視網(wǎng)膜母細胞瘤房水及腫瘤組織的基因組信息分析初探

姜華 夏杰軍 趙軍陽 Fairooz 劉佩瑩 張靖

視網(wǎng)膜母細胞瘤（retinoblastoma，RB）是兒童最常見的原發(fā)性眼內惡性腫瘤。自2008年Abramson等[1]報道經(jīng)眼動脈灌注化療（intraarterial chemotherapy，IAC）治療RB以來，IAC聯(lián)合局部治療（激光、球注、冷凍等）已經(jīng)成為RB的重要治療方法，提高了患兒的保眼率，但仍有部分患兒對IAC治療不敏感，需及早摘除眼球以避免腫瘤向眼球外轉移[2]。

目前，預測RB的保眼治療的療效僅是基于臨床的腫瘤分期，包括腫瘤大小、視網(wǎng)膜脫落和腫瘤種植等。然而最常用的RB腫瘤國際分期（intraocular international retinoblastoma classify，IIRC）對D期RB患兒的治療成功率的預測只有50%[3]，對E期RB患兒的預測更少[4]，因此臨床亟需一種更精準的方法來評估和預測RB患兒的保眼臨床療效。

由于擔心腫瘤的針道種植轉移，只能從RB患兒眼球摘除后取標本行基因測序及其他生物化學檢查，而不能像其他實體腫瘤一樣進行活檢，因此RB的基因診斷與個性化治療受到很大限制。Jesse L等[5]發(fā)現(xiàn)RB房水的基因檢測可以用于替代腫瘤的活組織檢測來預測臨床療效，為精準治療打開了大門[6-7]?；诖耍狙芯客ㄟ^檢測、比較RB眼球摘除后房水、腫瘤基因信息等，初步探討RB液體活檢的意義。

資料與方法

一、一般資料

本研究獲得了醫(yī)院倫理審查委員會批準。治療前所有患兒監(jiān)護人都獲得了知情同意。本研究共納入2例保眼失敗的RB患兒。

病例1：男，5歲，右眼RB，IIRC E期，前房可見腫瘤種植，曾行1次經(jīng)眼動脈灌注化療，眼底檢查示療效較差，予以眼球摘除。

病例2：男，4歲，右眼RB，IIRC D期，曾6次全身化療后腫瘤復發(fā)，經(jīng)3次經(jīng)眼動脈灌注后腫瘤控制欠佳，出現(xiàn)玻璃體混濁，窺不清眼底，予以眼球摘除。

二、方法

眼球摘除后先吸取房水0.5 ml，再切取少量腫瘤組織。所有樣本避免溶血，取樣后立即保存于-80℃冰箱內，在取樣后1個月內完成檢測。

分別采用Amp Genomic DNA Kit（天根）和QIAseq cfDNA提取試劑盒（Qiagen）從RB患者中提取腫瘤組織的基因組（gDNA），以及房水cfDNA。gDNA經(jīng)過酶片段化，以50 ng片段化的gDNA使用KAPA hyperplus進行酶切片段化，酶切時間選擇12 min，后經(jīng)平末端修復，5’磷酸化和3’加腺苷酸尾、DNA連接酶等模塊連接Illumina Truseq 接頭后通過P5、P7端引物擴增后得到上機文庫。房水中分離的cfDNA采用相同的NGSDNA文庫制備方法，但前期無片段化處理過程，采用10 ng cfDNA構建測序文庫。純化的測序文庫由Illumina noveseq 6000平臺進行全基因組低覆蓋度的高通量測序。在獲得測序原始數(shù)據(jù)后，每條測序序列以95%以上堿基質量≥28分為閾值基準，利用Fastp質控及過濾工具（https://github.com/OpenGene/fastp）進行過濾，通過質控標準的片段序列（reads）進一步運用BWA軟件（http://biobwa.sourceforge.net/bwa.shtml）與人參考基因組（hg19）進行比對。根據(jù)比對結果，計算出相對于參考基因組的測序深度和覆蓋度。采用ichorCNA（https://github.com/broadinstitute/ichorCNA/）對樣本的染色體拷貝數(shù)變異和腫瘤分數(shù)進行分析。ichorCNA是一種基于隱馬爾可夫模型（HMM）預測超低通量全基因組測序（ulp-wgs）的染色體拷貝數(shù)變異和腫瘤分數(shù)(tumor fraction，TFx)的方法。

本研究采用ichorCNA以1 Mbp為長度單位將基因組分割成不相重疊的窗口（1m-bin），在分析過程中過濾DNA重復區(qū)域、低覆蓋區(qū)域及GC校正后，提取每個窗口中reads數(shù)目，將常染色體平均reads數(shù)設為標準對照，計算每個窗口中樣本與標準對照的reads數(shù)的倍數(shù)關系，作log2 ratio值計算，預測每個樣本中的腫瘤DNA含量以及拷貝數(shù)變異。

結 果

一、樣本的質量評估

兩個病例的腫瘤組織和房水樣本的DNA質量良好（圖1～2）。

二、全基因低覆蓋度測序和染色體拷貝數(shù)變異分析

圖1 兩個腫瘤組織樣本的DNA質量良好

圖2 房水的cfDNA質量良好，cfDNA片段大小在理想范圍內

以人的基因組hg19作為參考基因組對測序結果進行比對。hg19基因組大小是3 095 677 412 bp，有效基因組大小為2 861 327 131 bp（參考序列中不含N）。我們應用BWA軟件，分別將各個樣本的測序數(shù)據(jù)比對到參考基因組上。4個樣本的有效reads比對率介于78.22%～88.23%之間，平均測序深度介于0.27 X～0.36 X之間。

