大刺鰍生長激素基因克隆與表達分析

鐘東明　黃小琪　何佩瑩　周惠強　張明清　舒琥

摘要：【目的】揭示生長激素（GH）是否能以旁分泌或自分泌方式對大刺鰍（Mastacembelus armatus）的生長和發(fā)育起作用，為其生長調(diào)節(jié)研究積累基礎(chǔ)數(shù)據(jù)?！痉椒ā坎捎肦ACE克隆大刺鰍GH基因cDNA序列，并通過實時熒光定量PCR對大刺鰍不同組織及胚胎不同發(fā)育時期GH基因的表達情況進行分析?！窘Y(jié)果】大刺鰍GH基因cDNA序列全長815 bp，其中，5'端非編碼區(qū)長33 bp，3'端非編碼區(qū)長167 bp，開放閱讀框（ORF）615 bp，共編碼204個氨基酸，GenBank登錄號MH885947;大刺鰍GH氨基酸序列的前17個氨基酸殘基組成信號肽，也存在4個保守的半胱氨酸殘基（69Cys、177Cys、194Cys和202Cys）。大刺鰍GH蛋白分子量為23007.33 Da，理論等電點（pI）為6.90，其氨基酸組成中以亮氨酸（Leu）的含量最高（15.7%），絲氨酸（Ser）次之（14.2%），色氨酸（Trp）含量最低（0.5%）。大刺鰍GH氨基酸序列與斑鱖（Siniperca scherzeri）、花鱸（Lateolabrax maculatus）和黃鱔（Monopterus albus）的同源性較高，對應(yīng)的同源性分別為95.59%、95.07%和92.16%;在基于GH氨基酸序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹中，大刺鰍與同屬于合鰓目的黃鱔聚為一支，親緣關(guān)系最近。GH基因在大刺鰍不同組織中均有表達，其中以腦組織中的相對表達量最高，而腸道中的相對表達量最低;GH基因在大刺鰍胚胎各發(fā)育時期也均有表達，其中以囊胚期的相對表達量最高，而出膜期的相對表達量最低?！窘Y(jié)論】大刺鰍GH基因具有高度的保守區(qū)域，在各組織中廣泛表達，尤其在腦組織中高表達，說明GH是以自分泌或旁分泌方式對大刺鰍生長發(fā)揮重要作用，且在胚胎發(fā)育過程中對細胞分化具有促進作用。

關(guān)鍵詞： 大刺鰍;生長激素（GH）;基因克隆;保守區(qū)域;系統(tǒng)發(fā)育進化樹;表達分析

中圖分類號： S965.199? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）01-0194-08

Abstract：【Objective】To investigate whether growth hormone（GH） played a paracrine or autocrine role in the growth and development of Mastacembelus armatus， which could provide the essential basic information for growth-rela-ted research of the M.armatus. 【Method】In this experiment， the full-length cDNA sequence encoding GH of the M. armatus was cloned through the RACE techniques. Real-time fluorescence quantitative PCR was used to analyze the GH gene expression in different tissues and at different embryo development stages. 【Result】The full length cDNA of GH gene was 815 bp with 33 bp 5'-untranslated region， 167 bp 3'-untranslated region， and 615 bp open reading frame （ORF）. It enco-ded 204 amino acids（GenBank number：MH885947）. The first 17 amino acid residues of GH amino acid sequence formed signal peptide， and there were also 4 conserved cysteine residues （69Cys，177Cys，194Cys and 202Cys）. The molecular weight of GH protein was 23007.33 Da， and the theoretical isoelectric point （pI） was 6.90. Among the amino acid components， content of leucine （Leu） was the highest （15.7%）， content of serine （Ser） was the second （14.2%）， and content of tryptophan（Trp） was the lowest（0.5%）. The GH amino acid sequence of the M. armatus had high homology with Siniperca scherzeri， Lateolabrax maculatus， and Monopterus albus， with corresponding homology of 95.59%， 95.07% and 92.16%， respectively. On the phylogenetic tree based on GH amino acid sequence homology， M. armatus and the M. albuswere clustered into one branch， their genetic relation was the closest. The results of RT-qPCR showed GH mRNA was expressed in different tissues andat all embryonic stagesof the M. armatus，that the expression of GH mRNA was the highest in the brain tissue and the lowest in intestine. During the embryonic development period， the expression of GH mRNA was the highest at blastocyst stage and the lowest at membrane production stage. 【Conclusion】The GH gene of M. armatusalso has a highly conserved region and is widely expressed in various tissues， especially in brain tissues. It is suggested that GH in the form of autocrine or paracrine， plays an important role in the growth of M. armatus，and promote cell differentiation during embryonic development.

