藏藥波棱瓜子殼中總甾醇的同時檢測及分離鑒定

李韻之　劉文亞　陳懷玲　宋諭　汪俊松

【摘 要】目的：采用HPLC法同時檢測波棱瓜子殼中的總甾醇，并對其中兩個含量較大的甾醇進行分離鑒定。方法：采用Thermo Acclaim 120 C18 色譜柱（25cm*4.6mm，5μm）;流動相為100%甲醇;柱溫為35℃;流速為 1.5 mL·min-1 ;檢測波長205nm;進樣量10μL。采用硅膠柱層析、結(jié)晶、制備薄層以及NMR等色譜和光譜手段對其中兩個含量較高的甾醇進行了分離鑒定。結(jié)果：波棱瓜子殼中的總甾醇在建立的色譜條件下分離良好，兩個含量較大的甾醇分別鑒定為7，22，25-豆甾三烯醇和α-菠甾醇。結(jié)論：首次建立了波棱瓜子殼中同時檢測總甾醇的方法，此方法操作簡便，重復性好;甾醇結(jié)構(gòu)的確定為波棱瓜子的綜合利用提供了依據(jù)。

【關鍵詞】高效液相色譜法（HPLC）;波棱瓜子殼;總甾醇;豆甾三烯醇;菠甾醇

【中圖分類號】R657.72 【文獻標識碼】A 【文章編號】1672-3783（2020）03-09--01

波棱瓜子（Herpetospermum caudigerum Wall.）是葫蘆科植物波棱瓜成熟干燥的種子，藏語為“色吉美多”，是傳統(tǒng)藏醫(yī)藥，在藏族醫(yī)學中有著廣泛的用途。多用來與其他藏藥配伍，治療多種肝膽疾病。本課題組對波棱瓜子殼未進行皂化，而是進行了富集純化，得到了純化后的總甾醇。然后利用RP-HPLC法首次對純化的波棱瓜子殼總甾醇進行了同時檢測，方法簡單易操作，重復性良好，分離度高。并對其中兩個含量較大的甾醇進行了分離、鑒定，兩者均首次從波棱瓜子殼中分離得到。甾醇測定方法的建立以及結(jié)構(gòu)的確定為波棱瓜子藥效物質(zhì)基礎的闡明、綜合開發(fā)利用提供了理論基礎。

1 實驗部分

1.1 儀器與試藥

高效液相色譜儀CTO-20A（日本島津）;THERMO SCITIFIC UltiMate3000超高效液相色譜儀（美國賽默飛世爾科技）;YMC-Pack ODS-A色譜柱（20*250mm，日本YMC）;電子天平 AR224CN （奧豪斯儀器）;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 OSB-2000 （惠恒科技）;硅膠柱（青島海洋化工）;HPLC用甲醇為色譜級，乙醇、石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷等其余試劑均為分析級。

試藥為波棱瓜子殼總甾醇（Total Sterols In the Shell of Herpetospermum caudigerum Wall.， 縮寫為HCSTS），為實驗室自制。其中波棱瓜子殼采自于西藏林芝地區(qū)。

1.2 方法與結(jié)果

1.2.1 HCSTS的制備

波棱瓜子殼7.4 Kg粉碎至30目，用10倍量乙醇回流提取3次，減壓回收溶劑得浸膏350 g。適量水混懸后，用石油醚萃取3次，減壓回收溶劑得石油醚部位90 g。取石油醚部位30g，適量硅膠拌樣，于硅膠柱上用石油醚：乙酸乙酯（9：1-7：3）梯度洗脫，Liebermann-Burchard反應檢測，合并甾醇流分，回收溶劑，得甾醇粗品約1.2 g。甾醇粗品用二氯甲烷與甲醇混合溶劑溶解，放置析晶，晶體用無水乙醇重結(jié)晶得總甾醇純品（HCSTS）540 mg。

1.2.1 色譜條件之流動相的考察

精密稱取5 mg HCSTS，用THF溶解，0.22 μm微孔濾膜過濾，制成1 mg/mL的供試品溶液。初試乙腈-水、100%乙腈系統(tǒng)，無論是等度還是梯度，洗脫效果均不理想，故采用甲醇-水系統(tǒng)作為流動相。分別考察了97%、98%以及100%甲醇三個洗脫比例。色譜柱：Thermo Acclaim 120 C18 色譜柱（25cm*4.6mm，5μm）;柱溫為30℃;流速為 1 mL·min-1 ;檢測波長205nm;進樣量10μL。結(jié)果顯示，100%甲醇在15.3-22.5min內(nèi)將甾醇全部洗脫出來，且各峰之間分離度較好，而97%和98%甲醇分別在20.1和17.4min才將第一個峰洗脫出來，且分離度較差。因此，選擇100%甲醇作為流動相洗脫HCSTS。

1.2.2 色譜條件之溫度的考察

供試品溶液配制同1.2.1，流動相為100%甲醇，溫度設為35、45、55三個梯度。其余色譜條件1.2.1。結(jié)果顯示，升高溫度后，第一峰的出峰時間逐漸縮短，表明甲醇對HCSTS的洗脫能力增強，但同時伴隨著分離度的逐漸降低，綜合考慮，選擇35℃作為洗脫溫度。

