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    加味四君子湯對慢性阻塞性肺疾病小鼠膈肌線粒體損傷的修復作用

    2020-03-21 03:39:18胡濤周曉蕓薛丹宋雨鴻
    廣州中醫(yī)藥大學學報 2020年3期
    關鍵詞:熏煙四君子湯骨骼肌

    胡濤, 周曉蕓, 薛丹, 宋雨鴻

    (1.廣州市第一人民醫(yī)院,廣東廣州 510180;2.廣州醫(yī)科大學,廣東廣州 511436)

    慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一種涉及多種器官的全身性反應,晚期極易并發(fā)骨骼肌功能障礙,而線粒體是骨骼肌運動所需能量的生成場所,也是產(chǎn)生活性氧的主要場所,后者可損傷線粒體,影響能量代謝進而導致骨骼肌功能障礙[1-2]。有研究[3-5]表明,健脾及健脾中藥對線粒體能量代謝具有明顯的調(diào)節(jié)作用,可改善骨骼肌疲勞。而加味四君子湯以健脾益氣為治則,臨床研究[6]表明,其可提高患者的運動量,使COPD患者的呼吸困難、生活質(zhì)量得到改善,但尚無相關作用機理的研究。故本課題組通過煙熏法復制COPD小鼠模型,并給予加味四君子湯及N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)干預,從氧化應激方面探討加味四君子湯對COPD小鼠線粒體損傷的修復作用及機理,為中醫(yī)藥防治COPD骨骼肌功能障礙提供科學依據(jù),現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

    1 材料與方法

    1.1 動物 SPF級8周齡健康雄性SD小鼠50只,體質(zhì)量(20±2)g,由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供,動物許可證號:SCXK(粵)2018-0094。本實驗得到廣東省中醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準。

    1.2 藥物及配制 加味四君子湯主要組方為黨參、黃芪、茯苓各20 g,白術(shù)12 g,法半夏、甘草、五味子各6 g,蟲草花10 g,上述中藥材均由廣州市第一人民醫(yī)院藥劑室提供。用回流提取法將藥液濃縮至劑量相當于含生藥2.25 g/mL,4℃保存?zhèn)溆谩R阴0腚装彼崤蒡v片(每片600 mg,由浙江金華康恩貝生物制藥有限公司生產(chǎn),批號:H20057334)由生理鹽水溶解制成混懸液。

    1.3 試劑 大前門牌過濾嘴香煙(20支/包,煙氣煙堿量0.8 mg/支,焦油量11 mg/支,煙氣一氧化碳量13 mg/支,由上海煙草集團有限責任公司出品);丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、琥珀酸脫氫酶(SDH)測定試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。

    1.4 儀器 自制熏煙染毒箱:70cm×50cm×40cm,145 L,每側(cè)各有1.5 cm×1.5 cm小孔;光學顯微鏡(日本奧林巴斯公司);Allegra X-22臺式低速離心機(美國Beckman公司);NanoDrop 2000C超微量紫外/可見分光光度計(美國Thermo公司);透射電鏡(日本日立電鏡有限公司)。

    1.5 COPD模型復制及藥物干預 50只小鼠在SPF級動物實驗室適應性飼養(yǎng)3 d后,采用隨機法將小鼠分為5組,參照宋一平等[7]的方法復制小鼠COPD模型。除正常組小鼠,所有小鼠置入自制熏煙染毒箱,每天2批次予以被動吸煙,每批次8支大前門香煙,分2次給予,每次持續(xù)30 min,2次熏煙間隔時間大于4 h,持續(xù)8周。熏煙完畢將動物放回原飼養(yǎng)籠中正常進食進水。熏煙4周后,在熏煙前給予藥物干預,中藥高、低劑量組給予加味四君子湯(劑量分別為20、10 g·kg-1·d-1)灌胃,NAC組給予NAC泡騰片混懸液(劑量為100 mg·kg-1·d-1)灌胃,共4周。正常組及模型組給予等體積生理鹽水灌胃。

    1.6 觀察指標與方法

    1.6.1 一般狀況 每日觀察各組小鼠的精神狀態(tài)、呼吸、攝食量、大便性狀、毛發(fā)光澤及體質(zhì)量變化等。

    1.6.2 肺組織病理形態(tài)學 給藥結(jié)束后處死小鼠,取其左肺上葉,以體積分數(shù)10%福爾馬林溶液固定、梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片和蘇木素—伊紅(HE)染色處理,于顯微鏡下觀察各組小鼠肺組織病理改變。

