肝靶向肽-人腫瘤壞死因子融合基因的克隆、可溶性表達(dá)及鑒定

佟陳昀顥郭平馬艷

（廣東藥科大學(xué)1.公共衛(wèi)生學(xué)院； 2.生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東 廣州510006）

人腫瘤壞死因子（human tumor necrosis factor α，TNFα）是一種可直接殺傷腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞因子［1］。 TNFα 在體內(nèi)單獨(dú)應(yīng)用具有抗腫瘤作用，與IFN、抗癌藥物、高溫療法等聯(lián)合應(yīng)用治療肝癌可增強(qiáng)療效，然而TNFα 生物學(xué)功能的復(fù)雜性又使其在臨床應(yīng)用時(shí)表現(xiàn)出明顯的毒副作用［2］，如促炎癥效應(yīng)、高熱、寒戰(zhàn)、嚴(yán)重低血壓等，并且即使全身用藥時(shí)在人的耐受劑量范圍內(nèi)，腫瘤內(nèi)部達(dá)不到治療需要的有效濃度，因此嚴(yán)重限制了其在腫瘤治療中的進(jìn)一步應(yīng)用，所以降低TNFα 的毒副作用或增加其在腫瘤局部的濃度是應(yīng)用TNFα 抗腫瘤的關(guān)鍵。 目前認(rèn)為TNFα 局部靶向性應(yīng)用可以在不引起嚴(yán)重毒副反應(yīng)的情況下，將TNFα 在腫瘤組織中富集作用于腫瘤細(xì)胞［3］，取得較好的效果，大幅度地降低了TNFα 的用量和毒副作用。

環(huán)子孢子蛋白（circumsporozoite protein，CSP）是覆蓋于瘧原蟲子孢子表面的一種錨定蛋白［4］，其N端I-plus 片段能與肝細(xì)胞表面硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（ heparan sulfate proteoglycan，HSPG）發(fā)生特異性結(jié)合而靶向肝臟［5］。 本課題組前期已成功構(gòu)建CSP I-plus 修飾的干擾素和內(nèi)皮抑制素，結(jié)果顯示均具有良好的靶向性與生物活性［6-8］。 本實(shí)驗(yàn)通過基因重組技術(shù)SOEing PCR 擴(kuò)增CSP-TNFα融合基因，并構(gòu)建原核表達(dá)載體CSP-TNFα／pET21b 對(duì)其進(jìn)行大腸桿菌原核表達(dá)，以期獲得肝靶向肽-人腫瘤壞死因子CSP-NFα 融合蛋白，為下一步研究其生物學(xué)活性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HepG2 細(xì)胞、E． coliDH5α、E． coliBL21（DE3）和質(zhì)粒pET21b 均為本實(shí)驗(yàn)室保存，TaqDNA 聚合酶、內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ、T4 DNA 連接酶、pMD20-T 購自TaKaRa 公司；第一鏈合成試劑盒購自Invitrogen 公司，總RNA 提取試劑盒、DNA 純化回收試劑盒和質(zhì)粒小量提取試劑盒購自Tiangen 公司；Imidazole（咪唑）、TEMED 購自BioRad 公司；酵母提取物和胰蛋白胨購自O(shè)xoid 公司、Anti-6×His 鼠多克隆抗體、山羊抗小鼠IgG HRP 標(biāo)記二抗購自Santa cruz 公司；HisTrap Kit 親和層析填料、XK 16／20 層析空柱購自GE healthcare 公司。

1.2 引物的設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI Genbank 公布的TNFα 和CSP I-plus基因序列，用Primer Premier 5.0 生物軟件設(shè)計(jì)特異性引物P1 ～P4，如表1 所示。 P1、P2 引物擴(kuò)增TNFα基因，約702 bp，引物P3、P4、P2 擴(kuò)增CSPTNFα融合基因，不含編碼TNFα 信號(hào)肽基因序列，約543 bp。 引物P2 含有無終止子TNFα C 端互補(bǔ)序列和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)引物，P3 含有NdeⅠ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和編碼CSP I-plus 19 個(gè)氨基酸的部分序列，引物P4 含有與P3 相同序列、編碼CSP I-plus 19 個(gè)氨基酸的其余部分序列和編碼無信號(hào)肽TNFα N 端序列。 引物由Invintrogen 公司合成。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3 方法

