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    香煙煙霧聯(lián)合脂多糖對氣道炎癥及衰老的影響

    2021-04-07 00:32:10于旭華丁美祝謝丹胡佩欣梁紫堯范龍林琳許銀姬
    關(guān)鍵詞:熏煙香煙煙霧

    于旭華,丁美祝,謝丹,胡佩欣,梁紫堯,范龍,林琳,許銀姬

    (廣州中醫(yī)藥大學(xué) 第二附屬醫(yī)院 呼吸與危重癥科,廣東 廣州 512120)

    慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一種危害健康的全球性疾病.臨床上主要表現(xiàn)為慢性咳嗽,呼吸困難或氣短、胸悶、喘息、消瘦及疲乏等癥狀.病理上則表現(xiàn)為持續(xù)的小氣道慢性炎癥,過度的氧化應(yīng)激和金屬蛋白酶表達(dá)升高,肺上皮細(xì)胞在長期炎癥的刺激下逐漸衰老損傷,并形成氣道狹窄[1].目前,COPD發(fā)生的病理機(jī)制并不完全清楚.吸煙和反復(fù)的氣道感染是COPD形成的主要因素.COPD動物模型的制備主要以香煙暴露或聯(lián)合氣道刺激物的滴注為主要手段,然而,盡管COPD以慢性氣道炎癥為主要表現(xiàn),但在大多數(shù)動物模型中仍表現(xiàn)為炎癥因子白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)表達(dá)升高的急性肺部炎癥[2].

    為了進(jìn)一步揭示COPD慢性或亞急性氣道炎癥發(fā)生的病理表現(xiàn)和特點,本研究利用較長時間香煙暴露(7周),聯(lián)合脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)氣道反復(fù)滴注以及體外實驗,觀察和比較香煙、LPS以及二者聯(lián)合刺激對小鼠氣道免疫細(xì)胞、氧化應(yīng)激、炎癥因子表達(dá)以及氣道上皮衰老損傷的作用.從而反映和揭示吸煙聯(lián)合反復(fù)氣道感染對氣道免疫、炎癥及組織衰老的影響.

    1 材料和方法

    1.1 主要材料和儀器

    脂多糖(批號:113M4068V)與2-丁酸佛波醇酯(PDB,批號:P1269-10MG)均購自Sigma公司.NucleoZOL(Macherey-Nagel,lot:1609/001),異丙醇購自廣州化學(xué)試劑有限公司.SYBR Premix Ex TapTMⅡ(No.RR820)試劑盒與Prime-ScriptTMRT Master Mix(No.RR036A-1)試劑盒購自TaKaRa公司.Senescence β-Galactosidase Staining Kit (#9860)購自CST公司.大前門牌過濾嘴香煙(煙堿含量0.8 mg,焦油量11 mg /支)購自上海煙草集團(tuán)有限公司.主要儀器:多功能臺式冷凍離心機(jī)(Allegra X22R), PCR擴(kuò)增儀(Applied Biosystem),熒光定量PCR儀(VI A7)及顯微鏡(BX61+DP720,Olympus).

    1.2 方法

    1.2.1 動物的分組及培養(yǎng)

    實驗動物選用C57雄性小鼠(合格證號:11400700313310,購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司),小鼠隨機(jī)分為4組,分別為假熏煙聯(lián)合假手術(shù)組,熏煙聯(lián)合假手術(shù)組,假熏煙聯(lián)合LPS組,熏煙聯(lián)合LPS組,每組8只.

    熏煙方法:參考Gualano等[3]的熏煙方法.將小鼠置于18 L塑料熏煙箱中進(jìn)行熏煙.每次3支香煙,2次/d,煙霧用60 mL 注射器注入熏煙箱中.于每天早上9點與下午3點分別進(jìn)行,每次1 h,每周5 d,連續(xù)7周后取材.假熏煙組小鼠每日同一時間放入同樣大小塑料箱中,但不給予香煙暴露.

    LPS滴注方法:于熏煙第28、42天熏煙前1 h,經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,切開氣管處皮毛,向氣管內(nèi)以微量注射器滴入10 μg LPS/30 μL PBS,完成滴注后傾斜上提小鼠軀體,輕揉按摩肺部,使LPS盡可能均勻地分布到兩肺組織中,再縫合頸部皮膚,待小鼠清醒后再次置于籠內(nèi)正常飼養(yǎng).假手術(shù)組小鼠,給予同一時間氣道滴注30 μL PBS,其余與LPS組小鼠處理相同.