    1.6.3 膈肌超微結(jié)構(gòu) 將經(jīng)過體積分數(shù)4%戊二醛固定的1 mm3膈肌漂洗,20 g/L四氧化鋨固定2 h,再漂洗,丙酮梯度脫水,包埋,聚合,超薄切片(厚0.1 μm),醋酸鈾—枸櫞酸鉛電子染色。應用透射電鏡觀察各組膈肌超微結(jié)構(gòu)變化。

    1.6.4 膈肌SOD活性、MDA含量及SDH活性 稱取2 g膈肌,加入勻漿液在冰浴下勻漿(3 000 r/min),取上清分裝,置于-20℃冰箱保存。用比色法在分光光度計上進行膈肌SOD活性、MDA及SDH活性含量檢測,方法按試劑盒說明操作。

    1.7 統(tǒng)計方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理,所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差()表示,組間均數(shù)比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    2.1 各組小鼠一般狀況比較 各組小鼠熏煙初喜聚集成堆,久則出現(xiàn)流涎、點頭呼吸、喘息等癥狀并伴有體質(zhì)量增長緩慢趨勢。模型組呼吸加深加快癥狀呈進行性加重,并出現(xiàn)精神萎靡,口鼻分泌物增多,喉中痰鳴,皮毛黃澀,消瘦,大便稀軟,飲食及攝水量減少,體質(zhì)量下降明顯。而各藥物干預組小鼠一般狀況較模型組有所改善。

    2.2 各組小鼠肺組織病理形態(tài)學比較 圖1結(jié)果顯示:正常組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)正常,小支氣管未見炎癥反應,肺泡壁完整;模型組小鼠部分區(qū)域肺泡上皮增生,肺泡間隔增厚,肺泡壁變薄,肺泡腔明顯擴大,部分肺泡融合形成肺大泡,與正常組比較有顯著差異;與模型組比較,中藥高、低劑量組及NAC組小鼠大部分肺泡相對完整,但仍有部分肺泡腔擴大,部分肺泡腔融合,程度較模型組輕。

    2.3 各組小鼠膈肌超微結(jié)構(gòu)比較 圖2結(jié)果顯示:正常組膈肌肌纖維排列整齊,Z帶清晰,線粒體完整,細胞核完整,核膜清晰;模型組膈肌肌纖維排列絮亂、不均,細胞核完整,核膜模糊,且線粒體結(jié)構(gòu)存在損傷,部分線粒體殘缺、空泡化,與正常組比較有明顯改變;與模型組比較,中藥高、低劑量組及NAC組膈肌肌纖維排列整齊、完整,線粒體及細胞核完整,但NAC組Z帶模糊。

    2.4 各組膈肌組織SOD活性、MDA含量及SDH活性的比較 表1結(jié)果顯示:與正常組比較,模型組SOD、SDH活性顯著降低(P<0.05),而MDA含量則升高(P<0.05);與模型組比較,中藥高、低劑量組SOD、SDH活性顯著升高(P<0.05),MDA含量下降明顯(P<0.05);與NAC組比較,中藥高劑量組對SOD、SDH活性的升高作用及對MDA含量的降低作用更明顯(P<0.05),但低劑量組差異不明顯(P>0.05)。

    圖1 各組小鼠肺組織病理形態(tài)學比較(HE染色,×400)Figure 1 Comparison of the histopathologic features of lung tissues in mice of various groups(by HE staining,× 400)

    圖2 各組小鼠膈肌超微結(jié)構(gòu)比較(透射電鏡,×20 000)Figure 2 Comparison of the ultrastructural features of diaphragm in mice of various groups(under transmission electron microscope,× 20 000)

    表1 各組小鼠膈肌SOD活性、MDA含量、SDH活性的比較Table 1 Comparison of SOD activity,MDA content and SDH activity in diaphragm of mice in various groups(-x± s)

    3 討論

    慢性阻塞性肺疾?。–OPD)晚期患者可并發(fā)營養(yǎng)不良和骨骼肌萎縮,影響呼吸肌和外周肌肉的肌力和耐力[8],從而引起呼吸衰竭,增加COPD死亡率。氧化應激在COPD的發(fā)生發(fā)展中占有重要作用,吸煙產(chǎn)生大量的活性氧(ROS),誘導氧化應激[1],從而損傷肺組織。本研究結(jié)果顯示,模型組小鼠肺組織部分區(qū)域肺泡上皮增生,肺泡間隔增厚,肺泡壁變薄,肺泡腔明顯擴大,部分肺泡融合形成肺大泡,表明符合COPD病理改變。

