• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    宣肺調(diào)腸方對膿毒癥大鼠腸道損傷的修復(fù)作用及機(jī)制研究

    2020-03-21 03:39:18章國軍李健
    關(guān)鍵詞:宣肺承氣湯膿毒癥

    章國軍, 李健

    (1.廣東省廣州市花都區(qū)人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科,廣東廣州 510800;2.廣東省中醫(yī)院,廣東廣州 510120)

    膿毒癥是由感染或高度可疑感染灶引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征,病死率高[1]。腸道是膿毒癥時(shí)臟器損害的重要靶器官。腸道功能障礙更是膿毒癥的“始動(dòng)因素”,也是由膿毒癥發(fā)展至臟器功能障礙綜合征(multiple organs dysfunction syndrome,MODS)的重要因素之一[2]。有研究表明,磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(pAMPK)可抑制機(jī)體炎癥反應(yīng),pAMPK的高低與炎癥分子表達(dá)水平的高低之間存在密切的聯(lián)系[3]。宣白承氣湯是“肺腸同治”的經(jīng)典方。已有研究表明,宣白承氣湯可有效抑制膿毒癥患者的炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)[4]。本研究應(yīng)用以宣白承氣湯為基礎(chǔ)方進(jìn)行加減的宣肺調(diào)腸方治療膿毒癥大鼠,并以宣白承氣湯為陽性對照,旨在探究宣肺調(diào)腸方修復(fù)膿毒癥腸道損傷的作用及其pAMPK機(jī)制,現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

    1 材料與方法

    1.1 動(dòng)物 SPF級雄性SD大鼠36只,體質(zhì)量(200±20)g,購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,動(dòng)物質(zhì)量合格證號:44002100004733。實(shí)驗(yàn)單位:廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院。給予大鼠標(biāo)準(zhǔn)正常飲食,自由攝食飲水。

    1.2 藥物、試劑與儀器 宣肺調(diào)腸方由生石膏30 g、生大黃10 g、杏仁10 g、瓜蔞皮15 g、枳實(shí)15 g、厚樸15 g、黃芪30 g組成。宣白承氣湯由生石膏15 g、大黃9 g、杏仁6 g、瓜蔞4.5 g組成。上述中藥材均由廣東省中醫(yī)院提供,由廣東省中醫(yī)院李健教授、馬世玉副研究員鑒定。大鼠白細(xì)胞介素6(IL-6)酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)試劑盒(武漢華美生物工程有限公司);pAMPK(Thr172)抗體(美國Cell Signaling Technology公司);丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)活性試劑盒(南京建成生物工程研究所);內(nèi)毒素(LPS)(美國Sigma公司)。JS-Power300電泳儀(上海培清公司);Multiskan Mk3酶標(biāo)儀(美國Thermo公司);UV-754型分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠)。

    1.3 分組、模型復(fù)制與給藥 適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后,將大鼠按體質(zhì)量編號根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表分為正常組,模型組,宣肺調(diào)腸方高、中、低劑量組,宣白承氣湯組,每組6只。宣肺調(diào)腸方高、中、低劑量組及宣白承氣湯組在造模開始前連續(xù)3 d給予大鼠相應(yīng)的藥物灌胃,正常組、模型組給予等體積蒸餾水灌胃。每只大鼠灌胃體積均按10 mL/kg(體質(zhì)量)計(jì)算。宣肺調(diào)腸方成人(按60 kg體質(zhì)量計(jì)算)給藥劑量是125 g,大鼠給藥劑量按成人與大鼠體表面積法[5]進(jìn)行換算,為12 g·kg-1·d-1(中劑量),高、低劑量分別為中劑量的2倍和1/2倍 , 即 24、 6 g·kg-1·d-1。按相同的方法[5]換算,宣白承氣湯組大鼠給藥劑量為3.5 g·kg-1·d-1。參照Yeh等[6]設(shè)計(jì)的方法復(fù)制膿毒癥模型。操作步驟:取100 mg LPS用體積分?jǐn)?shù)0.9%無菌生理鹽水6.67 mL充分混勻,即可得濃度為15 mg/mL的LPS溶液,于4℃冰箱中儲存。造模開始時(shí),將大鼠固定,用酒精擦拭大鼠尾部至尾靜脈清晰可見,用1 mL注射器吸取LPS溶液(吸取量按1 mL/kg大鼠體質(zhì)量計(jì)算),將注射器針尖插入大鼠尾靜脈,先回抽至針管中可見紅色靜脈血,再將LPS溶液注入血管中,退針,用無菌棉簽輕輕按壓進(jìn)針部位2 min至未見出血,則造模完成。本實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物處置方法符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

