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    甲胺磷生物降解酶對韭菜中農(nóng)殘生物修復(fù)效果研究1)

    2013-08-07 10:15:46張娜郭慶啟劉曉飛黃文秀宋琨王雙李爽
    中國林副特產(chǎn) 2013年3期
    關(guān)鍵詞:甲胺磷韭菜無機(jī)

    張娜,郭慶啟,劉曉飛,黃文秀,宋琨,王雙,李爽

    (1.哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品工程學(xué)院,黑龍江省食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,哈爾濱 150076;2.東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院,哈爾濱 150040)

    甲胺磷農(nóng)藥(MAP)殺蟲譜廣,毒性大,制作工藝簡單,曾是我國使用量最大的農(nóng)藥品種,由于其生產(chǎn)和使用對環(huán)境和人體可能造成巨大的污染[1],國家已經(jīng)禁止生產(chǎn)使用該農(nóng)藥。但是,甲胺磷農(nóng)藥屢禁不止,2007年重慶多種蔬菜中發(fā)現(xiàn)甲胺磷農(nóng)藥,2012年8月蘇州生菜中發(fā)現(xiàn)甲胺磷農(nóng)殘超標(biāo),2007年在煙臺,2012年在青島分別發(fā)現(xiàn)千余噸含有甲胺磷農(nóng)殘的毒韭菜[2-4]如何從根本上安全而有效的消除甲胺磷農(nóng)殘的危害,是近年來眾多科研人員所關(guān)注的[5-7]。本研究利用實(shí)驗(yàn)室分離得到的一株微生物代謝產(chǎn)生甲胺磷農(nóng)藥降解酶(MAPE),利用該酶液對在生長過程中噴灑甲胺磷農(nóng)藥的毒韭菜進(jìn)行分析,優(yōu)化降解工作參數(shù),為甲胺磷農(nóng)殘的有效去除奠定了科研基礎(chǔ)。

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

    1.1.1 供試菌株

    實(shí)驗(yàn)室中分離得到XY-C菌株,該菌株為葡萄球菌屬(Staphylococcus Rosehbach)[8]。

    1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

    SPX-70B型搖床振蕩培養(yǎng)箱,天津泰斯特儀器有限公司;722型分光光度計,上海精密科學(xué)儀器有限公司;SYQ-DSX-280A型不銹鋼壓力蒸汽滅菌鍋,上海申安醫(yī)療器械廠;101型電熱鼓風(fēng)干燥箱,東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司。

    1.1.3 實(shí)驗(yàn)材料

    甲胺磷農(nóng)藥:產(chǎn)自鄭州蘭博爾科技有限公司;規(guī)格為300g/500mL;有效成分為40%。甲胺磷標(biāo)準(zhǔn)品:上海農(nóng)藥研究所提供。其余試劑均為分析純。種植時噴灑甲胺磷農(nóng)藥的韭菜為實(shí)驗(yàn)性原料,購于黑龍江省富??h。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 培養(yǎng)基的組成

    無機(jī)鹽培養(yǎng)基:NaCl 0.5g,MgCl20.5g,K2SO40.5g,CaCl20.1g,F(xiàn)eSO40.01g,MnSO40.001g,蒸餾水1000mL,pH7.0滅菌后,再加入0.5mL甲胺磷農(nóng)藥。

    1.2.2 粗酶液的提取

    將實(shí)驗(yàn)室分離出來的降解甲胺磷農(nóng)藥的菌株XY-C,接種于無機(jī)鹽培養(yǎng)基,在28℃,180r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)72h后將液體培養(yǎng)基4000r/min離心處理,取上清液,即為粗酶液。

    1.2.3 甲胺磷含量的測定

    待測樣品經(jīng)過前處理后,精確稱取待測樣品的分解液2mL,以試劑空白作參比,其余操作步驟同標(biāo)準(zhǔn)曲線。測其吸光度值,計算出磷的含量,再根據(jù)計算出來的總磷和無機(jī)磷的量,用兩者之差算出樣品中有機(jī)磷的含量[9]。

    1.2.4 降解率公式

    式中:m1—酶液反應(yīng)時間為零時所測得的無機(jī)磷含量,mg/L;m2—酶液與韭菜反應(yīng)后測定的無機(jī)磷含量,mg/L;d—韭菜中甲胺磷農(nóng)殘的降解率,%;x—韭菜中有機(jī)磷的含量,mg/L;y—韭菜中總磷的含量,mg/L。

    1.2.5 韭菜中甲胺磷農(nóng)殘生物降解工藝參數(shù)的確定

    每隔一段時間在韭菜表面噴灑不同體積的的粗酶液,于不同溫度下存放不同時間后,分別依照不同處理,取回樣品,去掉非可食部分,用濾紙擦凈蔬菜表面的泥沙,用刀切碎,混勻。用電子天平準(zhǔn)確稱取10g樣品,加入10mL水用組織搗碎機(jī)切碎充分混合、打漿,每個樣品打3份原漿,用于平行試驗(yàn),進(jìn)行總磷和無機(jī)磷測定,并計算甲胺磷農(nóng)殘的降解率[10]。

    2 結(jié)果與討論

    在吸光度740nm時,通過比色法測定無機(jī)磷和總磷含量。吸光值與磷含量呈現(xiàn)一定的線性關(guān)系,所得的方程為y(吸光值)=0.1247x(無機(jī)磷濃度,mg/L)+0.0088,R2=0.9995。說明無機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度同吸光值之間線性關(guān)系良好,該方程可以用于測定韭菜中無機(jī)磷的含量。