    正常人體內(nèi)存在著氧化-抗氧化的動態(tài)平衡[9],機體內(nèi)的自由基需要自由基清除酶來清除,SOD作為機體一個重要的抗氧化酶,在清除自由基方面有著重要的地位[10]。如果自由基不能完全清除,過多的自由基就會侵襲生物膜上的多元不飽和脂肪酸,而產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物MDA,它的含量直接反映體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應水平的高低,間接體現(xiàn)機體體內(nèi)細胞受到自由基侵害的嚴重程度[11]。本研究發(fā)現(xiàn),與正常組比較,模型組小鼠膈肌SOD活性明顯降低(P<0.05),而MDA含量明顯升高(P<0.05),表明COPD模型小鼠氧自由基增多、脂質(zhì)過氧化反應增強。與模型組比較,中藥高、低劑量組SOD活性升高(P<0.05),MDA含量下降(P<0.05);與NAC組比較,中藥高劑量組SOD活性、MDA含量變化有差異(P<0.05),但中藥低劑量組差異不明顯(P>0.05)。表明加味四君子湯可通過提高SOD活性,降低MDA含量,來減輕COPD模型小鼠氧化應激反應,從而保護細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,其中高劑量具有較明顯的優(yōu)勢,且抗氧化能力優(yōu)于NAC。

    線粒體是體內(nèi)能量產(chǎn)生的主要場所,骨骼肌作為主要的運動組織,需要消耗大量的能量進行伸縮活動。當體內(nèi)氧自由基過多時,產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化物就會影響骨骼肌線粒體的功能,如MDA就可破壞細胞膜結(jié)構(gòu)并降低膜流動性[12],不僅線粒體結(jié)構(gòu)改變,還表現(xiàn)出線粒體功能障礙[13],導致骨骼肌氧化損傷,引起骨骼肌疲勞[2]。本研究應用透射電鏡觀察小鼠膈肌組織,發(fā)現(xiàn)模型組小鼠膈肌肌纖維排列絮亂、不均,細胞核完整,核膜模糊,核質(zhì)中異染色質(zhì)較多,與正常組相比有明顯改變,且線粒體結(jié)構(gòu)存在損傷,可見部分線粒體殘缺、空泡化,提示煙霧可導致膈肌線粒體結(jié)構(gòu)改變。SDH是位于線粒體內(nèi)膜上的三羧酸循環(huán)能量代謝中的一個關鍵酶,它的活性可直接反映線粒體功能變化,是評價線粒體氧化能力的評價指標之一。本研究發(fā)現(xiàn),與正常組比較,模型組小鼠骨骼肌線粒體SDH活性明顯降低(P<0.05)。結(jié)合膈肌電鏡結(jié)果,認為COPD小鼠膈肌存在著結(jié)構(gòu)異常和功能障礙,使能量產(chǎn)生過少,致熏煙后小鼠消瘦、喜蜷臥。與模型組比較,中藥高、低劑量組SDH活性升高(P<0.05),表明加味四君子湯可提高COPD小鼠骨骼肌線粒體SDH活性,保護線粒體結(jié)構(gòu)完整性,恢復能量代謝,以維持骨骼肌功能正常發(fā)揮。這可能是加味四君子湯保護COPD小鼠膈肌功能的作用機理。

    加味四君子湯主要由黨參、黃芪、茯苓、白術(shù)、法半夏、甘草、五味子、蟲草花組成。已有研究[14]表明,四君子湯可以降低骨骼肌細胞MDA含量、增強SOD活性、改善肌細胞鈣穩(wěn)態(tài)等,從而恢復骨骼肌損傷。黃芪、茯苓具有提高骨骼肌肌酸磷酸肌酶(CPK)活性的功用,可以明顯改善脾虛大鼠“脾主運化”的功能[15]。而NAC是一種含巰基的化合物,是左旋半胱氨酸的天然衍生物,早于1980年就被發(fā)現(xiàn)能夠用來治療氧化應激增加的疾病。本研究發(fā)現(xiàn),與NAC相比,加味四君子湯具有更明顯的減輕氧化反應,提高線粒體能量代謝的作用。

    綜上所述,本研究結(jié)果表明,健脾益氣是治療COPD小鼠膈肌功能障礙的基本治則,而加味四君子湯作為健脾益氣代表方劑,可減少COPD小鼠體內(nèi)氧自由基的損傷,減輕氧化反應,維持線粒體能量正常輸出,對能量代謝的改善具有重要作用。

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