    1.4 觀察指標(biāo)與方法

    1.4.1 標(biāo)本取材及處理 造模后3 h各組動(dòng)物無菌條件下麻醉、開腹,經(jīng)腹主動(dòng)脈采血,離心20 min,分離血清,放入-20℃冰箱中保存。取近回盲端回腸組織2~3 cm,放入4℃等滲生理鹽水中沖洗,留取標(biāo)本2份。一份用體積分?jǐn)?shù)10%甲醛固定,另一份立即進(jìn)行組織勻漿。

    1.4.2 采用雙抗體夾心ELISA法檢測血清IL-6水平 嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。簡要步驟:將標(biāo)準(zhǔn)品按倍比稀釋原則稀釋放入EP管中,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。在96孔板加樣后于37℃條件下溫育2 h,反復(fù)洗滌5次后,加酶封閉溫育,加入底物,避光顯色15~30 min。加入終止液50 μL,待液體顏色變成黃色,靜置混勻5 min。將已終止反應(yīng)的96孔板放入酶標(biāo)儀中,在450 nm波長處檢測各孔吸光度值,再計(jì)算樣品IL-6質(zhì)量濃度。

    1.4.3 采用黃嘌呤氧化酶法檢測血清MDA、SOD活性 嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。簡要步驟:取各組樣本血清25 μL加入測定管,用旋渦混勻器充分混勻,置37℃恒溫水浴40 min,加入顯色劑,混勻,室溫放置10 min。于波長550 nm處,用1 cm光徑比色杯,蒸餾水調(diào)零,比色,測吸光度值,計(jì)算血清MDA、SOD含量。

    1.4.4 蘇木素—伊紅(HE)染色觀察回腸組織形態(tài)學(xué)改變 將回腸組織從體積分?jǐn)?shù)10%甲醛取出后切成1 cm×0.8 cm×0.2 cm大小的組織塊,再固定2 h后使用濃度遞增的酒精脫水,酒精濃度依次為70%、80%、90%、95%、無水酒精,二甲苯透明,石蠟包埋。以石蠟包埋塊切片,厚度為5 μm,切片后將石蠟切片置于二甲苯中溶解石蠟。再使用濃度遞減酒精水化,酒精濃度依次為無水酒精、95%、90%、80%、70%,蒸餾水沖洗后進(jìn)行常規(guī)HE染色。光鏡下觀察各組大鼠回腸組織形態(tài)學(xué)變化。

    1.4.5 蛋白免疫印跡(Western Blot)方法檢測回腸組織pAMPK、AMPK的表達(dá)水平 使用蛋白提取試劑盒提取回腸勻漿總蛋白,蛋白標(biāo)本與蛋白上樣緩沖液混合后經(jīng)熱變性處理,樣品經(jīng)8%十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白。一抗pAMPK、AMPK稀釋濃度為1∶1 000,二抗?jié)舛葹?∶30 000。以GAPDH作為內(nèi)參照,計(jì)算pAMPK、AMPK蛋白的相對表達(dá)量(p)。

    1.5 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,不同組間比較,若方差齊,采用單因素方差分析(one-way ANOVA),若方差不齊則用秩和檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 造模情況 模型大鼠出現(xiàn)活動(dòng)減少,攝食減少,不合群,嗜睡,蜷縮,豎毛,腹脹,腹瀉,眼角出現(xiàn)分泌物等。解剖后可觀察到大鼠腹腔大量血膿性物滲出,小腸腸管明顯擴(kuò)張、水腫,肝臟表面可見瘀點(diǎn),肺臟充血明顯。證明膿毒癥模型制備成功。

    2.2 各組大鼠血清IL-6、MDA、SOD水平比較 表1結(jié)果顯示:與正常組比較,模型組血清IL-6含量、MDA活性明顯升高,SOD活性明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,宣肺調(diào)腸方高、中劑量組血清IL-6含量、MDA活性明顯降低,宣肺調(diào)腸方高劑量組SOD活性明顯升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且宣肺調(diào)腸方高、中、低劑量組對血清IL-6含量、MDA活性的降低作用和對SOD活性的升高作用具有劑量依賴性。