    1.2.2 標(biāo)本采集與處理

    實驗第47天,采用戊巴比妥鈉致小鼠安樂死,切開皮毛充分暴露氣管,向肺內(nèi)分4次注入1.2 mL PBS,回收支氣管肺泡灌洗液約1 mL,用于細(xì)胞計數(shù),分類計數(shù)及過氧化物檢測.肺組織經(jīng)液氮快速冷凍,-80 ℃低溫環(huán)境保存.

    1.2.3 體質(zhì)量記錄

    每天熏煙或滴注LPS前稱小鼠體質(zhì)量,體質(zhì)量記錄時間點為第0天,每周三和周日,以及滴注LPS前及之后連續(xù)3 d.

    1.2.4 支氣管肺泡灌洗液(BALF)細(xì)胞計數(shù)及分類計數(shù)

    將BALF靜置1 h,以3 000 r/min離心10 min后去上清液,加入500 μL的紅細(xì)胞裂解液,混勻靜置2 min 后以2 500 r /min離心5 min.棄上清液混勻取20 μL用Countstar自動細(xì)胞計數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計數(shù).其他的混懸液均勻涂于載玻片上,經(jīng)固定、H&E染色后進(jìn)行分類計數(shù),計算巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等各類細(xì)胞所占的百分比.

    1.2.5 氣道灌洗液細(xì)胞氧化應(yīng)激測定

    檢測方法參照課題組之前的研究方法[4].進(jìn)行2-丁酸佛波醇酯誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激測定,選用不透光96孔板,每孔加入50 μL細(xì)胞混懸液進(jìn)行化學(xué)發(fā)光測定,每孔測定1 s,進(jìn)行30個循環(huán).過氧化物含量=(測定值-空白值)/50 μL 細(xì)胞數(shù)×1 000.

    1.2.6 RT-qPCR法檢測肺組織細(xì)胞因子

    提取肺組織總RNA后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,按TaKaRa擴(kuò)增試劑盒說明書嚴(yán)格按照流程操作,檢測各組肺組織中細(xì)胞因子,所有實驗重復(fù)3次,結(jié)果以β-actin為內(nèi)參,按照2-ΔΔCt法計算RNA的相對表達(dá)量.

    1.2.7 Western blot檢測蛋白表達(dá)水平

    使用微型凝膠裝置(BioRad)在質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%聚丙烯酰胺凝膠上通過SDS-PAGE分離20 μg樣品,然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上.在稀釋比例為1∶1 000的Ⅰ抗4 ℃環(huán)境下孵育過夜,常溫下孵育相應(yīng)的HRP標(biāo)記的Ⅱ抗1 h,Ⅱ抗稀釋比例為1∶1 000,以β-actin為內(nèi)參照,用BioRad顯影儀進(jìn)行暗室中顯影,每組實驗重復(fù)3次.最后用Image lab軟件分析目的蛋白相對灰度值.

    表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primer Sequence of RT-qPCR

    1.2.8 香煙提取物的制備和細(xì)胞培養(yǎng)

    將大前門香煙連接裝有25 mL DMEM培養(yǎng)基的制備裝置中,以3 mL/s的速度吸煙,并使煙霧通過培養(yǎng)基.吸煙10 s后,休息20 s,然后進(jìn)行下一次吸煙,直至吸完1支香煙[5].用0.22 μm過濾器滅菌,并確定最終溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%.最后,將香煙提取物(cigarette smoke extract,CSE)溶液稀釋至質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%.

    將A549細(xì)胞種入24孔板,于每天8,14,20點分別給予質(zhì)量濃度10 μg/mL LPS或 PBS刺激1 h,之后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%CSE或DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞,共48 h.

    1.2.9 β-gal 染色實驗

    根據(jù)β-gal 染色試劑盒說明書,先用固定液固定細(xì)胞,經(jīng)PBS沖洗后,將配置的含有X-gal底物的stain buffer加入24孔板內(nèi),避光37 ℃孵育12 h.在光學(xué)顯微鏡下,計數(shù)陽性細(xì)胞個數(shù)及比例.

