固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定銀耳中的8種農(nóng)藥殘留

姚清華 李 捷 柯秋璇 顏孫安 林 虬

(1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(福州)福建福州 350003；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所福建福州 350003；3.福建出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心福建福州 350001)

銀耳(TremellafuciformisBerk)有“菌中之冠”的美稱，為我國著名傳統(tǒng)食藥兼用真菌[1-4]。病蟲害是影響銀耳產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素。銀耳栽培中常見的病害是綠色木霉(Trichodermaviride)、青霉(Penicillium)、淺紅酵母菌(RhodotorulapallidLodd)、鏈孢霉(NeurosporasitophilaShear et Dadge)，蟲害則多為螨蟲、菇蚊、線蟲等[5-7]。銀耳病蟲害防治方法通常是在正式栽培前，通過對(duì)空菇房噴施農(nóng)藥來進(jìn)行預(yù)防的。吡蟲啉、啶蟲脒、異丙威、丁硫克百威、克百威、甲胺磷、乙酰甲胺磷和咪鮮胺為銀耳中常見的防治病蟲害的農(nóng)藥種類。

目前，關(guān)于銀耳中農(nóng)藥殘留的分析，僅少量文獻(xiàn)報(bào)道了銀耳中單一農(nóng)藥及其代謝物殘留的高效液相色譜[8，9]或氣相色譜[10]分析方法，但未涉及多種農(nóng)藥殘留的同時(shí)檢測。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法集高效分離、高靈敏度、多組分定性與定量于一體的優(yōu)點(diǎn)[11-16]。本文以乙酸乙酯提取銀耳樣品，可以同時(shí)分析銀耳中的8種常見農(nóng)藥殘留量，且樣品前處理凈化步驟簡單、適用性廣。方法經(jīng)大量實(shí)際銀耳樣品的檢測分析驗(yàn)證，具有快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)其它食用菌中多種農(nóng)藥殘留的同時(shí)檢測也可提供參考和借鑒。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

Agilent 1200高效液相色譜儀、Agilent 6460三重四極桿質(zhì)譜儀(美國，Agilent公司)；SYNERY UV超純水器(美國，Millipore公司)；IKA-MS3漩渦振蕩器(德國，IKA公司)；HN200氮吹儀(濟(jì)南海能儀器股份有限公司)；TDL-40B離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

吡蟲啉(Imidacloprid)、啶蟲脒(Acetamiprid)、異丙威(Isoprocarb)、丁硫克百威(Carbosulfan)、克百威(Carbofuran)、甲胺磷(Methamidophos)、乙酰甲胺磷(Acephate)、咪鮮胺(Prochloraz) 8種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均購自農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所，均為100 μg/mL。正己烷、乙腈、乙酸乙酯(色譜純，美國賽默飛世爾科技有限公司)，NaCl(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；PSA和GCB固相萃取填料(美國Agilent公司)；C18固相萃取填料(美國Welch Material公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制移取吡蟲啉、啶蟲脒、異丙威、丁硫克百威、克百威、甲胺磷、乙酰甲胺磷、咪鮮胺8種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各1.00 mL(100 μg/mL)于10 mL容量瓶中，配制成10.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，使用時(shí)以空白基質(zhì)溶液稀釋成適當(dāng)濃度的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液，臨用現(xiàn)配。

1.2.2 樣品提取與凈化稱取5 g(精確至0.01 g)樣品，加入1 g NaCl，準(zhǔn)確加入20 mL乙酸乙酯，渦旋振蕩30 s后，超聲提取30 min，4 000 r/min離心5 min后，將4 mL上清液轉(zhuǎn)移至另一個(gè)試管中，分別加入100 mg PSA、100 mg C18和50 mg GCB固相萃取填料，渦旋振蕩30 s，4 000 r/min離心5 min后，準(zhǔn)確移取2 mL上清液氮吹至干，1 mL 30%乙腈水溶液定容，過0.22 μm有機(jī)濾膜后，待進(jìn)樣分析。