Key words： Mastacembelus armatus;growth hormone （GH）;gene cloning; conserved region; phylogenetic tree;? expression analysis

Foundation item： China-ASEAN Maritime Cooperation Foundation（Waicaihan〔2017〕513）;Guangdong Marine Fishery Science and Technology Research and Development Projec（A201601A05）;Guangdong Marine and Fishery Development Special Project（2017A0007）

0 引言

【研究意義】大刺鰍（Mastacembelus armatus）俗稱納錐、石錐、粗麻割、辣椒魚和刀槍魚，隸屬于合鰓目（Symbranchiformes）、刺鰍科（Mastacembelidae）、刺鰍屬（Mastacembelus）（Nelson，2006），廣泛分布于東南亞等國家，主要棲息在熱帶亞熱帶的不同水系中（Cakmak and Alp，2010;周惠強等，2019）。在我國，大刺鰍主要分布于福建、廣東、廣西、貴州、云南和海南等南方地區(qū)。大刺鰍富含多種氨基酸，營養(yǎng)豐富，具有很高的經(jīng)濟價值和研究價值。目前，大刺鰍人工養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)尚處于起步階段，其苗種來源主要依靠野生捕撈，導(dǎo)致我國大刺鰍野生資源急劇減少，在福建、廣東和湖南等省已被列為重點保護野生水生動物（周惠強等，2019）。因此，加強大刺鰍生長發(fā)育及人工養(yǎng)殖技術(shù)研究，對有效保護和利用大刺鰍種質(zhì)資源具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目前，針對大刺鰍的研究主要集中在養(yǎng)殖繁育技術(shù)（陳方平等，2015;張建銘等，2015;薛凌展，2016）、生理生化（Verma and Alim，2015;初慶柱等，2016;Han et al.，2018）、群體遺傳（楊華強等，2016;林婷婷，2017，江小璐，2018）及形態(tài)差異（舒琥等，2017，周惠強等，2019）等方面，而有關(guān)大刺鰍生長相關(guān)基因的研究鮮見報道。生長激素（Growth hormone，GH）是由下丘腦—垂體前葉嗜酸性細胞合成分泌的一種約含200個氨基酸的單鏈多肽激素，與脊椎動物的生長發(fā)育密切相關(guān)（Yowe and Epping，1995）。GH分泌受下丘腦分泌生長激素釋放激素、促性腺激素釋放激素和生長激素抑制激素的調(diào)控。GH不僅能增強魚類的食欲，促進餌料轉(zhuǎn)化率及提高其生長速率（Moller et al.，2007），還在魚類生長調(diào)控方面發(fā)揮重要作用，與滲透壓平衡（Sakamoto et al.，1997）、生殖繁育（Hull and Harvey，2002;周立斌等，2004）、游泳行為（Johansson et al.，2004）、能量代謝（Rousseau and Dufour，2007）及免疫（Yada，2007）等生理活動的調(diào)節(jié)也密切相關(guān)。在魚類養(yǎng)殖業(yè)方面，GH被認為是一種潛在、最有效的生長促進劑之一，其促生長作用主要有兩種方式：一種是直接激活靶細胞膜上的生長激素受體（GHR）而實現(xiàn)其生物學(xué)效應(yīng);另一種是促進肝臟和其他組織產(chǎn)生胰島素樣生長因子（Insulin-like growth factors，IGFs），通過GH-IGF軸而間接發(fā)揮作用（徐敏華等，2012）。至今，已克隆獲得斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）（張為民等，2003）、淇河鯽（Carassius auratus gibelio var）（高春生等，2008）、鱖（Siniperca chuatsi）（劉臻等，2010）、軍曹魚（Rachycentron canadum）（郝羽等，2011）、達氏鱘（Acipenser dabryanus）（單喜雙等，2015）及蘭州鲇（Silurus lanzhouensis）（王發(fā)新等，2015）等魚類的GH基因，并在原核表達載體中成功表達?！颈狙芯壳腥朦c】GH對魚類的生長及繁育均具有重要作用，但至今有關(guān)大刺鰍GH的研究尚無報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用RT-PCR和RACE克隆大刺鰍GH全長cDNA序列，并通過實時熒光定量PCR對大刺鰍不同組織及胚胎不同發(fā)育時期GH基因的表達情況進行分析，旨在揭示GH是否能以旁分泌或自分泌方式對大刺鰍的生長和發(fā)育發(fā)揮作用，為其生長調(diào)節(jié)研究積累基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