    表1 各組大鼠血清IL-6、MDA、SOD水平比較Table 1 Comparison of the serum IL-6,MDA and SOD levels in various groups ()

    表1 各組大鼠血清IL-6、MDA、SOD水平比較Table 1 Comparison of the serum IL-6,MDA and SOD levels in various groups ()

    ①P<0.05,與正常組比較;②P<0.05,與模型組比較

    組別正常組模型組宣肺調(diào)腸方高劑量組宣肺調(diào)腸方中劑量組宣肺調(diào)腸方低劑量組宣白承氣湯組SOD[J/(U·mL-1)]144.309 5±6.149 103.949 2±4.234①116.519 9± 6.038①②114.980 1±4.769①110.615 1±7.573①109.932 5±9.143①N/只6 6 6 6 6 6 IL-6[ρ/(μg·mL-1)]1.108±0.487 2.779±0.655①1.208±0.537②1.219±0.828②1.425±0.948 1.577±0.871 MDA[c/(nmol·mL-1)]10.374±1.079 17.294±1.108①13.089± 0.886①②14.649± 1.481①②15.912±0.982①15.975±1.004①

    2.3 光鏡下各組大鼠回腸組織形態(tài)學(xué)變化比較 圖1結(jié)果顯示:正常組大鼠回腸組織結(jié)構(gòu)正常,腸絨毛排列整齊,絨毛結(jié)構(gòu)清晰,無變性壞死,未見炎癥細(xì)胞浸潤;模型組大鼠腸絨毛明顯水腫、伴充血、壞死,有炎癥細(xì)胞浸潤,腸腔可見大量炎癥細(xì)胞;各治療組大鼠回腸組織結(jié)構(gòu)基本正常,腸絨毛見不同程度水腫和間質(zhì)炎癥。

    2.4 各組大鼠回腸組織pAMPK、AMPK蛋白表達(dá)比較 圖2、表2結(jié)果顯示:與正常組比較,模型組大鼠回腸組織pAMPK蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05);與模型組比較,宣肺調(diào)腸方高、中、低劑量組pAMPK蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05),且升高作用呈劑量依賴性。各組AMPK蛋白表達(dá)水平比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

    3 討論

    本研究按Yeh等[6]造模方法復(fù)制膿毒癥大鼠模型的結(jié)果顯示,與正常組比較,光鏡下觀察模型組大鼠回腸組織明顯充血水腫,大量炎性細(xì)胞浸潤,表明膿毒癥大鼠模型制備成功。

    腸功能障礙是膿毒癥發(fā)生發(fā)展的重要因素。腸功能障礙的機(jī)制極其復(fù)雜,目前認(rèn)為主要與以下因素有關(guān):腸黏膜屏障的損傷[7],細(xì)菌/內(nèi)毒素易位[8],胃腸激素的影響,谷氨酰胺的缺乏[9],其中細(xì)菌/內(nèi)毒素易位是其重要機(jī)制之一。腸道內(nèi)細(xì)菌/內(nèi)毒素易位時(shí),可導(dǎo)致各種炎性介質(zhì)大量釋放及補(bǔ)體激活。同時(shí),在全身炎癥反應(yīng)及應(yīng)激狀態(tài)下,機(jī)體產(chǎn)生大量的氧自由基,可直接導(dǎo)致細(xì)胞損傷或死亡,而氧自由基與炎癥應(yīng)答之間形成互相活化、反饋放大的機(jī)制,從而互相增強(qiáng),進(jìn)而造成全身組織和器官損害,發(fā)生MODS[10]。炎癥因子IL-6主要由單核細(xì)胞產(chǎn)生,是機(jī)體炎癥反應(yīng)強(qiáng)弱的重要檢測指標(biāo)[11]。MDA是氧化應(yīng)激反應(yīng)時(shí)的一個(gè)重要指標(biāo),它與氧化應(yīng)激反應(yīng)的嚴(yán)重程度直接相關(guān);SOD是一種重要的抗氧化金屬酶,其活性可衡量體內(nèi)酶類抗氧化系統(tǒng)防御自由基損傷的能力,亦可反應(yīng)機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)的嚴(yán)重程度。

    腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是高度保守的蛋白激酶,在真核生物細(xì)胞中廣泛存在,具有調(diào)控細(xì)胞組織代謝和能量作用[12],被稱為“細(xì)胞能量調(diào)節(jié)器”[13]。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可通過AICAR激活A(yù)MPK抑制炎癥反應(yīng)[14]。

    圖1 各組大鼠回腸組織形態(tài)學(xué)變化比較(HE染色,×200)Figure 1 Comparison of the morphological changes of ileum tissue in various groups(by HE staining,×200)

    圖2 各組大鼠回腸組織pAMPK、AMPK蛋白Western Blot電泳條帶Figure 2 The Western Blot electrophoresis strips of pAMPK and AMPK in ileum tissue of various groups

    目前治療膿毒癥無特效藥,而中醫(yī)藥治療膿毒癥已成為重要的手段。前期研究[15]發(fā)現(xiàn)宣白承氣湯治療腸源性膿毒癥有一定的療效。本研究所用宣肺調(diào)腸方,是廣東省中醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科通過多年膿毒癥的臨床研究,將傳統(tǒng)方劑宣白承氣湯中的杏仁、石膏、瓜蔞、大黃的用量加大,再加入具有行滯消積作用的枳實(shí)、厚樸,益氣補(bǔ)虛的黃芪。該方具有清肺臟之熱邪,瀉大腸之穢濁,補(bǔ)臟腑之虛的功效,諸藥合用,共奏通腑瀉下、清熱解毒、益氣扶正、涼血活血之功。本研究結(jié)果顯示,與模型組比較,宣肺調(diào)腸方組回腸組織水腫充血癥狀減輕,IL-6含量降低,SOD活性增強(qiáng),pAMPK蛋白表達(dá)增多,提示宣肺調(diào)腸方具有保護(hù)腸道損傷的作用。推測其作用機(jī)制可能是宣肺調(diào)腸方激活了AMPK通路,從而達(dá)到抑制膿毒癥炎癥反應(yīng),加強(qiáng)抗氧化應(yīng)激的作用。

    表2 各組大鼠回腸組織pAMPK、AMPK蛋白表達(dá)比較Table 2 Comparison of the expression levels of pAMPK and AMPK in ileum tissue of various groups(,p)

    表2 各組大鼠回腸組織pAMPK、AMPK蛋白表達(dá)比較Table 2 Comparison of the expression levels of pAMPK and AMPK in ileum tissue of various groups(,p)

    ①P<0.05,與正常組比較;②P<0.05,與模型組比較

    組別正常組模型組宣肺調(diào)腸方高劑量組宣肺調(diào)腸方中劑量組宣肺調(diào)腸方低劑量組宣白承氣湯組AMPK/GAPDH 0.742 7±0.354 3 0.542 2±0.231 7 0.805 7±0.252 8 0.696 4±0.047 5 0.626 7±0.066 5 0.542 2±0.113 1 N/只3 3 3 3 3 3 pAMPK/GAPDH 0.775 7±0.018 5②0.367 2±0.104 8①0.741 6±0.047 2②0.642 2±0.112 8②0.577 2± 0.043 4①②0.564 5±0.195 3

    本研究因后期經(jīng)費(fèi)不足,從各組大鼠中隨機(jī)選擇了3只進(jìn)行Western Blot法檢測蛋白表達(dá)。本研究收集的樣本較少,望在以后的研究中加大樣本量、增加設(shè)置不同時(shí)間點(diǎn)、增加不同臟器組織的檢測,以進(jìn)一步闡明宣肺調(diào)腸方的腸道保護(hù)作用,為此方在臨床應(yīng)用的有效性提供理論依據(jù)。