1.2.3 液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜條件色譜條件：Phenomenex Luna C8色譜柱(150 mm×2.0 mm，3.0 μm)；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸-5 mmol/L NH4Ac溶液，B為乙腈。梯度洗脫程序：初始為30%B，保持0.5 min；0.5～3 min，90%B；3～6 min，保持90%B；6～9 min，30%B，保持3 min。流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：40 ℃。質(zhì)譜條件：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式檢測；毛細(xì)管電壓：3 500 V；氣簾氣溫度：325 ℃；氣簾氣流速：8 mL/min；鞘氣溫度：340 ℃；鞘氣流速：12 mL/min。8種待測農(nóng)藥的保留時(shí)間、母離子、特征離子碎片、碰撞能量及保留時(shí)間見表1。

表1 8種農(nóng)藥的LC-MS/MS分析參數(shù)Table 1 LC-MS/MS parameters for eight pesticides

*quantitative ion pairs.

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理方法的優(yōu)化

2.1.1 提取方式選擇本實(shí)驗(yàn)分別采用乙腈、乙酸乙酯、乙酸乙酯+正己烷(50+50)對(duì)銀耳中的8種目標(biāo)農(nóng)藥進(jìn)行提取，各農(nóng)藥的回收率見圖1。結(jié)果表明，采用乙酸乙酯提取效果最好，8種農(nóng)藥的回收率均在70%～120%之間，乙酸乙酯+正己烷(50+50)對(duì)甲胺磷和乙酰甲胺磷的提取回收率僅為20%左右，而乙腈對(duì)丁硫克百威的提取回收率不到30%，故選取乙酸乙酯為提取溶劑。

2.1.2 凈化方法選擇本實(shí)驗(yàn)使用QuChERS方法凈化，對(duì)比了C18、GCB和PSA 3種固相萃取填料，發(fā)現(xiàn)GCB對(duì)咪酰胺，PSA對(duì)甲胺磷和乙酰甲胺磷有強(qiáng)吸附作用，使用這兩種固相萃取填料作為吸附劑，相應(yīng)農(nóng)藥的回收率較低，結(jié)果見圖2。使用C18固相萃取填料凈化，8種農(nóng)藥的回收率均能達(dá)到理想值。比較凈化效果，發(fā)現(xiàn)C18能顯著降低丁硫克百威、吡蟲啉、咪酰胺等農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)，故選擇C18作為固相萃取吸附材料。

圖1 不同提取溶劑對(duì)銀耳中8種農(nóng)藥的提取效率Fig.1 Extraction efficiencies of 8 pesticides with different extraction solvents

圖2 不同凈化方法條件下銀耳中8種農(nóng)藥的回收率Fig.2 Recoveries of 8 pesticides with different purification method

2.2 基質(zhì)效應(yīng)的考察

基質(zhì)成分和目標(biāo)化合物在電噴霧離子源進(jìn)行離子化時(shí)會(huì)存在競爭關(guān)系，包括基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)和基質(zhì)抑制效應(yīng)[11]。通常基質(zhì)工作曲線和標(biāo)準(zhǔn)工作曲線斜率比值在85%～115%之間不存在基質(zhì)效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)以銀耳為基體，通過配制相應(yīng)線性范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線和基質(zhì)工作曲線，對(duì)銀耳中農(nóng)藥殘留分析檢測進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)考察。結(jié)果表明，銀耳中吡蟲啉、啶蟲脒、克百威、咪酰胺、異丙威的基質(zhì)工作曲線的斜率為標(biāo)準(zhǔn)工作曲線斜率的85%～115%之間，但是丁硫克百威、甲胺磷、乙酰甲胺磷的基質(zhì)工作曲線的斜率為標(biāo)準(zhǔn)工作曲線斜率的40%～50%，故采用基質(zhì)工作曲線來對(duì)8種農(nóng)藥殘留進(jìn)行定量。

2.3 色譜與質(zhì)譜條件的優(yōu)化

圖3 8種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液(20 μg/L)(a)及空白樣品加標(biāo)(20 μg/kg)(b)的總離子流(TIC)色譜圖Fig.3 TIC chromatograms of eight pesticides standard(20 μg/L)(a) and spiked blank sample(20 μg/kg)(b)Left to right:peak 1,acephate;peak 2,methamidophos;peak 3,imidacloprid;peak 4,acetamiprid;peak 5,carbofuran;peak 6,isoprocarb;peak 7,prochloraz;peak 8,carbosulfan.