大刺鰍成魚采自云南瀾滄江，平均體質(zhì)量80±5 g/尾，無傷病，體格健壯?？俁NA提取試劑盒RNAprep Pure Tissue Kit （DP431）購自天根生化科技（北京）有限公司;大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞（B528413-0010）購自生工生物工程（上海）有限公司;Taq DNA聚合酶（R500A）、pMD19-T載體（6013）及SMAR-Ter? RACE 5'/3' Kit（634860）試劑盒購自TaKaRa公司;RNA Keeper Tissue Stabilizer （R501-01）保存液、ChamQ SYBR qPCR Master Mix（Q311-02）試劑盒及HiScript II Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA Wiper）（R223-01）試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司。所有引物合成及測序均由生工生物工程（上海）有限公司完成。

1. 2 總RNA提取和cDNA第一鏈合成

采用MS-222（50 mg/L）麻醉后，無菌采集大刺鰍成魚的腦、肌肉、心臟、肝臟、腎臟、脾臟、胃、腸道、眼、鰓和性腺等11種組織，迅速放入RNA Keeper Tissue Stabilizer（R501-01）保存液中，用RNAprep Pure Tissue Kit（DP431）提取其總RNA。選擇不同發(fā)育時期的大刺鰍胚胎（多細胞期、囊胚期、原腸胚期、肌節(jié)出現(xiàn)期和出膜期）樣品置于液氮中保存，提取總RNA用于后續(xù)研究。采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳和GoldView染色檢測總RNA完整性，并以分光光度計檢測其濃度及純度;然后運用SMARTer? RACE 5'/3' Kit（634860）中的反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈。

1. 3 GH基因cDNA序列克隆及測序分析

依據(jù)GenBank已公布的黃鱔、斜帶石斑魚等物種GH基因序列設(shè)計引物P1和P2（表1），用于擴增大刺鰍GH基因的部分片段;cDNA 5'端和3'端非編碼區(qū)的擴增采用SMARTer? RACE 5'/3' Kit（634860）試劑盒，按照說明進行操作，擴增特異性引物分別為GH-GSP1和GH-GSP2（表1）。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后克隆至pMD19-T載體上，再轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，挑選陽性克隆進行測序。應(yīng)用BLAST對獲得的大刺鰍GH基因cDNA序列進行同源性比對分析，并推導(dǎo)其開放閱讀框（ORF）和編碼氨基酸序列;以Clus-talX 2.1進行氨基酸序列比對分析，選擇比對模型Multiple Alignment Mode（多序列比對），默認參數(shù)設(shè)置，比對方法選用Do Complete Alignment（進行完全比對）;得出的比對分析結(jié)果運用BOXSHADE Server（https：//embnet.vital-it.ch/software/BOX_form.html）進行著色處理;采用Multiple Sequence Alignment by CLUSTALW（https：//www.genome.jp/tools-bin/clustalw）進行物種同源性分析;利用MEGA 7.0計算進化距離矩陣，以鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，Bootstrap設(shè)為1000。

