加味四君子湯對慢性阻塞性肺疾病小鼠膈肌線粒體損傷的修復作用

胡濤， 周曉蕓， 薛丹， 宋雨鴻

（1.廣州市第一人民醫(yī)院，廣東廣州 510180；2.廣州醫(yī)科大學，廣東廣州 511436）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種涉及多種器官的全身性反應，晚期極易并發(fā)骨骼肌功能障礙，而線粒體是骨骼肌運動所需能量的生成場所，也是產(chǎn)生活性氧的主要場所，后者可損傷線粒體，影響能量代謝進而導致骨骼肌功能障礙[1-2]。有研究[3-5]表明，健脾及健脾中藥對線粒體能量代謝具有明顯的調(diào)節(jié)作用，可改善骨骼肌疲勞。而加味四君子湯以健脾益氣為治則，臨床研究[6]表明，其可提高患者的運動量，使COPD患者的呼吸困難、生活質(zhì)量得到改善，但尚無相關作用機理的研究。故本課題組通過煙熏法復制COPD小鼠模型，并給予加味四君子湯及N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）干預，從氧化應激方面探討加味四君子湯對COPD小鼠線粒體損傷的修復作用及機理，為中醫(yī)藥防治COPD骨骼肌功能障礙提供科學依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級8周齡健康雄性SD小鼠50只，體質(zhì)量（20±2）g，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK（粵）2018-0094。本實驗得到廣東省中醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準。

1.2 藥物及配制 加味四君子湯主要組方為黨參、黃芪、茯苓各20 g，白術(shù)12 g，法半夏、甘草、五味子各6 g，蟲草花10 g，上述中藥材均由廣州市第一人民醫(yī)院藥劑室提供。用回流提取法將藥液濃縮至劑量相當于含生藥2.25 g/mL，4℃保存?zhèn)溆谩Ｒ阴０腚装彼崤蒡v片（每片600 mg，由浙江金華康恩貝生物制藥有限公司生產(chǎn)，批號：H20057334）由生理鹽水溶解制成混懸液。

1.3 試劑 大前門牌過濾嘴香煙（20支/包，煙氣煙堿量0.8 mg/支，焦油量11 mg/支，煙氣一氧化碳量13 mg/支，由上海煙草集團有限責任公司出品）；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、琥珀酸脫氫酶（SDH）測定試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.4 儀器 自制熏煙染毒箱：70cm×50cm×40cm，145 L，每側(cè)各有1.5 cm×1.5 cm小孔；光學顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；Allegra X-22臺式低速離心機（美國Beckman公司）；NanoDrop 2000C超微量紫外/可見分光光度計（美國Thermo公司）；透射電鏡（日本日立電鏡有限公司）。

1.5 COPD模型復制及藥物干預 50只小鼠在SPF級動物實驗室適應性飼養(yǎng)3 d后，采用隨機法將小鼠分為5組，參照宋一平等[7]的方法復制小鼠COPD模型。除正常組小鼠，所有小鼠置入自制熏煙染毒箱，每天2批次予以被動吸煙，每批次8支大前門香煙，分2次給予，每次持續(xù)30 min，2次熏煙間隔時間大于4 h，持續(xù)8周。熏煙完畢將動物放回原飼養(yǎng)籠中正常進食進水。熏煙4周后，在熏煙前給予藥物干預，中藥高、低劑量組給予加味四君子湯（劑量分別為20、10 g·kg-1·d-1）灌胃，NAC組給予NAC泡騰片混懸液（劑量為100 mg·kg-1·d-1）灌胃，共4周。正常組及模型組給予等體積生理鹽水灌胃。

1.6 觀察指標與方法

1.6.1 一般狀況 每日觀察各組小鼠的精神狀態(tài)、呼吸、攝食量、大便性狀、毛發(fā)光澤及體質(zhì)量變化等。

1.6.2 肺組織病理形態(tài)學 給藥結(jié)束后處死小鼠，取其左肺上葉，以體積分數(shù)10%福爾馬林溶液固定、梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片和蘇木素—伊紅（HE）染色處理，于顯微鏡下觀察各組小鼠肺組織病理改變。

