MDR1甲基化對(duì)宮頸癌介入栓塞化療療效的影響

張悅 顧福嘉

宮頸癌是婦科最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于乳腺癌。據(jù)統(tǒng)計(jì)，宮頸癌約占婦科惡性腫瘤的10%，年增加病例47.1萬(wàn)例，年死亡病例27.5萬(wàn)例[1-2]。手術(shù)和放療是治療宮頸癌的主要方法。然而，盡管近幾十年來(lái)手術(shù)技術(shù)、放射治療設(shè)備和技術(shù)不斷更新，但治療效果并未提高，5年生存率僅為70%。腫瘤局部失控和復(fù)發(fā)是治療失敗的主要原因，其次是淋巴轉(zhuǎn)移。

新輔助化療是指患者在主要治療方法前接受一定療程的化療，以縮小腫瘤體積，提高手術(shù)效果，減少手術(shù)并發(fā)癥，尤其適用于對(duì)放療不敏感的腺癌患者[3]。宮頸癌對(duì)化療具有中等敏感性，術(shù)前化療可有效降低腫瘤負(fù)荷，控制癌旁組織浸潤(rùn)血管癌栓子，減輕放療負(fù)擔(dān)，提高手術(shù)成功率，降低復(fù)發(fā)率[4]。新輔助動(dòng)脈內(nèi)化療是一種新的有代表性的治療策略。本策略通過(guò)髂內(nèi)動(dòng)脈和子宮動(dòng)脈栓塞化療后行根治性器官切除和淋巴結(jié)切除。同時(shí)，該療法可以保留子宮、輸卵管和卵巢。因此，對(duì)于希望保留生育能力的早期宮頸癌患者具有重要意義。然而，很多患者對(duì)經(jīng)皮子宮動(dòng)脈血管腔內(nèi)化療栓塞并不敏感，因此對(duì)這類(lèi)患者進(jìn)行化療會(huì)延遲整體治療，產(chǎn)生不必要的副作用，增加患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[5]。因此，迫切需要尋找預(yù)測(cè)化學(xué)敏感性的指標(biāo)，為其治療提供指導(dǎo)。

多重耐藥（MDR）是導(dǎo)致腫瘤化療失敗的主要原因。相關(guān)研究表明，由MDR1基因編碼的P-糖蛋白（P-gp）是MDR的標(biāo)志物，抑制其表達(dá)可增強(qiáng)某些腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[6-7]。在這項(xiàng)研究中，使用免疫組織化學(xué)檢測(cè)經(jīng)皮子宮動(dòng)脈血管腔內(nèi)化療栓塞前后宮頸癌組織中P-gp水平，并通過(guò)千堿基特異性裂解和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析MDR1基因的甲基化狀態(tài)，探討MDR1甲基化對(duì)宮頸癌術(shù)前介入化療栓塞療效的影響。

資料與方法

一、一般資料

選取2016年1月至2018年1月在貴州省人民醫(yī)院經(jīng)病理證實(shí)接受介入化療栓塞的宮頸癌患者67例，所有患者自愿接受超選擇性子宮動(dòng)脈血管腔內(nèi)灌注化療栓塞術(shù)，未選擇外科手術(shù)及放射治療，均已簽署治療知情同意書(shū)。另外，選取45例經(jīng)宮頸活檢或切除的正常宮頸組織作為對(duì)照。本研究經(jīng)貴州省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。該研究遵循《赫爾辛基宣言》的倫理準(zhǔn)則。所有患者和正常個(gè)體均給予知情的書(shū)面同意并批準(zhǔn)本研究。

二、實(shí)驗(yàn)方法

（一）免疫組化檢測(cè)宮頸癌組織中P-gp水平

組織來(lái)源經(jīng)陰道鉗取宮頸組織，將宮頸癌組織介入治療前后和正常宮頸組織嵌入石蠟，切成5 μm片，和傳統(tǒng)的二甲苯脫蠟和梯度酒精水化。用3%過(guò)氧化氫溶液封閉組織，蒸餾水沖洗三次，檸檬酸緩沖液煮沸修復(fù)抗原。加入第一抗體（購(gòu)自 Abcam PLC [Cambridge，UK]的小鼠抗 P-gp單克隆抗體）并置于4℃的加濕箱中過(guò)夜，用Tris緩沖鹽水洗滌三次，二氨基聯(lián)苯胺顯色（ZSGB-BIO，DAB顯色試劑盒，中國(guó)），蘇木精染色1 min，脫水和透明，最后用中性香脂密封。已知的陽(yáng)性活檢被認(rèn)為是陽(yáng)性對(duì)照，磷酸鹽緩沖鹽水代替一抗被認(rèn)為是對(duì)照。