1. 4 大刺鰍GH基因組織特異性表達檢測

以實時熒光定量PCR測定GH基因在大刺鰍成魚各組織及胚胎發(fā)育各時期的表達量。以β-actin為內(nèi)參基因，依據(jù)克隆獲得的大刺鰍GH基因cDNA全長設(shè)計特異性引物GH-Real-F和GH-Real-R（表 1）;按HiScript II Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA Wiper）試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系20.0 μL：SYBR 10.0 μL，cDNA模板2.0 μL，上、下游引物各0.4 μL，DEPC水7.2 μL。在Bio-Rad CFX96TM Real Time System儀上進行擴增，擴增程序：95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，進行40個循環(huán)。退火溫度從60 ℃上升到95 ℃，繪制熔解曲線以判斷擴增產(chǎn)物的正確性。使用2–ΔΔCt法換算GH基因在不同組織中的相對表達量，再以SPSS 17.0進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 大刺鰍GH基因cDNA序列全長及氨基酸序列分析結(jié)果

大刺鰍GH基因cDNA序列全長815 bp。其中，5'非編碼區(qū)長33 bp，3'非編碼區(qū)長167 bp，開放閱讀框615 bp，包含AATAA典型轉(zhuǎn)錄終止子加A信號，共編碼204個氨基酸（圖1），GenBank登錄號MH885947。SignalP-5.0 Server預(yù)測分析結(jié)果顯示，大刺鰍GH氨基酸序列的前17個氨基酸殘基組成信號肽，切割位點位于17Ser和18Gln間;ExPASy-ProtParam Tool預(yù)測結(jié)果顯示大刺鰍GH蛋白分子量為23007.33 Da，理論等電點（pI）為6.90，其氨基酸組成中以亮氨酸（Leu）的含量最高（15.7%），絲氨酸（Ser）次之（14.2%），色氨酸（Trp）含量最低（0.5%）。大刺鰍GH蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為56.38，是一種不穩(wěn)定蛋白。蛋白氨基酸殘基親/疏水性總平均數(shù)（GRAVY）為-0.144，說明該蛋白為親水性蛋白。

2. 2 大刺鰍GH氨基酸序列同源性比對及系統(tǒng)發(fā)育進化樹

大刺鰍GH氨基酸序列與GenBank上其他19種物種的GH氨基酸序列進行比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在所有物種中均存在4個保守的半胱氨酸（Cys）殘基，且近C-端區(qū)域內(nèi)的序列高度保守（圖2）。利用Multiple Sequence Alignment by CLUSTALW（https：//www. genome.jp/tools-bin/clustalw）對比GenBank已公布物種（表2）的GH氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)大刺鰍GH氨基酸序列與斑鱖（Siniperca scherzeri）、花鱸（Lateolabrax maculatus）和黃鱔（M. albus）的同源性較高，對應(yīng)的同源性分別為95.59%、95.07%和92.16%;在基于GH氨基酸序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖3）中，大刺鰍與同屬于合鰓目的黃鱔聚為一支，親緣關(guān)系最近，而與陸生動物的同源性僅為25.49%～33.33%，即魚類與哺乳動物形成獨立的進化分支，與形態(tài)學(xué)系統(tǒng)發(fā)育進化樹相吻合。

2. 3 大刺鰍GH基因的組織和時空特異性表達情況

采用實時熒光定量PCR檢測GH基因在大刺鰍不同組織中的表達情況，結(jié)果（圖4）顯示，大刺鰍GH基因在腦組織中的相對表達量最高，顯著高于其他組織中的相對表達量（P<0.05，下同）;其次是肝臟、肌肉、性腺和心臟;腸道中的相對表達量最低。在大刺鰍胚胎發(fā)育的各階段均有GH基因表達，其中以囊胚期的相對表達量較高，其次為原腸胚期，肌節(jié)出現(xiàn)期和出膜期的相對表達量較低（圖5）。