1.6.3 膈肌超微結(jié)構(gòu) 將經(jīng)過體積分數(shù)4%戊二醛固定的1 mm3膈肌漂洗，20 g/L四氧化鋨固定2 h，再漂洗，丙酮梯度脫水，包埋，聚合，超薄切片（厚0.1 μm），醋酸鈾—枸櫞酸鉛電子染色。應用透射電鏡觀察各組膈肌超微結(jié)構(gòu)變化。

1.6.4 膈肌SOD活性、MDA含量及SDH活性 稱取2 g膈肌，加入勻漿液在冰浴下勻漿（3 000 r/min），取上清分裝，置于-20℃冰箱保存。用比色法在分光光度計上進行膈肌SOD活性、MDA及SDH活性含量檢測，方法按試劑盒說明操作。

1.7 統(tǒng)計方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差（）表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般狀況比較 各組小鼠熏煙初喜聚集成堆，久則出現(xiàn)流涎、點頭呼吸、喘息等癥狀并伴有體質(zhì)量增長緩慢趨勢。模型組呼吸加深加快癥狀呈進行性加重，并出現(xiàn)精神萎靡，口鼻分泌物增多，喉中痰鳴，皮毛黃澀，消瘦，大便稀軟，飲食及攝水量減少，體質(zhì)量下降明顯。而各藥物干預組小鼠一般狀況較模型組有所改善。

2.2 各組小鼠肺組織病理形態(tài)學比較 圖1結(jié)果顯示：正常組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)正常，小支氣管未見炎癥反應，肺泡壁完整；模型組小鼠部分區(qū)域肺泡上皮增生，肺泡間隔增厚，肺泡壁變薄，肺泡腔明顯擴大，部分肺泡融合形成肺大泡，與正常組比較有顯著差異；與模型組比較，中藥高、低劑量組及NAC組小鼠大部分肺泡相對完整，但仍有部分肺泡腔擴大，部分肺泡腔融合，程度較模型組輕。

2.3 各組小鼠膈肌超微結(jié)構(gòu)比較 圖2結(jié)果顯示：正常組膈肌肌纖維排列整齊，Z帶清晰，線粒體完整，細胞核完整，核膜清晰；模型組膈肌肌纖維排列絮亂、不均，細胞核完整，核膜模糊，且線粒體結(jié)構(gòu)存在損傷，部分線粒體殘缺、空泡化，與正常組比較有明顯改變；與模型組比較，中藥高、低劑量組及NAC組膈肌肌纖維排列整齊、完整，線粒體及細胞核完整，但NAC組Z帶模糊。

2.4 各組膈肌組織SOD活性、MDA含量及SDH活性的比較 表1結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組SOD、SDH活性顯著降低（P＜0.05），而MDA含量則升高（P＜0.05）；與模型組比較，中藥高、低劑量組SOD、SDH活性顯著升高（P＜0.05），MDA含量下降明顯（P＜0.05）；與NAC組比較，中藥高劑量組對SOD、SDH活性的升高作用及對MDA含量的降低作用更明顯（P＜0.05），但低劑量組差異不明顯（P＞0.05）。

圖1 各組小鼠肺組織病理形態(tài)學比較（HE染色，×400）Figure 1 Comparison of the histopathologic features of lung tissues in mice of various groups（by HE staining，× 400）

圖2 各組小鼠膈肌超微結(jié)構(gòu)比較（透射電鏡，×20 000）Figure 2 Comparison of the ultrastructural features of diaphragm in mice of various groups（under transmission electron microscope，× 20 000）

表1 各組小鼠膈肌SOD活性、MDA含量、SDH活性的比較Table 1 Comparison of SOD activity，MDA content and SDH activity in diaphragm of mice in various groups（-x± s）

3 討論

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）晚期患者可并發(fā)營養(yǎng)不良和骨骼肌萎縮，影響呼吸肌和外周肌肉的肌力和耐力[8]，從而引起呼吸衰竭，增加COPD死亡率。氧化應激在COPD的發(fā)生發(fā)展中占有重要作用，吸煙產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），誘導氧化應激[1]，從而損傷肺組織。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠肺組織部分區(qū)域肺泡上皮增生，肺泡間隔增厚，肺泡壁變薄，肺泡腔明顯擴大，部分肺泡融合形成肺大泡，表明符合COPD病理改變。