（二）MDR1基因甲基化狀態(tài)的檢測(cè)

在介入治療前后2～3周內(nèi)，宮頸癌和正常宮頸組織用QIAamp DNA Mini Kit（Qiagen NV，Venlo，荷蘭）進(jìn)行DNA提取，嚴(yán)格按照規(guī)范進(jìn)行。管家基因β-球蛋白引物序列正向：5'-CAACTTCATCCACGTTCACC-3'； 反 向：5'-GAAGAGCCAAGGACAGGTAC-3'是PCR擴(kuò)增的內(nèi)部對(duì)照。通過(guò)測(cè)序確認(rèn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，因?yàn)棣?珠蛋白DNA的陽(yáng)性宮頸樣品（陽(yáng)性對(duì)照）和滅菌的雙蒸水（ddH2O）被設(shè)計(jì)為空白對(duì)照。通過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。如果產(chǎn)物明顯可見(jiàn)，則通過(guò)DNA質(zhì)量檢測(cè)。紫外分光光度法測(cè)定DNA濃度和純度。

（三）甲基化過(guò)程：PCR和體外轉(zhuǎn)錄

根據(jù)試劑盒說(shuō)明，用亞硫酸氫鹽處理DNA，然后用PCR進(jìn)行檢測(cè)。EZ DNA甲基化試劑盒購(gòu)自Zymo 研究公司（Irvine，CA，USA）。反應(yīng)體系為 3 μL，包括 0.9 μL ddH2O，0.5 μL10×PCR 緩沖液（Mg2+），0.4 μL MgCl2，0.1 μL 25 mMdNTP，1 μL 引物混合物和0.1 μL 5 U/μL PCR酶。引物的MDR1基因序列正向：5'-TTGGAGGTGAGATTAATTT-3'b；反向：5'-AAAAAAACCCCTACAATACCCATC-3'c，b和c是引物前綴，即每個(gè)正向引物標(biāo)記10個(gè)堿基序列（5'-AGGAAGAGAG-3'），每個(gè)保留引物標(biāo)記T7啟動(dòng)子（5'-CAGTAATACGACTCACTAT AGGGAGAAGGCT-3'）。反應(yīng)條件為 94℃ 4 min，94℃ 20 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，總共 45 個(gè)循環(huán)，最后72℃ 3 min。反應(yīng)后，取5 μL PCR產(chǎn)物，加入2 μL蝦堿性磷酸酶混合物（包括0.3 μL蝦堿性磷酸酶和1.7 μL ddH2O），離心并在37℃下孵育。20 min，然后在85℃下保持5 min以消除反應(yīng)體系中的游離核苷酸。將產(chǎn)物（2 μL）置于微孔板中，加入5 μL轉(zhuǎn)錄/RNase A混合物（包括3.15 μL無(wú)RNase ddH2O，0.89 μL 5×Tris（T）和聚合酶緩沖液，0.24 μL T 裂解混合物，0.22 μL 將 100 mM DL-二硫蘇糖醇（DTT），0.44 μL T7RNA和DNA聚合酶，和0.06 μL RNaseA）密封并離心。最后將產(chǎn)物在37℃下孵育3 h，并在4℃下保存。

（四）甲基化率的檢測(cè)

通過(guò)千堿基特異性裂解法和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法，分析16個(gè)CpG島的MDR1基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化狀態(tài)。采用納米分配器將22 nL裂解反應(yīng)液加入基質(zhì)芯片中，采用質(zhì)譜儀（Sequenom， San Diego，CA，USA）采集質(zhì)譜。用Epityper 1.0軟件分析質(zhì)譜的甲基化率。

（五）評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)

1.化療療效評(píng)價(jià)

在化療前后2～3周經(jīng)陰道超聲檢查三維徑向線，根據(jù)單側(cè)浸潤(rùn)參數(shù)計(jì)算腫瘤體積，主要表現(xiàn)為宮旁壓迫、正常宮頸形態(tài)喪失、骶骨韌帶消失。根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟的標(biāo)準(zhǔn)，療效標(biāo)準(zhǔn)包括完全緩解、部分緩解、病情穩(wěn)定、病情進(jìn)展。完全緩解和部分緩解視為治療有效，穩(wěn)定疾病和病情進(jìn)展視為治療無(wú)效。