1.3.1 擴(kuò)增CSP-TNFα 融合基因提取人肝癌細(xì)胞HepG2 總RNA，以P1 和P2 為引物，RT-PCR 擴(kuò)增TNFα基因，再以TNFα基因序列為模板，以P3、P4、P2 為引物，SOEing PCR 擴(kuò)增CSP-TNFα融合基因。1%凝脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 結(jié)果。

1.3.2 構(gòu)建重組質(zhì)粒CSP-TNFα／pMD20-T純化回收CSP-TNFα融合基因的PCR 產(chǎn)物，與pMD20-T 載體連接，并轉(zhuǎn)化至E．coliDH5α 感受態(tài)中進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。 挑取白色單菌落進(jìn)行PCR 鑒定，對(duì)PCR鑒定陽性菌株搖菌抽提質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，將酶切鑒定為陽性菌株送上海Invitrogen 公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3.3 構(gòu)建表達(dá)載體CSP-TNFα／pET21bCSPTNFα／pMD20-T 和pET21b 經(jīng)過雙酶切后膠回收，將獲得的CSP-TNFα 片段和線性化pET21b 連接，并轉(zhuǎn)化至E．coliDH5α 感受態(tài)中進(jìn)行抗性篩選，挑取單菌落搖菌抽提質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，將鑒定為陽性菌株送上海Invitrogen 公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.3.4 CSP-TNFα 的生物信息學(xué)分析利用Prot Param（https：／ ／web.expasy.org／protparam／）分析表達(dá)載體中CSP-TNFα 開放閱讀框編碼蛋白的基本參數(shù)，包括：氨基酸組成、分子量、理論等電點(diǎn)，在大腸桿菌、哺乳動(dòng)物和酵母中的半衰期，脂溶性指數(shù)及不穩(wěn)定指數(shù)等。

1.3.5 CSP-TNFα 的可溶性表達(dá)及鑒定將表達(dá)載體CSP-TNFα／pET21b 轉(zhuǎn)化到E．coilBL21 感受態(tài)中，獲得CSP-TNFα／pET21b-T／BL21 重組菌株，按參考文獻(xiàn)［8］方法，挑取單菌落培養(yǎng)過夜后分別于37 ℃、20 ℃下誘導(dǎo)表達(dá)4 h、20 h。 收集菌體超聲裂解，將裂解上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE 和Westernblot 鑒定。

1.3.6 CSP-TNFα 純化將可溶性表達(dá)獲得的菌體裂解上清進(jìn)行Ni-NTA 親和層析純化，方法參照文獻(xiàn)［8］。 CSP-TNFα 融合蛋白C 端有6×His 標(biāo)簽，可與Ni2＋離子發(fā)生特異性結(jié)合，吸附在Ni 柱上。 用0%～100%咪唑洗脫，收集洗脫液SDS-PAGE 分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 CSP-TNFα 融合基因的擴(kuò)增及鑒定

以HepG2 cDNA 為模板，以P1 和P2 為引物RT-PCR 擴(kuò)增全長(zhǎng)TNFα基因，結(jié)果如圖1 所示，在702 bp 處有清晰的目的條帶，與預(yù)期大小相符。 以擴(kuò)增的全長(zhǎng)TNFα基因產(chǎn)物為模板，通過引物P3、P4、P2，SOEing PCR 擴(kuò)增大小為543 bp 的不含編碼TNFα 信號(hào)肽序列和終止密碼子的CSP-TNFα融合基因。 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示：在約543 bp 處有大小相符的目的條帶，初步判定CSP-TNFα融合基因擴(kuò)增成功（圖2）。

2.2 重組質(zhì)粒CSP-TNFα／pMD18-T 鑒定

SOEing PCR 產(chǎn)物純化后進(jìn)行TA 克隆，對(duì)藍(lán)白斑篩選結(jié)果為白色單菌落進(jìn)行PCR 鑒定，結(jié)果如圖3，在約543 bp 處有特異性條帶。 酶切鑒定發(fā)現(xiàn)，與菌落PCR 結(jié)果一致，初步判定約543 bp 處條帶為融合基因，在2 000～4 000 bp 之間條帶為pMD20-T載體（圖4）。 測(cè)序結(jié)果：融合基因含有編碼CSP Iplus 序列、無信號(hào)肽和終止密碼子的TNFα 序列，其中TNFα 序列與NCBI：NM＿000594.3 一致，無突變，說明CSP-TNFα融合基因擴(kuò)增成功。