    猜你喜歡
    宣肺承氣湯膿毒癥
    Comparing the effects of three decoctions for coronavirus disease 2019 on severe acute respiratory syndrome coronavirus 2-related tolllike receptors-mediated inflammations
    The Study of Molecular Mechanisms of Xuanbai Chengqi Decoction(宣白承氣湯) in the Treatment of Coronavirus Disease 2019 Based on Network Pharmacology and Molecular Docking Method
    血清IL-6、APC、CRP在膿毒癥患者中的表達(dá)及臨床意義
    膿毒癥的病因病機(jī)及中醫(yī)治療進(jìn)展
    疏風(fēng)宣肺止咳湯對CVA的療效及對BHR的影響
    膿毒癥早期診斷標(biāo)志物的回顧及研究進(jìn)展
    養(yǎng)陰宣肺湯治療干眼的臨床療效評價(jià)
    益肺宣肺降濁膠囊治療輕中度血管性癡呆的臨床療效觀察
    增液承氣湯臨床研究進(jìn)展
    奧曲肽聯(lián)合大承氣湯治療輕型急性胰腺炎50例
    中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产三级黄色录像| 精品福利永久在线观看| 性少妇av在线| 男男h啪啪无遮挡| 国产精品99久久99久久久不卡| 成年av动漫网址| 亚洲第一青青草原| 亚洲av国产av综合av卡| 青春草亚洲视频在线观看| 日本欧美国产在线视频| 丁香六月天网| 成在线人永久免费视频| 日本一区二区免费在线视频| 中文字幕av电影在线播放| 国产片特级美女逼逼视频| 在线观看国产h片| 少妇精品久久久久久久| 亚洲av在线观看美女高潮| 欧美成人精品欧美一级黄| 久久久久久久国产电影| 精品人妻1区二区| 欧美精品高潮呻吟av久久| 青春草视频在线免费观看| 免费少妇av软件| 999精品在线视频| 丝袜美足系列| 好男人视频免费观看在线| 精品高清国产在线一区| 国产1区2区3区精品| 在线观看免费高清a一片| 高清不卡的av网站| 国精品久久久久久国模美| netflix在线观看网站| 99九九在线精品视频| 免费日韩欧美在线观看| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 精品少妇内射三级| 新久久久久国产一级毛片| 欧美精品高潮呻吟av久久| 亚洲五月色婷婷综合| 99香蕉大伊视频| 亚洲美女黄色视频免费看| cao死你这个sao货| 性高湖久久久久久久久免费观看| 免费少妇av软件| 性色av一级| 日日摸夜夜添夜夜爱| 2018国产大陆天天弄谢| 亚洲国产av影院在线观看| 婷婷色综合大香蕉| 最黄视频免费看| av网站在线播放免费| 日韩大片免费观看网站| 久久99精品国语久久久| 婷婷色av中文字幕| 最新在线观看一区二区三区 | 91国产中文字幕| 51午夜福利影视在线观看| 极品人妻少妇av视频| 亚洲,一卡二卡三卡| 国产黄色视频一区二区在线观看| 亚洲精品日本国产第一区| 亚洲av片天天在线观看| 99久久综合免费| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 精品少妇内射三级| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 黄色毛片三级朝国网站| 极品人妻少妇av视频| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 黄色毛片三级朝国网站| 丝袜喷水一区| 亚洲av欧美aⅴ国产| 亚洲av成人精品一二三区| 99国产精品一区二区蜜桃av | 亚洲色图综合在线观看| netflix在线观看网站| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 男人爽女人下面视频在线观看| 亚洲一区中文字幕在线| 亚洲欧美激情在线| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 国产又爽黄色视频| 亚洲成人国产一区在线观看 | 一级毛片我不卡| 亚洲国产精品国产精品| 久久中文字幕一级| 多毛熟女@视频| 亚洲五月色婷婷综合| 午夜福利,免费看| 成人手机av| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 丝袜在线中文字幕| 叶爱在线成人免费视频播放| √禁漫天堂资源中文www| 一级黄色大片毛片| 岛国毛片在线播放| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 国产在视频线精品| 国产午夜精品一二区理论片| 日韩伦理黄色片| 精品少妇内射三级| av视频免费观看在线观看| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 少妇粗大呻吟视频| 90打野战视频偷拍视频| 午夜久久久在线观看| 少妇 在线观看| 亚洲国产精品999| 波多野结衣一区麻豆| 国产成人a∨麻豆精品| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 国产精品 国内视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 免费日韩欧美在线观看| 国产在线视频一区二区| 精品欧美一区二区三区在线| 丝袜在线中文字幕| 久久精品国产亚洲av高清一级| 亚洲欧洲日产国产| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 人体艺术视频欧美日本| av天堂久久9| 蜜桃国产av成人99| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 