霉菌發(fā)酵劑對干發(fā)酵香腸的理化指標(biāo)、氧化程度及風(fēng)味的影響

蔡嘉銘，王際輝，陶冶，肖珊，劉冰南，王亮

(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連，116034)

傳統(tǒng)干發(fā)酵香腸主要以自然發(fā)酵為主，存在很多食品安全隱患，具有較大的不可控性。將微生物進行純培養(yǎng)作為發(fā)酵劑用于香腸的發(fā)酵，避免了許多不可控性，在很大程度上提高了食品安全性。微生物作為肉制品發(fā)酵劑已被廣泛應(yīng)用，其中酵母菌和乳酸菌為最常用發(fā)酵劑[1]，酵母菌可以促進發(fā)酵肉制品顏色及風(fēng)味的形成，抑制產(chǎn)品酸敗，加速發(fā)酵香腸中脂肪和蛋白質(zhì)的降解，縮短發(fā)酵時間而提高產(chǎn)品品質(zhì)[2]。乳酸菌獨特的產(chǎn)酸性能可以降低肉制品中的pH，對發(fā)酵肉制品中的腐敗菌有抑制作用，同時產(chǎn)生乙酸和乳酸等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，能夠改善風(fēng)味[3]。而霉菌廣泛作用于干腌火腿、奶酪、豆醬等食品加工與發(fā)酵過程中，起到極強的發(fā)酵作用。從干腌火腿中篩選的霉菌通常具有高酶活、抑菌等特點，對于干腌火腿特征性風(fēng)味物質(zhì)形成及品質(zhì)形成等具有較大的作用[4]。另外因霉菌的大量存在起到隔氧的作用, 可防止產(chǎn)品酸敗[5]。國外的干發(fā)酵香腸，例如意大利色拉米、匈牙利色拉米的制備過程中都要有霉菌參與，可使產(chǎn)品具有特殊的氣味與外觀[6]。目前國內(nèi)對于霉菌作為單發(fā)酵劑的研究極少，但霉菌對于食品發(fā)酵起到的重要作用值得探究與應(yīng)用。

本文通過將干腌火腿中分離的高酶活無毒霉菌作為發(fā)酵劑接種于干發(fā)酵香腸中，通過對干發(fā)酵香腸理化指標(biāo)、氧化程度以及風(fēng)味進行測定，探究霉菌對干發(fā)酵香腸的發(fā)酵作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌種

枝孢菌(Cladosporiumcladosporioides)P27從發(fā)酵成熟16個月的宣威火腿中篩選得來，具有較高的脂肪酶和蛋白酶活力，而且不產(chǎn)毒素，菌株通過固體培養(yǎng)后洗滌孢子懸液以備使用。

1.1.2 主要實驗試劑

三氯乙酸、TBA、EGTA、焦磷酸鈉、DNPH、乙酸乙酯、鹽酸胍、KH2PO4等，國藥化學(xué)試劑有限公司；鹽酸、乙醇，北京化工廠。

1.2 主要儀器與設(shè)備

DNP-9082恒溫培養(yǎng)箱，上海精密實驗設(shè)備有限公司；Agilent 7890A型氣相、5975C型質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫科技有限公司; H2050R-1高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司；U-5100分光光度計，日立公司；TA-XT plus質(zhì)構(gòu)儀，美國Stable Micro System公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 干發(fā)酵香腸制作工藝

原料為絞碎的豬肉(肥瘦質(zhì)量比2∶8)100 g，加入食鹽2.8 g、糖1 g、白酒2 g、胡椒粉0.1 g、五香粉0.05 g、花椒粉0.05 g，攪拌均勻后加入枝孢菌孢子懸液，使最終濃度為106CFU/g，空白組不添加孢子懸液。4 ℃下將肉餡腌制10 h，洗滌腸衣后灌腸，25 ℃風(fēng)干發(fā)酵。

1.3.2 干發(fā)酵香腸發(fā)酵過程中理化指標(biāo)分析

選取發(fā)酵第0、5、10、20、30天干發(fā)酵香腸，每次取樣4根，用于指標(biāo)的測定。

1.3.2.1 pH值測定

按照GB 5009.237—2016《食品pH值的測定》規(guī)定的方法進行測定[7]。

1.3.2.2 水分活度測定

將干發(fā)酵香腸剪碎，鋪滿測試杯底，用水分活度儀測定其水分活度。

1.3.2.3 細菌總數(shù)的測定

在超凈臺中切取9 g干發(fā)酵香腸，用無菌剪刀剪碎加入到90 mL無菌生理鹽水中，37 ℃搖瓶30 min得到干發(fā)酵香腸懸濁液，將懸濁液進行適當(dāng)?shù)南♂?，吸? mL稀釋液于PCA固體培養(yǎng)基中涂布，48 h后計數(shù)[8]。