    1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

    本實驗數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 8.0軟件分析,所有計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組比較采用One-way ANOVA 方法,用LSD進(jìn)行兩兩檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

    2 結(jié)果

    2.1 香煙煙霧及LPS氣道滴注對小鼠體質(zhì)量的影響

    體質(zhì)量減輕情況如圖1.假熏煙小鼠氣道滴注生理鹽水后,體質(zhì)量未見明顯下降.與假熏煙聯(lián)合假手術(shù)小鼠相比,假熏煙聯(lián)合LPS氣道滴注小鼠在第30天,體質(zhì)量輕度下降1.8%(P>0.05),在第44天,體質(zhì)量下降更加明顯6.08%(P<0.05).與假熏煙小鼠比較,熏煙小鼠體質(zhì)量明顯下降平均5.54%(P<0.05).與熏煙聯(lián)合假手術(shù)組小鼠比較,熏煙聯(lián)合LPS氣道滴注小鼠在第28和42天后,體質(zhì)量未發(fā)生明顯變化(P>0.05).

    1)與假熏煙+假手術(shù)組比較,P<0.051)Compared with sham+vehicle mice,P<0.05圖1 香煙暴露7周及LPS氣道滴注對小鼠體質(zhì)量的影響Fig.1 Effects of cigarette exposure for 7 weeks combined with LPS airway instillation on body weight of mice

    2.2 香煙暴露7周及LPS氣道滴注對小鼠BALF細(xì)胞數(shù)量的影響

    BALF細(xì)胞數(shù)量如圖2.與假熏煙聯(lián)合假手術(shù)組小鼠相比,假熏煙聯(lián)合LPS組小鼠BALF細(xì)胞總數(shù)與巨噬細(xì)胞計數(shù)明顯增加(P<0.01), 中性粒細(xì)胞數(shù)與淋巴細(xì)胞有增多的趨勢,但無統(tǒng)計意義(P>0.05); 熏煙聯(lián)合LPS氣道滴注小鼠BALF細(xì)胞總數(shù)與巨噬細(xì)胞數(shù)明顯增多(P<0.05),中性粒細(xì)胞數(shù)與淋巴細(xì)胞有增多的趨勢,但無統(tǒng)計意義(P>0.05).與熏煙聯(lián)合假手術(shù)組小鼠相比,假熏煙聯(lián)合LPS組BALF細(xì)胞總數(shù)和巨噬細(xì)胞計數(shù)增多,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),中性粒細(xì)胞數(shù)與淋巴細(xì)胞有增多的趨勢,但無統(tǒng)計意義(P>0.05);熏煙聯(lián)合LPS組BALF細(xì)胞總數(shù)明顯增加(P<0.05),中性粒細(xì)胞數(shù)與淋巴細(xì)胞有增多的趨勢,但無統(tǒng)計意義(P>0.05).

    2.3 香煙暴露7周及LPS氣道滴注對小鼠肺組織細(xì)胞活性氧產(chǎn)生的影響

    與假手術(shù)聯(lián)合假熏煙組小鼠對比,假熏煙聯(lián)合LPS組小鼠及熏煙聯(lián)合LPS小鼠氣道灌洗液細(xì)胞過氧化物的產(chǎn)生均明顯增多(P<0.01).與熏煙組小鼠相比,假手術(shù)聯(lián)合LPS組與熏煙聯(lián)合LPS組小鼠過氧化物產(chǎn)出率明顯增加(P<0.05).與假熏煙聯(lián)合LPS組小鼠相比,熏煙聯(lián)合LPS組小鼠氣道過氧化物產(chǎn)出速率輕度下降,無統(tǒng)計差異(P>0.05)(圖3).

    2.4 香煙暴露7周及LPS氣道滴注對小鼠肺組織細(xì)胞因子及金屬蛋白酶mRNA表達(dá)影響

    與假熏煙聯(lián)合假手術(shù)組相比,假熏煙聯(lián)合LPS組的小鼠肺臟組織IL-6 mRNA表達(dá)量明顯上升(P<0.05),熏煙聯(lián)合LPS組小鼠肺組織MMP12表達(dá)明顯升高(P<0.05);與熏煙聯(lián)合假手術(shù)組相比,假熏煙聯(lián)合LPS組的小鼠肺臟組織IL-6表達(dá)量也明顯上升(P<0.01),熏煙聯(lián)合LPS組小鼠肺組織MMP12表達(dá)明顯升高(P<0.01);與假熏煙聯(lián)合LPS組小鼠相比,熏煙聯(lián)合LPS組小鼠肺組織中IL-6表達(dá)量明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05).MMP12表達(dá)量明顯升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖4).

