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    補(bǔ)肝益腎顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

    2020-03-20 04:15:48張靖年畢曉黎胥愛麗李養(yǎng)學(xué)李素梅藍(lán)森梅
    關(guān)鍵詞:藿苷皂苷批號(hào)

    張靖年畢曉黎胥愛麗李養(yǎng)學(xué)李素梅藍(lán)森梅

    (1.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院/廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州510095;2.中山大學(xué)新華學(xué)院,廣東 廣州510520)

    補(bǔ)肝益腎顆粒原方系廣東省第二中醫(yī)院骨科專家常用的臨床驗(yàn)方,由淫羊藿、山藥、續(xù)斷、白芍、澤瀉、制何首烏等8 味中藥組成,方中淫羊藿補(bǔ)肝腎之陽[1],為君藥。 溫性之杜仲[2]、續(xù)斷[3]、桑寄生[4]為臣藥,能補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨。 佐以制何首烏補(bǔ)益精血[5],澤瀉利濕而泄腎濁[6],白芍柔肝斂陰[7]。 全方肝腎同補(bǔ),補(bǔ)中寓泄,共奏補(bǔ)益肝腎作用。 該方臨床療效良好,但湯劑存在煎煮、攜帶、使用不方便的特點(diǎn)。 現(xiàn)將其制成顆粒劑,既保持原湯劑的特色和優(yōu)勢,又具有體積小、利于儲(chǔ)藏、便于攜帶、使用方便等優(yōu)點(diǎn)。 但該制劑目前尚無質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),為較好地控制其質(zhì)量以保證臨床療效,本試驗(yàn)采用TLC 法定性鑒別方中君藥淫羊藿、佐藥白芍、制何首烏等藥味。研究表明,淫羊藿苷具有改善骨代謝、治療骨質(zhì)疏松癥等藥理作用[8-9],還可改善生殖功能[10-11]、保護(hù)腎臟[12];川續(xù)斷皂苷Ⅵ對成骨分化具有促進(jìn)作用[13-14],并具有一定的肝臟保護(hù)作用[15-16],這與補(bǔ)肝益腎顆粒的功效有一定的關(guān)聯(lián)性。 因此,本試驗(yàn)采用HPLC 法定量測定君藥淫羊藿所含淫羊藿苷、臣藥續(xù)斷所含川續(xù)斷皂苷Ⅵ的質(zhì)量分?jǐn)?shù),以期為本品質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 儀器與試藥

    1.1 儀器

    CAMAG TLC SAMPLER 4 型自動(dòng)點(diǎn)樣儀,CAMAG REPROSTAR 3 型薄層成像系統(tǒng)(瑞士CAMAG 公司);Waters e2695 Sepatation Module 高效液相色譜儀,Waters 2998 PDA 檢測器,四元梯度泵,Empower Pro 色譜工作站(美國Waters 公司);KQ5200DE 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);METTLER XS205DU 型電子分析天平(瑞士Mettler-Toledo 公司);HH-8 數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海梅香儀器有限公司);MilliPore Advantage A10 自動(dòng)純水機(jī)(美國MilliPore 公司)。

    1.2 試藥

    乙腈等HPLC 所用試劑均為色譜純(德國默克公司);水為屈臣氏蒸餾水;其他試劑均為分析純(廣州化學(xué)試劑廠)。

    補(bǔ)肝益腎顆粒(批號(hào):20181004、20181005、20181006)由廣東省第二中醫(yī)院制劑室提供;淫羊藿對照藥材(批號(hào):121632-201502)、白芍對照藥材(批號(hào):120905-201610)、制何首烏對照藥材(批號(hào):121454-201405)、淫羊藿苷對照品(批號(hào):110737-201516,質(zhì)量分?jǐn)?shù)94.2%)購自中國食品藥品檢定研究院;川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品(批號(hào):C-014-170717,質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.3%)購自成都瑞芬思生物科技有限公司。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 定性鑒別

    2.1.1 淫羊藿的鑒別取本品2 g,加水20 mL 使溶解,用乙酸乙酯振搖提取2 次,每次20 mL,混合乙酸乙酯液,蒸干,殘?jiān)右掖? mL 使溶解,作為供試品溶液。 另取淫羊藿對照藥材0.4 g,加水適量,加熱至沸騰并保持微沸30 min,濾過,濾液濃縮至約20 mL,自“用乙酸乙酯振搖提取2 次”起,同法制成對照藥材溶液。 再取除淫羊藿外處方比例的其余7味中藥,按處方工藝制備陰性樣品,取陰性樣品2 g,自“加水20 mL 使溶解”起,同法制成淫羊藿陰性對照溶液。 按照薄層色譜法[17]試驗(yàn),吸取上述溶液各3 μL,分別點(diǎn)于同一硅膠H 薄層板上,以乙酸丁酯-甲酸-水(體積比13 ∶10 ∶10)的上層溶液為展開劑,展開,取出,晾干,噴以AlCl3試液,105 ℃加熱2 min,置紫外光燈(365 nm)下檢視。 供試品色譜中,在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的熒光斑點(diǎn),陰性對照無干擾。 見圖1。