3 討論

大刺鰍是一種特種經(jīng)濟魚類，具有較高的經(jīng)濟價值和研究價值。本研究利用RACE克隆獲得的大刺鰍GH基因cDNA序列全長815 bp，其ORF為615 bp，編碼204個氨基酸;大刺鰍GH蛋白氨基酸也存在4個保守的半胱氨酸殘基（69Cys、177Cys、194Cys和202Cys），與其他已知動物的GH氨基酸序列高度保守。大刺鰍與其他27種物種的GH氨基酸同源性分析結(jié)果表明，大刺鰍與同屬于合鰓目的黃鱔親緣關(guān)系最近，在系統(tǒng)發(fā)育進化樹上聚為一支。通過構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹還可看出，大多數(shù)魚類的系統(tǒng)進化分類結(jié)果與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類一致，說明基于GH氨基酸序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹能較真實地反映物種進化關(guān)系。

GH不僅在生長軸中居于中心位置，還在魚類的個體生長過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。在垂體水平上，GH可通過超短反饋環(huán)路進行自分泌和旁分泌的調(diào)控（李文笙和林浩然，2010），因此明確GH基因在魚類組織中的表達情況，對研究魚類生長具有重要意義。本研究結(jié)果表明，GH基因在大刺鰍不同組織中均有表達，其中又以在腦組織中的相對表達量最高，與在虹鱒（Oncorhynchus mykiss）（Yang et al.，1999）、斜帶石斑魚（Li et al.，2005）和瓦氏黃顙魚（Pelteobagrus vachelli）（徐敏華等，2012）中的表達模式相似;在脾臟、肝臟和性腺等組織中也有表達，與在藍太陽魚（Lepomis cyanellus）（曹運長等，2005）、鞍帶石斑魚（Epinephelus lanceolatus）（Dong et al.，2010）和瓦氏黃顙魚（徐敏華等，2012）等魚類中的研究結(jié)果一致。此外，大刺鰍成魚和其他硬骨魚一樣，GH基因在肌肉組織中的相對表達水平較高，表明GH除了參與代謝調(diào)節(jié)外，還與肌肉發(fā)育和生長有關(guān)。GH可直接與肌肉等靶器官上的GHR結(jié)合，進而影響細胞營養(yǎng)物質(zhì)分泌及其代謝（Dunshea et al.，1992）。本研究在大刺鰍的性腺和脾臟中也檢測到GH基因呈微量表達，與垂體外分泌的GH可參與虹鱒生殖（Loir，1999）及羅非魚（Oreochromis mossambicus）免疫（Yada et al.，2002）等生理活動的結(jié)論一致?？梢?，大刺鰍GH基因在垂體外組織中也存在廣泛表達的現(xiàn)象，由此推測大刺鰍與其他魚類一樣，在垂體外組織中合成的GH可能是以自分泌或旁分泌方式直接作用于自身或相鄰細胞而發(fā)揮重要的生理功能。如在肌肉細胞中合成分泌的GH，可通過IGF介導(dǎo)或其他途徑對其代謝進行調(diào)節(jié);在性腺中合成分泌的GH則通過直接作用于性腺，以調(diào)控生殖活動及其功能（徐敏華等，2012）。

本研究結(jié)果表明，GH基因在大刺鰍胚胎各發(fā)育時期均有表達，其中以在囊胚期的相對表達量最高，出膜期的相對表達量最低。目前，有關(guān)GH基因在魚類胚胎發(fā)育時期表達的研究較少。曹宏（2008）研究發(fā)現(xiàn)，GH基因在中華鱘（Acipenser sinensis）胚胎發(fā)育的14個特定時期一直處于高效表達狀態(tài);Ahmed等（2011）在進行斑馬魚（Dranio rerio）的GHR信號相關(guān)因子表達分析時發(fā)現(xiàn)，GH基因在2-細胞時期呈高表達，其他時期的表達量較低;但臧坤（2014）在星突江蝶（Platichthys stellatus）胚胎發(fā)育各時期均未檢測到GH基因的表達。說明GH基因在不同硬骨魚類胚胎發(fā)育時期的表達存在種類差異，但有關(guān)GH在胚胎發(fā)育過程中的作用還有待于進一步探究。

4 結(jié)論

大刺鰍GH基因具有高度的保守區(qū)域，在各組織中廣泛表達，尤其在腦組織中高表達，說明GH是以自分泌或旁分泌方式對大刺鰍生長發(fā)揮重要作用，且在胚胎發(fā)育過程中對細胞分化具有促進作用。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）