1.2.3 色譜條件之流速的考察

供試品溶液配制同1.2.1，流動相為100%甲醇，溫度為35℃，流速設為1、1.5、2 ml/min 三個梯度。其余色譜條件1.2.1。結(jié)果顯示，流速為1.5 ml/min的時候，第一峰出峰時間約為10 min，全部洗脫約15 min，而1 ml/min的時候全部洗脫需要23min，并且與1.5 ml/min相比，兩者分離度相差不大，而流速為2 ml/min時，雖洗脫時間大為減少，分離度也較好，但甾醇第一峰與前面的雜質(zhì)可能會有重合，且考慮到柱子及儀器的使用安全，故綜合考慮，流速設為1.5ml/min。

1.2.4 色譜條件與專屬性考察

經(jīng)過前面對流動相、溫度以及流速分別進行考察后，確定為合適的洗脫條件為：采用Thermo Acclaim 120 C18 色譜柱（25 cm*4.6 mm，5 μm）;流動相為100%甲醇;柱溫為35℃;流速為 1.5 mL·min-1 ;檢測波長205 nm;進樣量10 μL。記錄色譜圖20 min。

在該色譜條件下，兩個量大的甾醇a和e峰型好，且與其他幾個含量較低的甾醇達到了理想的分離效果。b、c、d、f幾個甾醇對a和e的分析和分離均無干擾。

1.2.5 精密度與穩(wěn)定性考察

精密吸取HCSTS溶液10 μL，按“1.2.4”的色譜條件重復進樣6次（n=6），記錄a和e的峰面積，計算得a和e的峰面積RSD分別為1.12%和1.07%，表明該方法的精密度良好。取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、16、24 h進樣，記錄峰面積，計算得a和e的峰面積RSD分別為0.86%和1.02%，表明HCSTS溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

1.2.6 重復性考察

按“1.2.1”項配置6份HCSTS溶液，并按“1.2.4”項的色譜條件測定，記錄峰面積。計算得甾醇a和e的峰面積RSD分別為1.75%和1.12%，表明該方法的重復性良好。

1.2.7 a和e的分離與鑒定

由圖1可知，a和e為含量較大的兩個甾醇，且分離度較好，易于制備分離。取100 mg HCSTS，適量THF溶解，制備分離得到化合物單體a（29 mg）和e（45 mg）。a和e均為白色針狀結(jié)晶，L-B反應陽性，TLC上展開劑比例為石油醚-乙酸乙酯（7：3）時，Rf約0.5，10%硫酸-乙醇顯紫紅色。在ACPI-MS質(zhì)譜中，a和e的加合離子[M+H-H2O]+分別為392.2443和394.3559，因此，給出a和e的分子量分別為410.3549和412.3705。經(jīng)核磁共振1H-NMR和13C-NMR鑒定，確定了甾醇a為7，22，25-豆甾三烯醇，e為α-菠甾醇。

2 討論

植物甾醇極性小、結(jié)構(gòu)相似，極性相差不大，且紫外無吸收，常常在石油醚部位與油脂共存，分析、分離較為困難。本課題組前期對樣品直接分析，發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)較多，峰型很差，可能是由于非極性及小極性物質(zhì)影響較大。文獻中對甾醇的分析多是先提取，再皂化，然后萃取，之后就進行HPLC分析，不可避免會有其他物質(zhì)的干擾甾醇分析。本課題組首先對石油醚部位的甾醇進行富集，除去了大部分油脂、色譜和其他類物質(zhì)。又利用混合溶劑對甾醇粗品進行結(jié)晶和重結(jié)晶，得到了含有多種甾醇的總甾醇，而幾乎不含其它類的雜質(zhì)，大大提高了分析的準確度和可信度。對總甾醇的分析，前期嘗試了乙腈-水、100%乙腈系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)乙腈系統(tǒng)相比于甲醇系統(tǒng)對總甾醇的洗脫能力較弱，可能是由于乙腈極性較大，甾醇樣品在乙腈中溶解度較低的緣故，故本實驗選用甲醇系統(tǒng)作為流動相。由于甾醇類物質(zhì)的紫外吸收波長很短，又考慮到基線平穩(wěn)，選擇205nm作為檢測波長。本課題組分別考察了溫度、流速、流動相等因素，確定了色譜條件如“1.2.4”。此方法具有分析時間短、峰型好、雜質(zhì)干擾小、分離度高的特點。對其中的兩個含量較高的甾醇a和e進行了制備純化，并確定了其結(jié)構(gòu)。大量文獻報道，植物甾醇具有顯著的降低血脂、膽固醇的功效，而2型糖尿病患者普遍存在血液中低密度脂蛋白和甘油三酯濃度偏高等血脂異常癥狀，純化的總甾醇或許會為糖尿病的治療與控制提供新思路。色譜方法的開發(fā)和甾醇結(jié)構(gòu)的確定對于后期波棱瓜子殼中甾醇含量測定乃至其他植物甾醇的分析，都會有一定的參考價值。

參考文獻：

宇妥， 元丹貢布. 四部醫(yī)典精版[M]. 江蘇科學技術出版社， 2016.

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