亚洲av欧美aⅴ国产| 国产一区二区 视频在线| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产av精品麻豆| 精品欧美一区二区三区在线| 少妇粗大呻吟视频| 交换朋友夫妻互换小说| 久久精品久久精品一区二区三区| 男人添女人高潮全过程视频| 久9热在线精品视频| 丰满少妇做爰视频| 亚洲精品一二三| 91字幕亚洲| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 欧美久久黑人一区二区| 18禁观看日本| 久久精品国产亚洲av高清一级| 亚洲欧洲日产国产| 欧美+亚洲+日韩+国产| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 亚洲伊人色综图| 满18在线观看网站| 久久青草综合色| av天堂在线播放| 满18在线观看网站| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 国产深夜福利视频在线观看| 久久精品成人免费网站| 国产一区二区 视频在线| 欧美日韩精品网址| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 精品福利永久在线观看| 日韩大码丰满熟妇| 国产成人免费观看mmmm| 国产片内射在线| 婷婷色av中文字幕| 久久99一区二区三区| 青青草视频在线视频观看| 十八禁高潮呻吟视频| 大型av网站在线播放| 欧美大码av| 999久久久国产精品视频| 久久精品国产亚洲av高清一级| 亚洲国产精品一区三区| 免费少妇av软件| 中文欧美无线码| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| av视频免费观看在线观看| 操出白浆在线播放| 久久国产精品影院| 最近中文字幕2019免费版| 国产成人啪精品午夜网站| 悠悠久久av| 国产成人精品久久久久久| 两个人看的免费小视频| 亚洲少妇的诱惑av| 国产黄频视频在线观看| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 欧美老熟妇乱子伦牲交| 亚洲人成电影免费在线| 久久人人爽人人片av| 国产免费现黄频在线看| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 欧美在线黄色| 国产麻豆69| 丝袜脚勾引网站| 欧美日本中文国产一区发布| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 自线自在国产av| 国产成人精品无人区| 91老司机精品| 国产免费又黄又爽又色| 精品熟女少妇八av免费久了| 国产精品熟女久久久久浪| 国产伦理片在线播放av一区| 成人三级做爰电影| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 久久人妻熟女aⅴ| 91老司机精品| 少妇被粗大的猛进出69影院| av又黄又爽大尺度在线免费看| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| videosex国产| 欧美大码av| 在线观看人妻少妇| 制服诱惑二区| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 性色av乱码一区二区三区2| 亚洲国产欧美在线一区| 黄色a级毛片大全视频| 国产国语露脸激情在线看| 日本av手机在线免费观看| 婷婷成人精品国产| www.999成人在线观看| 只有这里有精品99| 日本wwww免费看| 久久午夜综合久久蜜桃| 色播在线永久视频| 久久国产精品影院| av视频免费观看在线观看| 一区二区av电影网| 一区二区三区激情视频| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 国产一区二区激情短视频 | 久热爱精品视频在线9| 久久久国产精品麻豆| 久久久精品94久久精品| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 麻豆国产av国片精品| 热99国产精品久久久久久7| 国产欧美日韩精品亚洲av| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 久久久久久久国产电影| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 老司机影院成人| 美女高潮到喷水免费观看| 多毛熟女@视频| 新久久久久国产一级毛片| 成人手机av| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 久久精品人人爽人人爽视色| 亚洲 欧美一区二区三区| 成年动漫av网址| 黄色片一级片一级黄色片| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 性色av乱码一区二区三区2| 高清不卡的av网站| 一二三四社区在线视频社区8| 777米奇影视久久| 久久久久久久大尺度免费视频| 精品福利永久在线观看| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 国产精品av久久久久免费| 人人澡人人妻人| 久久狼人影院| 亚洲国产欧美在线一区| av在线老鸭窝| 成人国产av品久久久| 真人做人爱边吃奶动态| 日本黄色日本黄色录像| 中国国产av一级| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 午夜福利影视在线免费观看| 午夜福利免费观看在线| 我的亚洲天堂| 国产精品二区激情视频| 国产激情久久老熟女| 精品亚洲成a人片在线观看| 最黄视频免费看| 五月天丁香电影| 国产免费又黄又爽又色| 人妻人人澡人人爽人人| 一个人免费看片子| 亚洲一码二码三码区别大吗| 一级毛片电影观看| 免费不卡黄色视频| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 