    1)與假熏煙+假手術(shù)組比較,P<0.05;2)與假熏煙+假手術(shù)組比較,P<0.01;3)與熏煙+假手術(shù)組比較,P<0.05;4)與熏煙+假手術(shù)組比較,P<0.01. A:灌洗液細(xì)胞總數(shù),B:巨噬細(xì)胞總數(shù),C:中性粒細(xì)胞總數(shù),D:淋巴細(xì)胞總數(shù).1)Compared with sham+vehicle group, P<0.05; 2) Compared with sham+vehicle group, P<0.01; 3) Compared with CS +vehicle group, P<0.05; 4) Compared with CS +vehicle group, P<0.01. A:Total number of the cells, B:Macrophages, C:Neutrophils, D: Lymphocytes.圖2 香煙暴露7周及LPS氣道滴注對小鼠支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞總數(shù)及計數(shù)的影響Fig.2 Effects of cigarette exposure for 7 weeks combined with LPS airway instillation on number of BALF cells

    1)與假熏煙+假手術(shù)組比較,P<0.05;2)與假熏煙+假手術(shù)組比較,P<0.01;3)與熏煙+假手術(shù)組比較,P<0.05.

    2.5 香煙暴露7周及LPS氣道滴注對小鼠肺組織P16、P21表達(dá)的影響

    與假熏煙聯(lián)合假手術(shù)組比較,熏煙聯(lián)合LPS組的小鼠肺臟組織P16和P21表達(dá)量均升高,其中,P16升高3.32倍(P>0.05), P21升高4.35倍(P<0.05).熏煙聯(lián)合假手術(shù)組和假熏煙聯(lián)合LPS組小鼠肺組織P16和P21表達(dá)輕度升高,但無統(tǒng)計意義(P>0.05)(圖5).

    2.6 香煙提取物及LPS對氣道上皮β-半乳糖苷酶活性的影響

    與空白組比較,CSE+LPS組β-gal染色陽性細(xì)胞數(shù)量明顯高于空白組(P<0.01),CSE處理組(P<0.01)和 LPS處理組(P<0.05)(圖6).

    1)與假熏煙+假手術(shù)組比較,P<0.05;2)與熏煙+假手術(shù)組比較,P<0.01;3)與假熏煙+LPS組比較,P<0.05. A:全肺組織中 IL-6的mRNA表達(dá),B:全肺組織中 TNF-α 的mRNA表達(dá),C:全肺組織中 IL-1β的mRNA表達(dá),D:全肺組織中 MMP12的mRNA表達(dá).1)Compared with sham+vehicle group, P<0.05; 2) Compared with CS +vehicle group, P<0.01; 3) Compared with sham+ LPS group, P<0.05. A:Expression of IL-6 mRNA in whole lung cytokines,B:Expression of TNFa mRNA in whole lung cytokines,C:Expression of IL-1beta mRNA in whole lung cytokines,D:Expression of MMP12 mRNA in whole lung cytokines圖4 香煙暴露7周及LPS氣道滴注對小鼠肺組織細(xì)胞因子及金屬蛋白酶MMP12表達(dá)的影響Fig.4 Effects of cigarette exposure for 7 weeks combined with LPS airway instillation on cytokines and MMP12 expression in lung tissues

    1)與假熏煙+假手術(shù)組比較,P<0.05. A:P21,P16 條帶示意圖, B:P16蛋白相對表達(dá)量,C:P21蛋白相對表達(dá)量.1)Compared with sham+vehicle group, P<0.05. A:Representative bands of P16 and P21, B: Relative protein expression of P16, C:Relative protein expression of P21.圖5 香煙暴露7周及LPS氣道滴注對小鼠肺組織P16和P21蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effects of cigarette exposure for 7 weeks combined with LPS airway instillation on p-16 and p-21 expression in lung tissues