圖1 RT-PCR 擴(kuò)增TNFα 基因Figure 1 Amplification of TNFα by RT-PCR

圖2 SOEing PCR 擴(kuò)增CSP-TNFα 融合基因Figure 2 Amplification of CSP-TNFα by SOEing PCR

圖3 PCR 鑒定CSP-TNFα／pMD20-TFigure 3 Identification of CSP-TNFα／pMD20-T by PCR

2.3 表達(dá)載體CSP-TNFα／pET21b 的鑒定

將構(gòu)建的重組表達(dá)載體CSP-TNFα／pET21b 用NdeⅠ和XhoⅠ酶切，得到大小2 個(gè)片段，大片段約5 400 bp為pET21b，小片段約543 bp 為CSP-TNFα目的基因（圖5）。 測(cè)序結(jié)果表明目的基因和表達(dá)載體連接方向正確，無基因突變，表明重組表達(dá)載體CSP-TNFα／pET21b 構(gòu)建成功。

圖4 酶切鑒定CSP-TNFα／pMD20-TFigure 4 Identification of CSP-TNFα／pMD20-T by enzyme digestion

圖5 表達(dá)載體CSP-TNFα／pET21b 的酶切鑒定Figure 5 Enzymatic identification of CSP-TNFα／pET21b

2.4 融合蛋白CSP-TNFα 的生物信息學(xué)分析

如圖6 所示，CSP-TNFα／pET21b 中開放閱讀框編碼含有187 個(gè)氨基酸的融合蛋白CSP-TNFα，含有肝靶向肽CSP Ⅰ-plus-人腫瘤壞死因子TNFα-純化標(biāo)簽6?His，相對(duì)分子質(zhì)量為21 003.89，在大腸桿菌體內(nèi)的半衰期＞10 h，脂溶性指數(shù)為73.13，不穩(wěn)定指數(shù)為32.45，表明CSP-TNFα 穩(wěn)定好，有利于基因工程表達(dá)；兩親指數(shù)GRAVY 為-0.494，表明此CSP-TNFα 具有疏水性，有利于分離純化。

2.5 CSP-TNFα 的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定

SDS-PAGE 表明，CSP-TNFα／pET21b／BL21 重組菌株37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h、20 ℃誘導(dǎo)表達(dá)20 h 均獲得大小約21 000 蛋白條帶，初步推斷目的蛋白表達(dá)成功，其中37 ℃裂解上清中目的蛋白含量少，20 ℃裂解上清中目的蛋白含量較高；Western-blot 鑒定結(jié)果：在相對(duì)分子質(zhì)量約21 000 處有特異性蛋白條帶，表明融合蛋白CSP-TNFα 在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中可溶性表達(dá)成功（圖7）。 后續(xù)選擇20 ℃誘導(dǎo)20 h進(jìn)行目的蛋白可溶性表達(dá)。

圖6 融合蛋白CSP-TNFα 的氨基酸序列Figure 6 Amino acid sequence of CSP-TNFα

圖7 CSP-TNFα／pET21b-T／BL21 誘導(dǎo)表達(dá)后SDS-PAGE 分析和Western-blot 鑒定Figure 7 Identification of CSP-TNFα／pET21b-T／BL21 by SDSPAGE and Western-blot

2.6 可溶性CSP-TNFα 的表達(dá)純化

CSP-TNFα 可溶性表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Ni 柱純化，用咪唑洗脫后進(jìn)行SDS-PAGE，圖8 為融合蛋白純化洗脫峰，圖9 為純化洗脫峰收集液SDS-PAGE，可見在洗脫峰一和洗脫峰二都含有相對(duì)分子質(zhì)量約21 000 特異性蛋白，為目的洗脫峰，并且條帶灰度掃描得出蛋白純度約為97%，說明Ni 柱純化后獲得較純的CSP-TNFα 融合蛋白，下一步可進(jìn)行生物學(xué)活性測(cè)定。

圖8 CSP- TNFα 的純化洗脫峰圖Figure 8 Elution peaks of CSP-TNFα

圖9 CSP-TNFα 純化洗脫液SDS-PAGE 分析Figure 9 SDS-PAGE analysis of CSP-TNFα purified eluent