狂野欧美激情性xxxx| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| av线在线观看网站| 天天操日日干夜夜撸| 久久青草综合色| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国产极品粉嫩免费观看在线| 9热在线视频观看99| 熟女av电影| 99精品久久久久人妻精品| 黄色毛片三级朝国网站| 啦啦啦 在线观看视频| 欧美精品av麻豆av| 国产不卡av网站在线观看| 大码成人一级视频| 丁香六月天网| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 成年av动漫网址| 男人操女人黄网站| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 色精品久久人妻99蜜桃| 不卡av一区二区三区| 午夜福利免费观看在线| 亚洲成人手机| 午夜福利免费观看在线| 好男人视频免费观看在线| 黄色一级大片看看| 我的亚洲天堂| 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产一区二区 视频在线| 国产av一区二区精品久久| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 亚洲成人免费av在线播放| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 少妇粗大呻吟视频| 99热国产这里只有精品6| 老汉色∧v一级毛片| 免费人妻精品一区二区三区视频| 一级黄片播放器| 久久久亚洲精品成人影院| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 国产精品久久久久成人av| 亚洲av电影在线进入| av在线播放精品| 99re6热这里在线精品视频| 伦理电影免费视频| 亚洲第一青青草原| 国产成人av激情在线播放| a级片在线免费高清观看视频| 夫妻午夜视频| 亚洲人成网站在线观看播放| 中国国产av一级| 国产一卡二卡三卡精品| 中国国产av一级| 国产一卡二卡三卡精品| 黄片播放在线免费| 91精品三级在线观看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 久热这里只有精品99| 国产精品三级大全| 国产又色又爽无遮挡免| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 捣出白浆h1v1| 中文字幕av电影在线播放| www.av在线官网国产| 高潮久久久久久久久久久不卡| 尾随美女入室| 黄色怎么调成土黄色| 亚洲久久久国产精品| 我的亚洲天堂| av有码第一页| 亚洲国产最新在线播放| 欧美xxⅹ黑人| 精品福利观看| 18在线观看网站| 又紧又爽又黄一区二区| 十八禁人妻一区二区| 国产精品国产三级国产专区5o| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 热re99久久精品国产66热6| 免费高清在线观看视频在线观看| 亚洲精品中文字幕在线视频| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 19禁男女啪啪无遮挡网站| 啦啦啦在线免费观看视频4| 老汉色av国产亚洲站长工具| 亚洲成人手机| 黄频高清免费视频| 午夜激情av网站| 一级,二级,三级黄色视频| 国产精品一区二区精品视频观看| 亚洲人成电影观看| 超碰97精品在线观看| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 老司机靠b影院| 99精品久久久久人妻精品| 亚洲精品国产av蜜桃| 少妇人妻 视频| www.自偷自拍.com| 国产成人欧美在线观看 | 欧美中文综合在线视频| 热99国产精品久久久久久7| 久热这里只有精品99| 性少妇av在线| 亚洲精品成人av观看孕妇| 黄频高清免费视频| 99久久99久久久精品蜜桃| 在线观看人妻少妇| 波多野结衣一区麻豆| 成年人午夜在线观看视频| 国产精品.久久久| 大片免费播放器 马上看| 99国产综合亚洲精品| 日本欧美国产在线视频| 免费看十八禁软件| 免费在线观看影片大全网站 | 秋霞在线观看毛片| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 乱人伦中国视频| 亚洲免费av在线视频| 国产精品久久久av美女十八| 激情五月婷婷亚洲| 老汉色av国产亚洲站长工具| 99九九在线精品视频| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 水蜜桃什么品种好| 制服诱惑二区| 十八禁高潮呻吟视频| 国产精品人妻久久久影院| 男人添女人高潮全过程视频| 精品第一国产精品| 国产免费现黄频在线看| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 午夜老司机福利片| 国产在线观看jvid| 伦理电影免费视频| 黄色一级大片看看| 国产精品久久久久成人av| 久久久久久久久久久久大奶| 天堂俺去俺来也www色官网| av福利片在线| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 亚洲精品国产色婷婷电影| 免费在线观看完整版高清| 中文字幕av电影在线播放| 人体艺术视频欧美日本| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产黄色免费在线视频| 纯流量卡能插随身wifi吗| 日韩制服骚丝袜av| 日韩精品免费视频一区二区三区| 91老司机精品| 免费高清在线观看日韩| a 毛片基地| 成人手机av| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 久久久国产一区二区| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 