正常人體內(nèi)存在著氧化-抗氧化的動態(tài)平衡[9]，機體內(nèi)的自由基需要自由基清除酶來清除，SOD作為機體一個重要的抗氧化酶，在清除自由基方面有著重要的地位[10]。如果自由基不能完全清除，過多的自由基就會侵襲生物膜上的多元不飽和脂肪酸，而產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物MDA，它的含量直接反映體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應水平的高低，間接體現(xiàn)機體體內(nèi)細胞受到自由基侵害的嚴重程度[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組小鼠膈肌SOD活性明顯降低（P＜0.05），而MDA含量明顯升高（P＜0.05），表明COPD模型小鼠氧自由基增多、脂質(zhì)過氧化反應增強。與模型組比較，中藥高、低劑量組SOD活性升高（P＜0.05），MDA含量下降（P＜0.05）；與NAC組比較，中藥高劑量組SOD活性、MDA含量變化有差異（P＜0.05），但中藥低劑量組差異不明顯（P＞0.05）。表明加味四君子湯可通過提高SOD活性，降低MDA含量，來減輕COPD模型小鼠氧化應激反應，從而保護細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，其中高劑量具有較明顯的優(yōu)勢，且抗氧化能力優(yōu)于NAC。

線粒體是體內(nèi)能量產(chǎn)生的主要場所，骨骼肌作為主要的運動組織，需要消耗大量的能量進行伸縮活動。當體內(nèi)氧自由基過多時，產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化物就會影響骨骼肌線粒體的功能，如MDA就可破壞細胞膜結(jié)構(gòu)并降低膜流動性[12]，不僅線粒體結(jié)構(gòu)改變，還表現(xiàn)出線粒體功能障礙[13]，導致骨骼肌氧化損傷，引起骨骼肌疲勞[2]。本研究應用透射電鏡觀察小鼠膈肌組織，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠膈肌肌纖維排列絮亂、不均，細胞核完整，核膜模糊，核質(zhì)中異染色質(zhì)較多，與正常組相比有明顯改變，且線粒體結(jié)構(gòu)存在損傷，可見部分線粒體殘缺、空泡化，提示煙霧可導致膈肌線粒體結(jié)構(gòu)改變。SDH是位于線粒體內(nèi)膜上的三羧酸循環(huán)能量代謝中的一個關鍵酶，它的活性可直接反映線粒體功能變化，是評價線粒體氧化能力的評價指標之一。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組小鼠骨骼肌線粒體SDH活性明顯降低（P＜0.05）。結(jié)合膈肌電鏡結(jié)果，認為COPD小鼠膈肌存在著結(jié)構(gòu)異常和功能障礙，使能量產(chǎn)生過少，致熏煙后小鼠消瘦、喜蜷臥。與模型組比較，中藥高、低劑量組SDH活性升高（P＜0.05），表明加味四君子湯可提高COPD小鼠骨骼肌線粒體SDH活性，保護線粒體結(jié)構(gòu)完整性，恢復能量代謝，以維持骨骼肌功能正常發(fā)揮。這可能是加味四君子湯保護COPD小鼠膈肌功能的作用機理。

加味四君子湯主要由黨參、黃芪、茯苓、白術(shù)、法半夏、甘草、五味子、蟲草花組成。已有研究[14]表明，四君子湯可以降低骨骼肌細胞MDA含量、增強SOD活性、改善肌細胞鈣穩(wěn)態(tài)等，從而恢復骨骼肌損傷。黃芪、茯苓具有提高骨骼肌肌酸磷酸肌酶（CPK）活性的功用，可以明顯改善脾虛大鼠“脾主運化”的功能[15]。而NAC是一種含巰基的化合物，是左旋半胱氨酸的天然衍生物，早于1980年就被發(fā)現(xiàn)能夠用來治療氧化應激增加的疾病。本研究發(fā)現(xiàn)，與NAC相比，加味四君子湯具有更明顯的減輕氧化反應，提高線粒體能量代謝的作用。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，健脾益氣是治療COPD小鼠膈肌功能障礙的基本治則，而加味四君子湯作為健脾益氣代表方劑，可減少COPD小鼠體內(nèi)氧自由基的損傷，減輕氧化反應，維持線粒體能量正常輸出，對能量代謝的改善具有重要作用。