3 討論

瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白CSP 分布于整個(gè)瘧原蟲子孢子表面［12］，研究表明CSPⅠ-plus N 端保守Ⅰ區(qū)是瘧原蟲子孢子吸附與入侵肝細(xì)胞的關(guān)鍵，可與肝細(xì)胞表面的HSPG 發(fā)生特異性結(jié)合［13］，不僅干擾其受體功能，抑制血管形成與細(xì)胞增殖［14］，還具有高效而特異的肝細(xì)胞靶向性，可作為藥物載體靶向肝臟［15］。 本實(shí)驗(yàn)室通過基因工程技術(shù)已成功構(gòu)建肝靶向肽修飾的人干擾素和重組人內(nèi)皮抑制素，研究結(jié)果顯示其在體內(nèi)和體外都能較好地靶向肝細(xì)胞，并對(duì)其生物活性和靶向機(jī)制進(jìn)行了初步研究。 人腫瘤壞死因子是迄今為止人們發(fā)現(xiàn)抗腫瘤活性最強(qiáng)的細(xì)胞因子［9］，但其較強(qiáng)的毒副作用以及難以在腫瘤細(xì)胞局部形成高濃度TNFα 發(fā)揮抗癌作用，限制了在臨床上的應(yīng)用。 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道靶向性多肽作為導(dǎo)向分子構(gòu)建融合蛋白，可以克服以上缺點(diǎn)［10-11］。 本文通過TNFα 與肝細(xì)胞靶向肽CSPⅠ-plus 相結(jié)合，獲得肝靶向肽-人腫瘤壞死因子融合蛋白CSP-TNFα，以期提高TNFα 靶向性、達(dá)到肝細(xì)胞聚集高濃度TNFα 的效果、降低用量和毒副作用，為后期檢測(cè)其生物學(xué)活性奠定基礎(chǔ)。

本研究以反轉(zhuǎn)錄PCR 克隆TNFα cDNA 為基礎(chǔ)，利用重疊延伸PCR（SOEing PCR）技術(shù)成功構(gòu)建融合基因CSP-TNFα，該方法操作簡(jiǎn)單，因無需設(shè)計(jì)內(nèi)切酶位點(diǎn)而引入不必要的氨基酸殘基，使融合蛋白更接近天然多肽。 生物信息學(xué)分析得出，融合蛋白CSP-TNFα 含187 個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量約為21 000，能夠在大腸桿菌系統(tǒng)中穩(wěn)定表達(dá)，且具有良好的疏水性便于分離制備；另外，CSP-TNFα 融合蛋白具有TNFα 和CSP 100%同源保守功能域和6×His純化結(jié)構(gòu)域。 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)因培養(yǎng)周期短、目標(biāo)基因表達(dá)水平高、遺傳背景清楚，是目前應(yīng)用最為廣泛的蛋白表達(dá)體系［16-17］，但表達(dá)的目的蛋白易形成無活性的包涵體。 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，降低誘導(dǎo)溫度可降低包涵體形成［18］。 6×His 標(biāo)簽相對(duì)分子質(zhì)量小、低免疫原性、親水性，是被公認(rèn)使用的融合蛋白標(biāo)簽，用于一系列目的蛋白純化。 為保證6×His 標(biāo)簽融合蛋白CSP-TNFα 表達(dá)產(chǎn)物的正確結(jié)構(gòu)和生物活性，行使蛋白功能，本文將原核表達(dá)載體CSPTNFα／pET21b 轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌進(jìn)行低溫誘導(dǎo)表達(dá)，盡量避免進(jìn)行包涵體表達(dá)，提高可溶性表達(dá)。經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：在誘導(dǎo)溫度為37 ℃時(shí)，融合蛋白CSPTNFα 幾乎全部形成包涵體；在誘導(dǎo)溫度為20 ℃時(shí)，大部分融合蛋白CSP-TNFα 以可溶性形式表達(dá)，獲得較多可溶性融合蛋白CSP-TNFα，這可能與低溫狀態(tài)下蛋白表達(dá)速度緩慢并促進(jìn)其正確折疊有關(guān)［18］，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇誘導(dǎo)條件為20 ℃，20 h 進(jìn)行低溫可溶性表達(dá)并進(jìn)行蛋白Ni 柱純化。

本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建CSP-TNFα／pET21b-T／BL21 原核表達(dá)系統(tǒng)并進(jìn)行可溶性表達(dá)及鑒定和純化，成功制備一種可能對(duì)肝癌細(xì)胞具有靶向性的CSP-TNFα 融合蛋白，為下一步研究其生物學(xué)活性奠定了基礎(chǔ)。