国产成人a∨麻豆精品| 天堂中文最新版在线下载| 亚洲专区国产一区二区| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 日本a在线网址| 一级a爱视频在线免费观看| 在线观看免费日韩欧美大片| av线在线观看网站| 午夜久久久在线观看| 欧美黑人欧美精品刺激| 咕卡用的链子| 日韩一本色道免费dvd| 婷婷成人精品国产| 十分钟在线观看高清视频www| 日韩欧美一区视频在线观看| 亚洲色图综合在线观看| 黄频高清免费视频| 天堂俺去俺来也www色官网| 视频区图区小说| 久久热在线av| 18禁国产床啪视频网站| 中文字幕高清在线视频| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 欧美中文综合在线视频| 国产一区二区三区综合在线观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 满18在线观看网站| 99国产精品一区二区三区| 18在线观看网站| 免费看av在线观看网站| e午夜精品久久久久久久| 精品人妻在线不人妻| 一级毛片女人18水好多 | 国产视频一区二区在线看| 国产熟女午夜一区二区三区| 午夜影院在线不卡| 91老司机精品| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产日韩欧美视频二区| 亚洲av成人精品一二三区| 免费少妇av软件| 9色porny在线观看| 国产有黄有色有爽视频| 亚洲中文字幕日韩| 99热网站在线观看| 免费看不卡的av| 真人做人爱边吃奶动态| 伊人亚洲综合成人网| 亚洲av综合色区一区| e午夜精品久久久久久久| 亚洲人成网站在线观看播放| 热re99久久国产66热| 亚洲av欧美aⅴ国产| 国产高清视频在线播放一区 | a 毛片基地| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 国产又爽黄色视频| 精品一区二区三区av网在线观看 | 久久国产精品男人的天堂亚洲| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 夫妻性生交免费视频一级片| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 人人妻人人澡人人看| 精品一区二区三卡| 国产av国产精品国产| 在线看a的网站| 国产一级毛片在线| 啦啦啦在线观看免费高清www| 久久亚洲精品不卡| 国产精品一区二区在线不卡| 人妻 亚洲 视频| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 精品视频人人做人人爽| 午夜久久久在线观看| 久久久精品免费免费高清| 国产人伦9x9x在线观看| 熟女av电影| 国产高清videossex| 99国产精品免费福利视频| 国产成人a∨麻豆精品| 久久人妻熟女aⅴ| 水蜜桃什么品种好| a级毛片在线看网站| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 日韩大码丰满熟妇| 超碰97精品在线观看| 日本午夜av视频| 老熟女久久久| 中文字幕色久视频| 男人添女人高潮全过程视频| 男女高潮啪啪啪动态图| 国产伦理片在线播放av一区| 人人澡人人妻人| 国产精品九九99| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 中文字幕人妻丝袜制服| 国产精品熟女久久久久浪| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 99热全是精品| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 亚洲 国产 在线| 一级毛片 在线播放| 国产真人三级小视频在线观看| 欧美国产精品一级二级三级| 国产成人一区二区在线| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 99精国产麻豆久久婷婷| 在线 av 中文字幕| 亚洲av国产av综合av卡| 丝袜在线中文字幕| 亚洲伊人久久精品综合| 欧美精品高潮呻吟av久久| 夫妻午夜视频| 久久精品国产亚洲av涩爱| 丝袜美足系列| 大话2 男鬼变身卡| 亚洲欧美一区二区三区国产| 欧美精品一区二区免费开放| 好男人电影高清在线观看| 爱豆传媒免费全集在线观看| 成人午夜精彩视频在线观看| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 国产亚洲欧美在线一区二区| av电影中文网址| 色精品久久人妻99蜜桃| 亚洲三区欧美一区| 欧美日韩成人在线一区二区| 三上悠亚av全集在线观看| 一级毛片 在线播放| 精品国产一区二区三区四区第35| 免费av中文字幕在线| www.999成人在线观看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| a级毛片黄视频| 亚洲五月婷婷丁香| www.自偷自拍.com| 亚洲国产欧美在线一区| 国产欧美日韩一区二区三 | 亚洲综合色网址| 亚洲成人国产一区在线观看 | 国产免费现黄频在线看| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 午夜福利在线免费观看网站| 午夜福利视频精品| 黄频高清免费视频| 秋霞在线观看毛片| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 精品一区二区三卡| 久久久久久久精品精品| 午夜福利在线免费观看网站| av不卡在线播放| 日韩大码丰满熟妇| 成人国产一区最新在线观看 | 亚洲av电影在线进入| 欧美日韩黄片免| 国产精品 欧美亚洲| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 999久久久国产精品视频| 美女扒开内裤让男人捅视频| 精品少妇黑人巨大在线播放|