1.3.2.4 質(zhì)構(gòu)的測定

將質(zhì)構(gòu)儀進行校正，設(shè)置參數(shù)，將香腸樣品放于平臺中心位置開始測定。測定參數(shù)如下：測前速度為2 mm/s，測試速度為1 mm/s，位移為10 mm，測試后速度為1 mm/s，負載類型為auto-5 g，下壓距離為樣品高度的50%，高度校正返回距離為30 mm，返回速度為15 mm/s，接觸力為5 g，探頭類型為P/50，數(shù)據(jù)收集率為200 pps，環(huán)境溫度為室溫。

1.3.3 干發(fā)酵香腸發(fā)酵過程中脂肪氧化程度的測定(TBARS)

參考MARCOS等[9]方法。將2.5 g剪碎的肉樣加入20 mL超純水，用IKA均漿器在均質(zhì)3 min。取預(yù)冷的5 mL 250 g/L TCA溶液加入均質(zhì)液中，在10 000×g、4 ℃條件下離心15 min，吸取上清液3.5 mL，加入1.5 mL 0.6%的TBA溶液，在4 ℃條件下攪拌15 min，之后在(70±2)℃條件下水浴30 min，冷卻后在532 nm波長處測定吸光度。2.5 mL超純水加1 mL 250 g/L TCA溶液和1.5 mL 6.0 g/L TBA溶液作空白。采用TEP作為標(biāo)準(zhǔn)液，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到樣品中丙二醛的含量。

1.3.4 干發(fā)酵香腸發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)氧化的測定

1.3.4.1 蛋白質(zhì)含量的測定

根據(jù)GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》測定肉樣的蛋白質(zhì)濃度(c)[10]。

1.3.4.2 羰基含量的測定

參考LUND等[11]的方法對肉樣進行處理，得到樣品的吸光度和相應(yīng)空白的吸光度，按公式(1)計算羰基含量：

(1)

式中：A1，樣品的吸光度；A0，空白的吸光度；c，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度,mg/mL。

1.3.5 揮發(fā)性物質(zhì)的測定

通過固相微萃取結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對揮發(fā)性物質(zhì)進行分析，利用DVE/CAR/PDMS材質(zhì)萃取頭萃取風(fēng)味物質(zhì)，在250 ℃進樣口解析5 min。采用石英毛細柱(100 m×0.25 mm×0.2 μm)；升溫程序：初始溫度40 ℃保持3 min，以3 ℃/min升至180 ℃，然后以10 ℃/min升至250 ℃。進樣方式：不分流進樣。質(zhì)譜條件：離子源溫度：230 ℃；接口溫度：230 ℃；電離方式EI；電子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍：40～300 amu。揮發(fā)性化合物的鑒定：將揮發(fā)性化合物的質(zhì)譜信息與N1ST11質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫中標(biāo)準(zhǔn)化合物的質(zhì)譜信息進行對比，以85%以上的匹配度確定化合物的名稱[12]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每個樣品至少重復(fù)測定3次，采用Excel 2010進行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差，用Origin 2017繪圖，通過SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行方差顯著性分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 干發(fā)酵香腸發(fā)酵過程中理化指標(biāo)的變化

在發(fā)酵的第0、5、10、20、30天取樣，測定干發(fā)酵香腸的理化指標(biāo)。由表1所示，隨著發(fā)酵時間的增加，pH和水分活度逐步下降，空白組與接菌組香腸的pH及水分活度差異不顯著，接菌組的水分活度略低于空白組。

由表1可知，隨著發(fā)酵時間的增加，細菌總數(shù)呈現(xiàn)直線上升的趨勢，而接菌組干發(fā)酵香腸在每個階段中細菌總數(shù)均少于空白組，說明枝孢菌作為優(yōu)勢菌群可能會產(chǎn)生某些活性物質(zhì)抑制了雜菌的生長，從而減緩了干發(fā)酵香腸的腐敗過程。

表1 不同發(fā)酵階段空白組與接菌組干發(fā)酵香腸的理化指標(biāo)變化

注：數(shù)據(jù)為均值±標(biāo)準(zhǔn)差；在相同指標(biāo)同一列中，在右上方標(biāo)記“*”表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 干發(fā)酵香腸發(fā)酵過程中質(zhì)構(gòu)的變化