實(shí)驗(yàn)以0.1%甲酸溶液作為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，采用梯度洗脫方式洗脫，對(duì)8種農(nóng)藥的準(zhǔn)分子離子峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，分析碎片離子信息，選擇2～3對(duì)響應(yīng)值高、基線噪音值低的離子對(duì)作為定性離子對(duì)，選擇其中信號(hào)最強(qiáng)的定性離子對(duì)作為定量離子對(duì)。進(jìn)一步對(duì)液相色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)當(dāng)采用0.1%甲酸和5 mmol/L NH4Ac溶液替代含0.1%甲酸溶液作為流動(dòng)相A后，連續(xù)對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，目標(biāo)物的線性范圍均較大且峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均較小，故將流動(dòng)相A改為含0.1%甲酸-5 mmol/L NH4Ac溶液。甲胺磷和乙酰甲胺磷保留時(shí)間相近，不能較好的分離，但是本文采用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式進(jìn)行定性定量，方法具有良好的選擇性，克服了甲胺磷和乙酰甲胺磷定量結(jié)果間的相互影響。8種農(nóng)藥的總離子流色譜圖見圖3。

2.4 方法評(píng)價(jià)

2.4.1 線性范圍、檢出限和定量限將不同濃度的混合農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，以峰面積(Y)與對(duì)應(yīng)目標(biāo)物濃度(X，μg/mL)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，8種目標(biāo)農(nóng)藥的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表2。在空白樣品中添加不同濃度的含8種目標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按優(yōu)化條件進(jìn)行測定，分別以3倍和10倍信噪比(S/N)計(jì)算方法的檢出限和定量限，結(jié)果亦列于表2。

2.4.2 方法準(zhǔn)確度和精密度在空白銀耳樣品中分別添加20、100、200 ng/mL 3個(gè)不同質(zhì)量濃度的待測組分混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按優(yōu)化后的條件重復(fù)測定6次。銀耳樣品中8種農(nóng)藥的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)如表3所示。銀耳中添加不同水平8種農(nóng)藥的回收率為70.1%～106.4%，RSD為3.97%～13.68%。方法具有良好的回收率和精密度，能夠滿足銀耳中8種農(nóng)藥殘留量的分析要求。

表2 8種農(nóng)藥的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear equations,correlation coefficients,limits of detection(LOD) and limits of quantitation(LOQ) of eight pesticides

表3 方法的加標(biāo)回收率及精密度(n=6)Table 3 Recoveries and relative standard deviations(RSDs) of eight pesticides(n=6)

2.5 方法的應(yīng)用

用本文建立的方法對(duì)132份銀耳樣品進(jìn)行檢測，人員及實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)結(jié)果表明該方法重現(xiàn)性好，穩(wěn)定、可靠。其中，15份樣品檢出吡蟲啉，15份樣品檢出克百威，4份樣品檢出異丙威，3份樣品檢出乙酰甲胺磷，2份樣品檢出甲胺磷，2份樣品檢出啶蟲脒，2份樣品檢出咪鮮胺，但殘留量較低。

3 結(jié)論

建立了同時(shí)測定銀耳及其栽培料中吡蟲啉、啶蟲脒、異丙威、丁硫克百威、克百威、甲胺磷、乙酰甲胺磷和咪鮮胺8種農(nóng)藥的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。該方法樣品前處理凈化步驟簡單，快速、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，適用于銀耳中多農(nóng)藥殘留的檢測。