    圖1 淫羊藿鑒別的薄層色譜圖Figure 1 TLC of Epimedii Folium

    2.1.2 白芍的鑒別取本品4 g,研細(xì),加乙醇25 mL,超聲處理30 min,濾過,濾液蒸干,殘?jiān)铀?0 mL使溶解,用水飽和正丁醇溶液萃取2 次,每次20 mL,混合水飽和正丁醇液,蒸干,殘?jiān)右掖? mL 使溶解,作為供試品溶液。 另取白芍對照藥材1 g,加水適量,加熱至沸騰并保持微沸30 min,濾過,濾液濃縮至約20 mL,自“用水飽和正丁醇溶液萃取2 次”起,同法制成對照藥材溶液。 再取除白芍外處方比例的其余7 味中藥,按處方工藝制備陰性樣品,取陰性樣品4 g,自“加乙醇25 mL”起,同法制成白芍陰性對照溶液。 按照薄層色譜法[17]試驗(yàn),吸取供試品、對照藥材及陰性對照3 種溶液各5 μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上,以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(體積比40 ∶5 ∶10 ∶0.2)為展開劑,展開,取出,晾干。噴以5%(質(zhì)量濃度)香草醛硫酸溶液,105 ℃加熱約1 min。 供試品色譜中,在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上,顯相同的藍(lán)紫色斑點(diǎn),陰性對照無干擾。 見圖2。

    圖2 白芍鑒別的薄層色譜圖Figure 2 TLC of Paeoniae Radix Alba

    2.1.3 制何首烏的鑒別取本品4 g,加水30 mL 使溶解,用乙醚振搖提取2 次,每次30 mL,混合乙醚液,蒸干,殘?jiān)蛹状? mL 使溶解,作為供試品溶液。 另取制何首烏對照藥材1 g,加適量水煮沸30 min,濾過,濾液濃縮至約30 mL,自“用乙醚振搖提取2 次”起,同法制成對照藥材溶液。 再取除制何首烏外處方比例的其余7 味中藥,按處方工藝制備陰性樣品,取陰性樣品4 g,自“加水30 mL 使溶解”起,同法制成制何首烏陰性對照溶液。 按照薄層色譜法[17]試驗(yàn),吸取上述溶液各10 μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上,以環(huán)己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(體積比10 ∶1 ∶1 ∶0.1)為展開劑,展開,取出,晾干,置紫外光燈(365 nm)下檢視。 供試品色譜中,在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的熒光斑點(diǎn),且陰性對照無干擾。 見圖3。

    2.2 定量測定

    2.2.1 對照品溶液的制備取淫羊藿苷、川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品適量,精密稱定,加甲醇制成每1 mL 分別含淫羊藿苷、川續(xù)斷皂苷Ⅵ254.75、113.75 μg 的混合對照品溶液,即得。

    圖3 制何首烏鑒別的薄層色譜圖Figure 3 TLC of Polygoni Multiflori Radix Praeparata

    2.2.2 供試品溶液的制備取本品適量,研細(xì),精密稱取1 g,加甲醇25 mL,稱定質(zhì)量,水浴加熱回流處理60 min,放冷,再稱定質(zhì)量,用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

    2.2.3 空白溶液的制備取甲醇溶液適量,濾過,取續(xù)濾液,即得。

    2.2.4 色譜條件與系統(tǒng)適用性研究色譜柱:phenomenex Luna Omega Polar C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)柱;流動(dòng)相:乙腈(A)-水(B):0 ~20 min,25%A→30%A;20 ~30 min,30%A;柱溫:25 ℃;流速:1.0 mL/min;檢測波長:212 nm;進(jìn)樣量:10 μL。分別精密吸取對照品、供試品、空白溶液10 μL,按上述條件測定,理論塔板數(shù)按淫羊藿苷計(jì),不低于3 000;分離度>1.5。 見圖4。