2. P-gp表達(dá)水平的評(píng)估

P-gp陽(yáng)性顆粒在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中呈褐色。在高倍鏡下選擇4個(gè)視野，計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞。陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，＜10%用“-”表示，10%～25%用“+”表示，25%～75%用“++”表示，＞75%用“+++”表示。+至+++為陽(yáng)性表達(dá)。

（六）統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)表示為百分比（%），組的比率通過(guò)χ2檢驗(yàn)分析，相關(guān)性通過(guò)Spearman等級(jí)相關(guān)分析。通過(guò)Wilcoxon秩和檢驗(yàn)分析宮頸癌組織治療前后宮頸癌組織與正常宮頸組織之間的甲基化水平。P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、患者的人口統(tǒng)計(jì)特征

患者年齡27～68歲，中位年齡53歲。根據(jù)國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)合會(huì)宮頸癌臨床分期，將患者分為Ib2、Ⅱa、Ⅱb、Ⅲa、Ⅲb分期，見(jiàn)表1。所有患者中，鱗癌48例，腺癌19例，也分為低分化、中分化和高分化程度（表 1）。

二、經(jīng)皮子宮動(dòng)脈血管腔內(nèi)化療栓塞前后正常組織和宮頸癌組織中P-gp的表達(dá)水平

正常宮頸組織中P-gp的陽(yáng)性表達(dá)率為0%（0/45），經(jīng)皮子宮動(dòng)脈血管腔內(nèi)化療栓塞前后宮頸癌組織中P-gp的陽(yáng)性表達(dá)率分別為61.19%（41/67）和77.61%（5/67）。介入化療栓塞后P-gp陽(yáng)性表達(dá)率高于經(jīng)皮子宮動(dòng)脈血管腔內(nèi)化療栓塞后（χ2= 4.2523，P=0.0392）。宮頸癌組織中化療后P-gp的表達(dá)強(qiáng)度與化療前相比有所增加（χ2=17.7301，P=0.0005） （見(jiàn)圖1和表2）。

表1 本研究涉及的患者的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)

三、P-gp表達(dá)對(duì)化療前化療療效的影響

化療前P-gp的陽(yáng)性表達(dá)率與化療效果呈負(fù)相關(guān)（r=-0.340，P=0.005）。P-gp的陽(yáng)性表達(dá)率在有效化療患者化療前低于化療無(wú)效的患者（χ2=7.7274，P=0.0054） （見(jiàn)表3）。

四、DNA的鑒定和純化

用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行β-球蛋白PCR產(chǎn)物后，靶片段出現(xiàn)在240 bp，如圖2所示。紫外吸收度OD260/OD280為1.8～2.0，DNA濃度為0.5 ng/μL，適用于PCR擴(kuò)增。

五、化療前后正常組織和宮頸癌組織中MDR1的甲基化狀態(tài)

圖1 P-gp在正常宮頸組織和宮頸癌組織中的表達(dá)

質(zhì)譜準(zhǔn)確定位基因片段各CpG島的甲基化狀態(tài)。本研究中每個(gè)樣本擴(kuò)增子包含16個(gè)CpG島，每個(gè)CpG島包含單個(gè)或多個(gè)CpG位點(diǎn)，如表4所列。正常宮頸組織中13個(gè)CpG島（2、11、14、16）的甲基化率高于宮頸癌組織（P＜0.05）?；熐?個(gè)CpG島（4、5、8、10、16）在宮頸癌組織中的甲基化率高于化療后，而14個(gè)CpG島的甲基化率低于化療后（P＜0.05） （見(jiàn)圖3）。

六、MDR1甲基化狀態(tài)對(duì)化療敏感性的影響

有效化療患者化療前CpG_2，3和4位點(diǎn)甲基化率高于無(wú)效化療患者，其他CpG位點(diǎn)甲基化率無(wú)差異（P＜0.05） （見(jiàn)圖4）。