    1)與空白組比較,P<0.01; 2)與CSE組比較,P<0.01;3)與LPS組比較,P<0.05

    3 討論

    吸煙合并感染是COPD的常見原因.香煙煙霧中含有多種有害物質(zhì),目前被公認(rèn)為是許多肺部炎癥性疾病發(fā)生和發(fā)展的重要危險因素[6-7].LPS是革蘭氏陰性細(xì)菌的一種成分,可以刺激巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、上皮細(xì)胞等合成釋放一系列促炎因子,誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生.因此香煙煙霧刺激聯(lián)合LPS氣道滴注常作為誘導(dǎo)慢阻肺急性加重的動物模型的重要手段[8-9].然而慢性阻塞性肺病表現(xiàn)為慢性肺部炎癥伴有全身消瘦、系統(tǒng)性慢性炎癥等特征,并常伴有反復(fù)感染.為了揭示熏煙和反復(fù)感染對肺部慢性炎癥狀態(tài)及組織修復(fù)狀態(tài)的影響,本研究運(yùn)用7周香煙熏煙暴露聯(lián)合兩次LPS氣道滴注模擬吸煙聯(lián)合反復(fù)感染的狀態(tài),并在LPS滴注1周后,觀察小鼠體質(zhì)量、氣道炎癥及組織衰老的病理表現(xiàn).

    在急性感染的過程中,體質(zhì)量下降往往代表了系統(tǒng)炎癥的發(fā)生,熏煙導(dǎo)致小鼠體重下降.其原因為:一是煙霧對氣道的長期刺激導(dǎo)致氣道炎癥的發(fā)生,從而促進(jìn)了小鼠的新陳代謝,增加能量消耗導(dǎo)致體重下降; 二是尼古丁通過刺激神經(jīng)受體、影響激素分泌和脂肪代謝,抑制食欲等減輕體重[9].非熏煙小鼠在第28天氣道滴注LPS后,體重在第29、30天輕度下降,可能與炎癥刺激后食欲抑制有關(guān);在第42天,小鼠再次滴注LPS后,第43、44天體重下降較明顯,說明肺部二次受到刺激后,小鼠全身炎癥更加明顯.熏煙小鼠在第28和42天,氣道滴注LPS后,與熏煙但未接受LPS氣道滴注小鼠相比,體重變化無明顯差異.這可能與尼古丁本身具有食欲抑制作用有關(guān)[11],也表明香煙暴露可能具有緩解氣道炎癥的作用.

    持續(xù)的氣道炎癥細(xì)胞浸潤是COPD的重要特征.相比于假熏煙聯(lián)合假手術(shù)組,假熏煙聯(lián)合LPS組BALF細(xì)胞總數(shù)、巨噬細(xì)胞數(shù)明顯增多,而中性粒細(xì)胞數(shù)量輕度升高,說明LPS氣道滴注1周后,進(jìn)入以巨噬細(xì)胞逐漸增多為主的亞急性炎癥或慢性炎癥階段.與假熏煙聯(lián)合假手術(shù)組比較,熏煙聯(lián)合LPS氣道滴注組BALF中白細(xì)胞總數(shù)和巨噬細(xì)胞總數(shù)明顯增多,中性粒細(xì)胞輕度升高,但細(xì)胞總數(shù)和巨噬細(xì)胞數(shù)目略低于假熏煙聯(lián)合LPS氣道滴注組小鼠,說明香煙對氣道炎癥細(xì)胞的浸潤有一定抑制作用, 其機(jī)制可能與香煙抑制AP-1的激活有關(guān)[12].

    有研究表明,LPS與香煙煙霧共同誘導(dǎo)的BALF中總白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞數(shù)量都會顯著增加[13].這與本研究結(jié)果矛盾,其原因可能與香煙作用時間和劑量有關(guān).

    過度的氧化應(yīng)激和促炎因子及金屬蛋白酶的表達(dá)是COPD的另一特征.細(xì)胞過氧化物的大量產(chǎn)生是細(xì)胞發(fā)揮免疫作用、殺滅微生物的重要途徑.本實驗中假熏煙聯(lián)合LPS滴注組與熏煙聯(lián)合LPS滴注組BALF的過氧化物產(chǎn)出率明顯高于假熏煙聯(lián)合假手術(shù)組以及熏煙聯(lián)合假手術(shù)組,表明在LPS的誘導(dǎo)下,氣道免疫細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài),有利于吞噬細(xì)胞對外源病原體的清除,而熏煙聯(lián)合LPS氣道滴注組BALF過氧化物水平較假熏煙聯(lián)合LPS氣道滴注組小鼠稍低,說明熏煙可能導(dǎo)致氣道免疫細(xì)胞的功能障礙[14].

