉(zhuǎn)半徑變化的影響，可以看出，這兩種不同底物對PTP1B蛋白骨架運(yùn)動的影響不大，說明兩種底物與PTP1B結(jié)合能力的差異不是通過改變蛋白骨架運(yùn)動方式實(shí)現(xiàn)的[14]。

圖1 不同結(jié)構(gòu)復(fù)合物Cα的均方根偏差（RMSD）隨時(shí)間變化曲線Fig 1 The root mean square deviation(RMSD)of Cα atoms for thedifferent systems

圖2 不同結(jié)構(gòu)復(fù)合物旋轉(zhuǎn)半徑隨時(shí)間變化曲線Fig 2 The gyrate radius of the different systems

2.2 單磷酸化酪氨酸底物和雙磷酸化酪氨酸底物對PTP1B活性位點(diǎn)關(guān)鍵殘基的影響 見圖3。

圖3 Asp48殘基的側(cè)鏈二面角分布圖Fig 3 Plotsofχ1/χ2dihedralangledistributionforAsp48ofPTP1B

圖3是在分子動力學(xué)模擬過程中，Asp48側(cè)鏈二面角的分布情況，從圖中可以看出，單磷酸化酪氨酸底物存在情況下PTP1B的Asp48側(cè)鏈二面角分布在3個(gè)區(qū)域中；而雙磷酸化酪氨酸底物存在時(shí)，PTP1B的Asp48側(cè)鏈二面角只分布在一個(gè)區(qū)域內(nèi)。進(jìn)一步氫鍵概率情況統(tǒng)計(jì)表明，單磷酸化酪氨酸底物中的pTyr1163和Arg1164與PTP1B中Asp48形成氫鍵的概率分別為0.440和0.337，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于雙磷酸化酪氨酸底物的pTyr1162和pTyr1163與PTP1B中Asp48形成氫鍵的概率（分別為0.999和 1.000）。

由此可以推斷，磷酸化底物與PTP1B中Asp48形成氫鍵作用的前提是Asp48側(cè)鏈二面角χ2分布在0°～120°之間。但單磷酸化酪氨酸底物與Asp48相互作用時(shí)，會使Asp48側(cè)鏈二面角χ2分布在0°～120°之間的概率降低，導(dǎo)致單磷酸化酪氨酸底物與Asp48之間的氫鍵作用減弱，從而使單磷酸化酪氨酸底物比雙磷酸化酪氨酸底物與PTP1B親和能力降低。

2.3 單磷酸化酪氨酸底物和雙磷酸化酪氨酸底物能量分解分析 見表1～3。

表1 分子動力學(xué)模擬過程中兩種不同磷酸化底物與PTP1B平均總相互作用能（kJ/moL）Tab 2 The average total interaction energies between two kinds of phosphotyrosine substrates and PTP1B during the course of molecular dynamics simulation(kJ/moL)

表2 分子動力學(xué)模擬過程中兩種不同磷酸化底物中各個(gè)殘基與PTP1B平均靜電相互作用能（kJ/moL）Tab 2 The average total electrostatic interaction energies betweenresidues in two kinds of phosphotyrosine substrates andPTP1B during the course of molecular dynamics simulation(kJ/moL)

表3 分子動力學(xué)模擬過程中兩種不同磷酸化底物中各個(gè)殘基與PTP1B平均范德華相互作用能（kJ/moL）Tab 3 The average total van der Wals interaction energies betweenresidues in two kinds of phosphotyrosine substrates andPTP1B during the course of molecular dynamics simulation(kJ/moL)

從表1可以看出，單磷酸化酪氨酸底物的結(jié)合能力明顯低于雙磷酸化酪氨酸底物，雖然單磷酸化酪氨酸底物與PTP1B的范德華相互作用較雙磷酸化酪氨酸底物強(qiáng)，但由于單磷酸化酪氨酸底物與PTP1B的靜電相互作用遠(yuǎn)弱于雙磷酸化酪氨酸底物，所以，兩種不同底物與PTP1B靜電相互作用的差異是造成結(jié)合能力差異的重要原因。

從表2和表3可以看出，兩種不同底物各個(gè)殘基與PTP1B的范德華相互作用相當(dāng)，但1162和1163兩個(gè)殘基與PTP1B之間的靜電相互作用在不同底物中差異明顯。單磷酸化酪氨酸底物Tyr1162和pTyr1163與PTP1B平均靜電相互作用能之和遠(yuǎn)遠(yuǎn)弱于雙磷酸化酪氨酸底物pTyr1162和pTyr1163與PTP1B平均靜電相互作用能之和?？梢姡瑔瘟姿峄野彼岬孜锱c雙磷酸化酪氨酸底物中1163殘基是否磷酸化是決定兩種不同底物與PTP1B結(jié)合能力差異的主要原因。

3 討論

由于PTP1B參與體內(nèi)多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控，開發(fā)PTP1B抑制劑對于治療糖尿病、肥胖癥等多種疾病具有非常重要的意義。開發(fā)酶抑制劑最主要的研究思路就是設(shè)計(jì)酶底物的擬似物，并且設(shè)計(jì)出的酶抑制劑與酶的結(jié)合能力要和底物相當(dāng)。在底物與PTP1B活性位點(diǎn)相互作用的過程中，Asp48在催化過程中可以與磷酸化酪氨酸底物主鏈形成氫鍵作用，從而達(dá)到固定底物，使催化過程順利完成的目的。對于PTP1B而言，目前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)單磷酸化酪氨酸底物和雙磷酸化酪氨酸底物兩種不同形式的底物，其中雙磷酸化酪氨酸底物與PTP1B的結(jié)合能力要強(qiáng)于單磷酸化酪氨酸底物。為了進(jìn)一步分析兩種底物與PTP1B相互作用的差別，找到雙磷酸化酪氨酸底物比單磷酸化酪氨酸底物與PTP1B親和能力高的原因，本研究計(jì)算了分子動力學(xué)過程中底物與PTP1B的平均總相互作用能、平均靜電相互作用能以及平均范德華相互作用能。因此，在研究單磷酸化酪氨酸底物和雙磷酸化酪氨酸底物與PTP1B相互作用差異時(shí)，應(yīng)該考慮這兩種不同底物對Asp48空間構(gòu)象變化的影響。設(shè)計(jì)雙磷酸化酪氨酸底物擬似物的PTP1B抑制劑，可以提高抑制劑與PTP1B的結(jié)合能力，從而產(chǎn)生更強(qiáng)的抑制效果。本研究發(fā)現(xiàn)，雙磷酸化酪氨酸底物與PTP1B的高親和能力是由其與Asp48的氫鍵作用以及兩個(gè)強(qiáng)極性雙磷酸化酪氨酸殘基與PTP1B之間的強(qiáng)靜電相互作用造成的。所以，在設(shè)計(jì)PTP1B抑制劑的過程中，必須要考慮小分子結(jié)構(gòu)中氫鍵供體或受體基團(tuán)與PTP1B的Asp48之間氫鍵作用強(qiáng)弱。同時(shí)，抑制劑分子可以考慮設(shè)計(jì)成雙磷酸化酪氨酸殘基的擬似結(jié)構(gòu)，從而達(dá)到與雙磷酸化酪氨酸底物相當(dāng)?shù)拿赣H和能力。

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