討 論

MDR基因家族包括MDR1和MDR3，但只有MDR1基因可以產(chǎn)生MDR現(xiàn)象。MDR1基因位于7號(hào)染色體上的7q21.1-q21.3位點(diǎn)，包括29個(gè)外顯子和28個(gè)內(nèi)含子以及編碼藥物載體P-gp[8]。P-gp是ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族的成員之一，具有能量依賴(lài)性擴(kuò)增膜外排泵功能，從細(xì)胞中泵出多種抗腫瘤藥物，使細(xì)胞內(nèi)化療藥物達(dá)不到有效劑量，從而產(chǎn)生耐藥物抵抗[9-11]。由P-gp介導(dǎo)的腫瘤的藥物外排功能產(chǎn)生的MDR接近P-gp表達(dá)水平。P-gp在具有藥物敏感性的腫瘤細(xì)胞中低表達(dá)，并在耐藥腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)[12]。Scheiner等[13]檢測(cè)了109例急性髓性白血病患者的P-gp表達(dá)水平，結(jié)果顯示P-gp的表達(dá)與治療緩解率呈負(fù)相關(guān)，因此，它是預(yù)后不良的因素。ZHU等[14]采用免疫組化方法檢測(cè)了82例乳腺癌患者P-gp的表達(dá)，并分析了臨床病理特征與患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示P-gp表達(dá)水平與P-gp表達(dá)水平密切相關(guān)。乳腺癌患者的預(yù)后，表達(dá)水平越高，生存率越低。在本研究中，P-gp在正常宮頸組織中不表達(dá)，在宮頸癌組織中高表達(dá)，有效化療患者化療前P-gp陽(yáng)性表達(dá)率低于無(wú)效化療患者。與先前研究的結(jié)果一致。此外，本研究還表明，經(jīng)皮子宮動(dòng)脈血管腔內(nèi)化療栓塞后P-gp表達(dá)水平顯著升高，表明化療可誘導(dǎo)宮頸癌組織中P-gp的表達(dá)，P-gp可能接近二級(jí)耐藥。

表3 化療前P-gp表達(dá)與化療效果的相關(guān)性

圖2 β-Globin PCR產(chǎn)物電泳圖

表2 介入栓塞化療前后正常組織和宮頸癌組織P-gp表達(dá)水平的比較

表4 擴(kuò)增子中的CpG島和相應(yīng)的CpG基因座

圖3 化療前后正常宮頸組織和宮頸癌組織中MDR1基因CpG島的平均甲基化率

圖4 不同化療療效患者M(jìn)DR1基因CpG島的平均甲基化率

DNA甲基化是腫瘤的潛在生物標(biāo)志物。通常，DNA甲基化可以抑制基因表達(dá)，全基因組的低甲基化是腫瘤細(xì)胞最重要的特征之一[15]。MDR1低甲基化導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞P-gp的最高表達(dá)，從而降低腫瘤細(xì)胞對(duì)化學(xué)治療劑的敏感性[16]。Bebek等[17]認(rèn)為頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中MDR1啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平與正常黏膜組織不同，與腫瘤區(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在本研究中，化療前宮頸癌組織中6個(gè)CpG島的甲基化率高于化療后，有效化療患者化療前CpG_2，3和4位點(diǎn)的甲基化率高于無(wú)效患者?；熆赡芨淖僊DR1基因甲基化狀態(tài)，化療效果與MDR1基因甲基化狀態(tài)有一定的相關(guān)性。此外，正常宮頸組織中13 CpG島的平均甲基化率高于宮頸癌組織（P＜0.05），說(shuō)明MDR1 CpG島的定量甲基化可能是宮頸癌的分子標(biāo)志物，進(jìn)一步為宮頸癌的鑒別提供指導(dǎo)。本研究主要探討P-gp蛋白為標(biāo)記物的MDR1甲基化對(duì)化療耐藥的影響，不涉及臨床終點(diǎn)，且耐藥機(jī)制與突變有關(guān)，故無(wú)需用多因素回歸統(tǒng)計(jì)分析。

雖然我們得到了一些有趣的結(jié)果，但也有一些局限性。首先，MDR1基因CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)是否能夠識(shí)別惡性程度還有待進(jìn)一步研究。其次，MDR1的CpG位點(diǎn)能否用于腫瘤的臨床診斷還有待進(jìn)一步探索。

結(jié) 論

本研究證實(shí)部分MDR1基因的甲基化狀態(tài)與宮頸癌經(jīng)皮子宮動(dòng)脈血管腔內(nèi)化療栓塞的化療療效有一定的相關(guān)性，同時(shí)可以在一定程度上預(yù)測(cè)腫瘤的藥物敏感性，并為個(gè)性化的宮頸癌治療提供理論基礎(chǔ)。