    2.2.5 線性關(guān)系考察分別精密稱取淫羊藿苷、川續(xù)斷皂苷Ⅵ10.19、4.55 mg,置于同一10 mL 容量瓶中,加甲醇溶解并稀釋定容至刻度,搖勻,記編號(hào)MS1。 精密吸取MS1 5 mL 置于10 mL 容量瓶中,用甲醇稀釋定容至刻度,記編號(hào)MS2;依次倍比稀釋制得MS3~MS6。 分別精密吸取上述6 種混合對照品溶液各10 μL,注入高效液相色譜儀,按“2.2.4”項(xiàng)下色譜條件測定。 以對照品進(jìn)樣量X為橫坐標(biāo),對應(yīng)的峰面積Y為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行線性回歸,得到淫羊藿苷、川續(xù)斷皂苷Ⅵ的回歸方程分別為Y1=1.998 5×105X1-7.369 4×104(r1=0.999 9)、Y2=1.791 5×105X2-5.836 2×103(r2=0.999 9),線性范圍分別為:進(jìn)樣量0.318 4 ~10.190 0 μg、0.142 2 ~4.550 0 μg。 表明淫羊藿苷、川續(xù)斷皂苷Ⅵ進(jìn)樣量與峰面積之間均具有良好的線性關(guān)系。

    圖4 淫羊藿苷、川續(xù)斷皂苷Ⅵ的HPLC 色譜圖Figure 4 HPLC chromatograms of icariin and asperosaponin Ⅵ

    2.2.6 精密度試驗(yàn)取批號(hào)為201801005 的補(bǔ)肝益腎顆粒,按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.2.4”項(xiàng)下方法測定,連續(xù)進(jìn)樣測定6 次,計(jì)算淫羊藿苷和川續(xù)斷皂苷Ⅵ峰面積RSD 值分別為0.38%和0.46%,表明儀器精密度良好。

    2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)取批號(hào)為201801005 的補(bǔ)肝益腎顆粒,按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.2.4”項(xiàng)下方法,分別在0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣測定。 計(jì)算得淫羊藿苷和川續(xù)斷皂苷Ⅵ峰面積RSD值分別為0.88%和0.97%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

    2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn)取批號(hào)為201801005 的補(bǔ)肝益腎顆粒,按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.2.4”項(xiàng)下方法測定,平行操作6 份。 計(jì)算得淫羊藿苷和川續(xù)斷皂苷Ⅵ的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.148 8%、0.193 6%,RSD 值分別為1.60%和1.72%,表明本方法重復(fù)性良好。

    2.2.9 加樣回收率試驗(yàn)取已知淫羊藿苷、川續(xù)斷皂苷Ⅵ質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.149 4%、0.193 0%的補(bǔ)肝益腎顆粒(批號(hào):201801005)9 份,每份0.5 g,精密稱定。 分別加入為樣品中待測成分約0.5、1.0、1.5倍量的淫羊藿苷和川續(xù)斷皂苷Ⅵ,按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,再按“2.2.4”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測定,計(jì)算回收率。 結(jié)果淫羊藿苷和川續(xù)斷皂苷Ⅵ平均回收率分別為99.82%、100.70%,表明回收率良好。 見表1。

    表1 補(bǔ)肝益腎顆粒中淫羊藿苷、川續(xù)斷皂苷Ⅵ加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Recovery results of icariin and asperosaponin Ⅵin Bugan Yishen granules (n=9)

    2.2.10 樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定分別取批號(hào)20181004、20181005、20181006 的補(bǔ)肝益腎顆粒各2 份,按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,再按“2.2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定,計(jì)算淫羊藿苷和川續(xù)斷皂苷Ⅵ的質(zhì)量分?jǐn)?shù),結(jié)果見表2。

    表2 補(bǔ)肝益腎顆粒中淫羊藿苷、川續(xù)斷皂苷Ⅵ質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定結(jié)果Table 2 The contents of icariin and asperosaponin Ⅵin Bugan Yishen granules (n=2) w/%

    結(jié)果顯示,3 批補(bǔ)肝益腎顆粒中淫羊藿苷、川續(xù)斷皂苷Ⅵ的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.154 3%和0.194 5%,以平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)的80%設(shè)限,規(guī)定本品淫羊藿苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得低于0.124%,川續(xù)斷皂苷Ⅵ質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得低于0.156%。

    3 討論

    補(bǔ)肝益腎顆粒為水提制劑,因此進(jìn)行質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定樣品前處理時(shí)考察了甲醇-水和乙醇-水溶媒體系,分別在甲醇、50%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲醇、乙醇和50%乙醇4 種溶媒條件下測定淫羊藿苷和川續(xù)斷皂苷Ⅵ的質(zhì)量分?jǐn)?shù),結(jié)果表明甲醇提取效果最佳。淫羊藿苷最大吸收波長為270 nm,而川續(xù)斷皂苷Ⅵ為212 nm,經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在212 nm 下測定淫羊藿苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)與270 nm 下檢測時(shí)相比,結(jié)果區(qū)別不大,因此選取212 nm 作為測定波長同時(shí)測定2 種化學(xué)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

    本試驗(yàn)建立的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可快速、準(zhǔn)確反映該制劑質(zhì)量,為其臨床療效及質(zhì)量控制提供了理論依據(jù),對補(bǔ)肝益腎顆粒的進(jìn)一步開發(fā)具有一定的指導(dǎo)意義。

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