    IL-6,TNF-α,IL-1β是氣道急性炎癥反應(yīng)的標(biāo)志分子.而IL-6是最早升高的炎癥標(biāo)記物.當(dāng)感染或組織損傷發(fā)生時,IL-6由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞迅速產(chǎn)生,并通過激活免疫急性反應(yīng),有助于清除感染源和修復(fù)受損組織[15].本研究表明,與假熏煙聯(lián)合假手術(shù)組相比,假熏煙聯(lián)合LPS滴注組小鼠肺組織IL-6 mRNA表達(dá)明顯升高,TNF-α、IL-1β mRNA表達(dá)無明顯改變,說明假熏煙聯(lián)合LPS滴注組小鼠肺組織處于急性或亞急性炎癥階段,而熏煙聯(lián)合LPS氣道滴注組小鼠肺部IL-6無明顯升高,IL-1β輕度升高(P>0.05),說明熏煙聯(lián)合LPS氣道滴注可能比單純LPS氣道滴注小鼠更早進(jìn)入慢性炎癥階段.也有研究表明,在煙霧刺激基礎(chǔ)上加以LPS的刺激會導(dǎo)致漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞數(shù)量降低,其分泌細(xì)胞因子與腫瘤壞死因子TNF-α、IL-6和Toll 樣受體(toll-like receptors,TLR)等促炎因子的水平均降低[16].MMP12由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,是促進(jìn)彈性蛋白降解的一種金屬蛋白酶.MMP12的超表達(dá)將導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的破壞,并存在于各種炎癥反應(yīng)[17].MMP12的過表達(dá)會導(dǎo)致病理性細(xì)胞外基質(zhì)降解和過度的氣道重塑,促進(jìn)一些急性和慢性肺部疾病的宿主免疫炎癥反應(yīng)并參與肺氣腫的形成[18-20].與假熏煙聯(lián)合LPS滴注組相比,熏煙聯(lián)合LPS滴注組的MMP12表達(dá)量明顯上升,表明熏煙可能會加重LPS誘導(dǎo)的氣道重塑.

    肺上皮的功能衰退是COPD的另一特征,其機(jī)制可能與細(xì)胞衰老有關(guān).細(xì)胞中β-半乳糖苷酶活性明顯升高,可作為細(xì)胞衰老的標(biāo)志物,而P21以及P16是細(xì)胞周期相關(guān)蛋白,它們的表達(dá)水平與細(xì)胞衰老的反映相關(guān)[21].Yue等[22]研究表明,LPS可以促進(jìn)肺上皮細(xì)胞衰老,增加β-gal活性,其作用依賴于蛋白P53.P16和P21是P53基因下游最重要的基因之一,它的表達(dá)增加多是由于響應(yīng)各種細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外刺激,以阻止細(xì)胞周期,確?;虻姆€(wěn)定性[23].Cottage等[25]研究表明,在CS誘導(dǎo)的肺上皮衰老模型中,MMP12顯著上調(diào)[24].P16的敲除可以減少香煙煙霧誘導(dǎo)的肺組織MMP12及細(xì)胞因子的表達(dá),減少肺組織的衰老和肺氣腫的形成.

    本實驗表明香煙提取物聯(lián)合LPS的反復(fù)刺激,明顯增加A549細(xì)胞中β-半乳糖苷酶活性,并且其活性明顯高于單純LPS或香煙提取物刺激,說明香煙煙霧聯(lián)合LPS的反復(fù)刺激明顯促進(jìn)了上皮細(xì)胞的衰老.與此同時,各組小鼠肺組中P16和P21的表達(dá)趨勢與細(xì)胞實驗一致.這進(jìn)一步證實了香煙煙霧聯(lián)合LPS反復(fù)刺激可加劇氣道上皮的衰老,并提示可能與P53信號通路相關(guān).

    綜上所述,香煙煙霧聯(lián)合LPS反復(fù)刺激可誘導(dǎo)氣道炎癥和氧化應(yīng)激,且其程度低于單純LPS反復(fù)刺激,符合慢性/亞急性炎癥改變;但香煙煙霧聯(lián)合LPS反復(fù)刺激明顯加劇了氣道上皮細(xì)胞衰老,且衰老標(biāo)志物明顯高于單純LPS反復(fù)刺激組.因此,香煙煙霧促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞衰老,并不依賴于炎癥的加劇,可能與P53信號通路相關(guān),且有待進(jìn)一步研究.本研究揭示了7周香煙暴露聯(lián)合LPS反復(fù)滴注誘導(dǎo)的肺部慢性/亞急性炎癥動物模型中氣道上皮明顯衰老的病理表現(xiàn),對于揭示COPD發(fā)生病理機(jī)制具有重要意義.

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