    2.1 噴灑次數(shù)對韭菜中甲胺磷農(nóng)殘的降解效果的影響

    圖1 噴灑次數(shù)對韭菜中甲胺磷農(nóng)殘的降解效果的影響

    對在種植過程中噴灑了甲胺磷農(nóng)藥的韭菜在其成熟后,每隔30min噴灑一次甲胺磷農(nóng)藥降解酶液10mL,于室溫下反應(yīng),對噴灑酶液的韭菜進(jìn)行粉碎、脫色,測定甲胺磷含量并計算甲胺磷農(nóng)藥降解率,結(jié)果如圖1所示。隨著噴灑次數(shù)的增多,韭菜中甲胺磷農(nóng)殘降解率不斷升高,在韭菜表面噴灑1次粗酶液對韭菜中的甲胺磷農(nóng)殘的降解率為31.41±1.01%,而在韭菜表面噴灑5次粗酶液后,韭菜中的甲胺磷農(nóng)殘的降解率提高為66.33±0.50%,在噴灑3次之后,這種降解率提高的情況出現(xiàn)減慢趨勢,因此,選擇甲胺磷降解酶對韭菜的噴灑次數(shù)為3次。

    2.2 粗酶液使用量對韭菜中甲胺磷農(nóng)殘的降解效果的影響

    圖2 MAPE使用量對韭菜中甲胺磷農(nóng)殘的降解效果的影響

    對在種植過程中噴灑了甲胺磷農(nóng)藥的韭菜在其成熟后,噴灑甲胺磷農(nóng)藥降解酶,均噴灑3次,每100g韭菜上每次噴灑5~25mL,于室溫下反應(yīng),對噴灑酶液的韭菜進(jìn)行粉碎、脫色,測定甲胺磷含量并計算甲胺磷農(nóng)藥降解率,結(jié)果如圖2所示。

    隨著甲胺磷農(nóng)藥降解酶使用量的增多,韭菜中甲胺磷農(nóng)殘降解率不斷升高,在韭菜表面噴灑3次每次5mL的粗酶液對韭菜中的甲胺磷農(nóng)殘的降解率為30.97±1.70%;而在韭菜表面噴灑3次每次25mL的粗酶液后,韭菜中的甲胺磷農(nóng)殘的降解率提高為64.74±0.76%;在噴灑每次20mL的粗酶液后,雖然降解率在逐漸升高,但是降解率升高并不是十分明顯。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出在不同的酶液添加量的反應(yīng)體系中,底物濃度不變的情況下,在酶液添加量較少時,降解率隨著酶液添加量的增加而增加,降解速率也較快,兩者呈正比關(guān)系;隨著酶液添加量進(jìn)一步的增加,降解率有小幅度的增加,降解速率明顯下降,這可能與底物中酶含量過多,底物與酶中心迅速結(jié)合,導(dǎo)致酶活性受抑有關(guān)。因此,選擇20mL甲胺磷降解酶對100g韭菜進(jìn)行噴灑降解。

    2.3 作用溫度對韭菜中甲胺磷農(nóng)殘的降解效果的影響

    對種植過程中噴灑了甲胺磷農(nóng)藥的韭菜在其成熟后,噴灑甲胺磷農(nóng)藥降解酶,于不同溫度下反應(yīng),對噴灑酶液的韭菜進(jìn)行粉碎、脫色,測定甲胺磷含量并計算甲胺磷農(nóng)藥降解率,結(jié)果如圖3所示。

    圖3 溫度對韭菜中甲胺磷農(nóng)殘的降解效果的影響

    隨著作用溫度由4℃不斷增加到65℃,韭菜中甲胺磷農(nóng)殘降解率出現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢,在45℃對韭菜中甲胺磷農(nóng)殘進(jìn)行降解時的降解率為64.63±1.25%,比4℃和65℃作用環(huán)境下,韭菜中的甲胺磷農(nóng)殘的降解率分別提高6.4倍和1.67倍。因此,選擇45℃進(jìn)行甲胺磷降解酶對100g韭菜進(jìn)行噴灑降解。

    2.4 作用時間對韭菜中甲胺磷農(nóng)殘的降解效果的影響

    對種植過程中噴灑了甲胺磷農(nóng)藥的韭菜在其成熟后,噴灑甲胺磷農(nóng)藥降解酶,反應(yīng)不同時間后對噴灑酶液的韭菜進(jìn)行粉碎、脫色,測定甲胺磷含量并計算甲胺磷農(nóng)藥降解率,結(jié)果如圖4所示。

    圖4 作用時間對韭菜中甲胺磷農(nóng)殘的降解效果的影響

    隨著作用時間的增多,韭菜中甲胺磷農(nóng)殘降解率不斷升高,在作用20min后,甲胺磷農(nóng)殘降解率增加并不顯著,反應(yīng)30min后甲胺磷農(nóng)殘的降解率為67.17±1.17%,比反應(yīng)20min時甲胺磷農(nóng)殘的降解率僅提高了2.5%。而反應(yīng)20min后甲胺磷農(nóng)殘的降解率為64.63±1.25%,比反應(yīng)15min和反應(yīng)5min時甲胺磷農(nóng)殘的降解率分別提高4.3%和10.1%。因此,選擇20min作為反應(yīng)時間,進(jìn)行甲胺磷降解酶對100g韭菜的降解。采用單因素試驗(yàn)得到的各工藝參數(shù)噴灑三次每次20mL的甲胺磷農(nóng)藥降解酶于45℃反應(yīng)20min,得到的甲胺磷農(nóng)殘降解率高達(dá)68.74±0.86%。

    3 結(jié)論

    采用單因素試驗(yàn)得到的各工藝參數(shù),噴灑3次,每次20mL的甲胺磷農(nóng)藥降解酶于45℃反應(yīng)20min,得到的韭菜中甲胺磷農(nóng)殘降解率高達(dá)67.17±1.17%。

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