目前，發(fā)酵香腸生產(chǎn)中的一個重要問題是產(chǎn)品口感較干導(dǎo)致香腸難以咀嚼，因此發(fā)酵香腸的硬度、彈性和咀嚼性等作為考核指標(biāo)，綜合評價發(fā)酵香腸的品質(zhì)[13]。

由表2可知，隨著發(fā)酵時間的延長空白組的硬度、咀嚼性和膠著性呈先增高后降低的趨勢，接菌組硬度、咀嚼性和膠著性呈上升趨勢，兩組的彈性值呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，這是因為發(fā)酵時間增加導(dǎo)致香腸水分蒸發(fā)，香腸變干，同時微生物的作用使香腸的質(zhì)構(gòu)發(fā)生明顯地變化。

表2 不同發(fā)酵階段空白組與接菌組干發(fā)酵香腸質(zhì)構(gòu)的變化

發(fā)酵前期,枝孢菌在生長階段，各指標(biāo)差異不顯著。發(fā)酵后期，空白組香腸的硬度、咀嚼性、膠著性顯著高于接菌組，而彈性略低于接菌組香腸，兩組的黏聚性與回復(fù)性差異不顯著。綜合而言，空白組香腸肉質(zhì)過硬且難以咀嚼，而枝孢菌作為發(fā)酵劑使干發(fā)酵香腸硬度與咀嚼度降低，彈性增高，從而提高口感，因此接入枝孢菌作為發(fā)酵劑可在一定程度上改善干發(fā)酵香腸的質(zhì)構(gòu)。

2.3 干發(fā)酵香腸發(fā)酵過程中脂肪氧化程度的變化

采用硫代巴比妥酸反應(yīng)法(thiobarbituric acid ractive substance, TBARS)值測定原理是根據(jù)食品中不飽和脂肪酸氧化分解而產(chǎn)生丙二醛，利用丙二醛含量對脂肪氧化的程度進行評價[14]。脂質(zhì)氧化是干發(fā)酵香腸在發(fā)酵過程中形成特征風(fēng)味的主要途徑，脂質(zhì)氫過氧化物進一步氧化或降解產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物是形成風(fēng)味的主要物質(zhì)，但過度氧化的脂質(zhì)易于產(chǎn)生酸敗味和哈喇味等不愉快的氣味。因此，控制脂質(zhì)氧化程度對于產(chǎn)品的風(fēng)味形成至關(guān)重要[15]。

由圖1可以看出,隨著發(fā)酵時間的延長，丙二醛含量逐步增加，這是由于發(fā)酵時間越長，香腸的脂肪氧化程度增強，生成了大量的揮發(fā)性成分，因此導(dǎo)致丙二醛含量增加[16]。其次，在每個發(fā)酵階段接菌組的丙二醛含量顯著低于空白組，說明枝孢菌P27可以減緩香腸的脂肪氧化，起到一定的抗氧化作用。

圖1 不同發(fā)酵階段空白組與接菌組干發(fā)酵香腸的脂肪氧化程度

2.4 干發(fā)酵香腸發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)氧化程度的變化

蛋白質(zhì)氧化的主要產(chǎn)物之一為羰基化合物，可利用羰基含量表示蛋白質(zhì)氧化的程度，羰基含量越高，蛋白質(zhì)氧化程度越高[17]。發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)氧化反應(yīng)的發(fā)生會影響肉制品的品質(zhì)，同時一些必需氨基酸被氧化破壞后導(dǎo)致肉制品營養(yǎng)價值降低，羰基化合物與非氧化賴氨酸的游離氨基反應(yīng)形成亞胺鍵，導(dǎo)致聚集體的形成，降低蛋白質(zhì)消化率[18]。

由圖2可以看出，隨著發(fā)酵時間的延長，羰基含量呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，在每一個發(fā)酵階段，接菌組的蛋白質(zhì)氧化程度均低于空白組，枝孢菌P27減緩了香腸的蛋白質(zhì)氧化，發(fā)酵中后期作用更加顯著。蛋白質(zhì)氧化的變化趨勢與脂肪氧化的變化趨勢相一致，說明枝孢菌具有一定的抗氧化功能，可以減緩香腸的氧化程度。