圖3顯示了所有染色體的每個1M-bin的聚集歸一化覆蓋率統(tǒng)計的結果。兩個患者的房水cfDNA中，最常見的拷貝數(shù)增加的基因組區(qū)域包括1q、6p和13q，最常見的拷貝數(shù)缺失區(qū)域包括6q、8p。

在病例1患兒中，房水和腫瘤樣本的基因組拷貝數(shù)增加的區(qū)域高度一致，都出現(xiàn)了1q、6p以及13號和18號全染色體區(qū)域的擴增。腫瘤組織在15q區(qū)域也有顯著的拷貝數(shù)增加。分析顯示病例2患兒的腫瘤組織比例過低（TF=0.09 276），因此低覆蓋度高通量測序未能很好地反應其染色體拷貝數(shù)變異的情況。該患兒房水樣本在1p、6q、8p和13q區(qū)域有基因組拷貝數(shù)變異，在17p和19q染色體區(qū)域出現(xiàn)了微缺失區(qū)域。

討 論

圖3 腫瘤和前房液ichorCNA分析結果

早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療能夠降低視網(wǎng)膜母細胞瘤患兒的死亡率、提高其保眼率，乃至保留有用的視力。經(jīng)眼動脈灌注化療、玻璃體腔注射化療等保眼治療方法的出現(xiàn)，提高了患兒的保眼率，使得大量以往需摘眼球的患兒得以保存眼球，也使得這部分患兒不能以病理檢查來評估疾病擴散以及預后的危險因素，因次找到更加精準的RB診斷工具對RB保眼治療的療效以及預后評估變得非常迫切。

與其他部位的惡性腫瘤相比，RB的一個顯著區(qū)別在于，其臨床分期不是基于病理檢查或者活檢，也無任何遺傳腫瘤標記物的參考。 盡管如此，通過研究眼球摘除后的腫瘤發(fā)現(xiàn)：絕大多數(shù)視網(wǎng)膜母細胞瘤（98%）是由13q染色體上RB1腫瘤抑制基因的兩個等位基因失活引起的，RB體細胞拷貝數(shù)主要改變表現(xiàn)為1q、2p、6p 染色體拷貝數(shù)增加，13q、16q 染色體缺失以及2p 染色體局部擴增[8]。有學者研究發(fā)現(xiàn)1q、6p拷貝數(shù)增加和16q缺失可能與局部侵襲性疾病有關[9]；而且 6p拷貝數(shù)增加與分化程度較低的腫瘤有較高的視神經(jīng)侵犯率有關[10]。然而，由于為了避免RB的眼外腫瘤轉移而禁止侵入性組織活檢，從而限制了這些研究結果的臨床應用，不能評估和預測RB的保眼率。

1971年，Dias等[11]首先在RB患兒摘除后的眼球房水中發(fā)現(xiàn)了乳酸脫氫酶（LDH），且活性的增加與疾病的進展有關，作者認為這可能有助于診斷。在該初步報告之后幾十年中，許多研究都在眼球摘除后檢測房水，并發(fā)現(xiàn)了各種標記物，為診斷、臨床病理相關性及可能的靶向治療做出有益的探索，但是，由于這些研究都是從眼球摘除后的眼中進行的，因此房水檢測在RB的診治中的作用仍然有限。

Berry等[5]在晚期RB患兒的房水中發(fā)現(xiàn)了RB腫瘤游離DNA，且與眼球摘除后腫瘤組織獲得的基因組圖譜一致，該研究表明房水基因檢測有可能替代腫瘤活檢，直接作為腫瘤診斷的金標準，并且提示腫瘤遺傳信息。而且進一步的后續(xù)分析表明，RB患兒房水中cfDNA的基因組評估具有重大的預后潛力[12]。在該研究中，8位RB患兒房水的cfDNA濃度范圍為0.084～56 ng/ul，接受美法侖治療的患眼的平均cfDNA濃度為0.2 ng/ul，而未經(jīng)治療直接眼球摘除的房水內的腫瘤的濃度要高得多（平均43.6 ng/ul）。此外，房水cfDNA檢測中發(fā)現(xiàn)6p染色體的增加與腫瘤活性有關，提示這可以作為保眼治療失敗致眼球摘除的預測方法。房水的基因檢測為RB保眼治療的療效評估和預后預測開啟了精準治療的大門[13]。經(jīng)過對兩例患兒眼球摘除后房水、腫瘤組織的基因信息比對，發(fā)現(xiàn)這兩種組織的基因組圖譜一致，并且與Berry團隊的研究基本相似。

綜上，盡管本研究只有2例標本，但是結果仍是令人振奮的，國內首次在RB患兒房水中提取cfDNA，期待進一步研究來預測腫瘤的療效和預后，這將大大改善視網(wǎng)膜母細胞瘤的臨床實踐，房水活檢有望成為視網(wǎng)膜母細胞瘤診斷治療的新標準，使得RB的精準治療成為可能。

致謝：感謝洛杉磯兒童醫(yī)院Jesse L.Berry、Liya Xu教授以及上海福君基因生物科技有限公司對本研究的支持和幫助。