圖2 不同發(fā)酵階段空白組與接菌組干發(fā)酵香腸的蛋白質(zhì)氧化程度

2.5 干發(fā)酵香腸揮發(fā)性物質(zhì)的變化

發(fā)酵香腸的風(fēng)味物質(zhì)主要包括醛類、酮類、酯類、酸類和萜類等[19]，這些物質(zhì)混合形成香腸的特有風(fēng)味，它們主要來源于香腸制作過程中所添加的香料及香腸發(fā)酵過程中碳水化合物代謝、蛋白質(zhì)水解、脂肪水解和氧化過程[20]。本文通過氣質(zhì)聯(lián)用儀分析發(fā)酵30 d后干發(fā)酵香腸揮發(fā)性物質(zhì)的組成及變化情況，接菌組與空白組共檢測到23種化合物，主要的風(fēng)味化合物為醇類、酯類、醛類、酚類和萜類。

發(fā)酵肉制品中酯類化合物的產(chǎn)生與底物(醇類與酸類)水平以及微生物的酯酶活性有關(guān)[21]，酯類具有水果香味和花香，并且它們的香氣閾值較低，對干發(fā)酵香腸的整體風(fēng)味起到極其重要的作用[22]。由表3可知，酯類物質(zhì)含量最高，共包括11種物質(zhì)，接菌組干發(fā)酵香腸酯類物質(zhì)含量明顯高于未接菌組。乙酯類化合物在酯類化合物中最為豐富，如乙酸乙酯、丁酸乙酯和己酸乙酯等，都是源于微生物的酯化作用[23]。乙酸乙酯呈現(xiàn)清香、微帶果香的酒香，丁酸乙酯和3-甲基丁酸乙酯具有甜果香，有菠蘿、香蕉、蘋果芳香，己酸乙酯具有曲香、菠蘿香型的香氣，可用于配制煙草香精以及曲酒調(diào)香[24-25]。接菌組產(chǎn)生特有酯類風(fēng)味物質(zhì)為苯丙酸乙酯和2-甲基丁酸乙酯，而3-苯丙酸乙酯會呈現(xiàn)甜的水果或蜂蜜的花香香氣，2-甲基丁酸乙酯為水果型香精，兩者均已規(guī)定為可使用的食品用香料[26]。空白組產(chǎn)生的辛酸乙酯具有酒香，可能來源于制作中添加的白酒物質(zhì)，也可能來源于自然菌群發(fā)酵。

表3 發(fā)酵30 d的空白組與接菌組干發(fā)酵香腸的風(fēng)味物質(zhì)含量

醇類物質(zhì)主要來源為香腸配料中的白酒，盡管研究認為醇類物質(zhì)對香腸的風(fēng)味貢獻較小[27]，但它在微生物的作用下可以產(chǎn)生酯類物質(zhì)[28]，因此醇類也是必不可少的風(fēng)味物質(zhì)。

醛類化合物是肉制品風(fēng)味成分中十分重要的風(fēng)味物質(zhì)，主要來源于脂肪氧化，其風(fēng)味閾值較低，對肉制品的風(fēng)味貢獻較大[29]，但過度的脂肪氧化容易產(chǎn)生不愉快氣味。由于接菌組的氧化程度低于空白組，通過表3中可看出枝孢菌降低了干發(fā)酵香腸中醛類物質(zhì)的含量。

在接菌組干發(fā)酵香腸中檢測到的少量萜類化合物如β-水芹烯、對傘花烴和D-檸檬烯，均在食品香料領(lǐng)域有所應(yīng)用[30]。此外，接菌組檢測到多種獨特的風(fēng)味物質(zhì)，其中3-羥基丁酮具有特有的奶油香味，自然存在于玉米、奶酪和肉制品中，多用于干酪、咖啡、堅果的香味增強劑，同時也可用于配制奶油、乳品、酸乳和草莓型香精等[31]。

總體而言，枝孢菌使干發(fā)酵香腸中“有益”風(fēng)味物質(zhì)含量增高，并且產(chǎn)生了特有的風(fēng)味物質(zhì)使干發(fā)酵香腸風(fēng)味更豐富，提高干發(fā)酵香腸的風(fēng)味品質(zhì)。

3 結(jié)論

接種枝孢菌后抑制了干發(fā)酵香腸雜菌的生長，改善了香腸的質(zhì)構(gòu)，且可顯著降低干發(fā)酵香腸脂肪和蛋白質(zhì)氧化的程度。干發(fā)酵香腸的主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)為酯類和醇類，接菌后增加了干發(fā)酵香腸酯類、醇類和烷類物質(zhì)等含量，使得干發(fā)酵香腸的風(fēng)味物質(zhì)更加豐富。綜上所述，枝孢菌的接入起到了防腐抗氧化的作用，可以在一定程度上豐富香腸的風(fēng)味，未來可作為發(fā)酵劑用于干發(fā)酵香腸的生產(chǎn)中。