肺部感染患者痰液與肺泡灌洗液病原菌分布及培養(yǎng)結(jié)果分析

秦 蓉 ，何 平，張頤豪，王硯春

1. 上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)與微生物系，上海 200025；2. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院南院檢驗(yàn)科，上海 201114；3. 復(fù)旦大學(xué) 附屬腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200032

肺部感染是全球發(fā)病率最高的感染性疾病[1]。由于該類(lèi)感染涉及的病原菌眾多，在無(wú)法進(jìn)行準(zhǔn)確的病原學(xué)診斷前，多數(shù)醫(yī)師不得不采取經(jīng)驗(yàn)治療[2]。為充分掌握肺部感染致病菌的病原菌及藥敏特點(diǎn)，提高疾病治療的效果，降低口腔細(xì)菌的污染率[3]，臨床常采用纖維支氣管鏡提取患者的支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）作為下呼吸道樣本進(jìn)行病原菌的培養(yǎng)（即金標(biāo)準(zhǔn)），從而指導(dǎo)臨床抗生素的使用[4-5]。然而，作為臨床上最為常用的檢驗(yàn)方法，痰液（sputum，SP）樣本培養(yǎng)有著取樣方便、操作容易等優(yōu)點(diǎn)，但該方法的采樣合格率因人而異，易受口腔定植菌群的影響，因此僅依賴(lài)SP 樣本培養(yǎng)行病原菌診斷尚缺乏定論。為進(jìn)一步探討SP 樣本的病原菌結(jié)果能否作為肺部感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)，分析該樣本與BALF 樣本間是否存在較大差異及其培養(yǎng)的優(yōu)缺點(diǎn)，本研究對(duì)2 種樣本的培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行比較分析，以期為臨床上使用SP 培養(yǎng)作為常規(guī)檢查（替代BALF 培養(yǎng)）提供有力的依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

回顧性選取2018 年1 月—2019 年6 月于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院南院就診的肺部感染患者313 例，其中男性169 例、女性144 例，平均年齡（57.51±14.50）歲。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者均需符合我國(guó)肺部感染診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]。②新近出現(xiàn)咳嗽、咳痰，或原有呼吸道疾病加重，并出現(xiàn)膿性痰。③發(fā)熱。④肺實(shí)變體征和/或濕性啰音。⑤白細(xì)胞計(jì)數(shù)>10×109/L 或<4×109/L。⑥胸部X 線檢查顯示片狀、斑片狀浸潤(rùn)陰影或間質(zhì)性改變。

本研究已通過(guò)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批（審批號(hào)：2016075）。由于本研究中所有數(shù)據(jù)均為匿名使用，且不包含受保護(hù)者的個(gè)人健康信息，因此倫理委員會(huì)批準(zhǔn)了可放棄知情同意的要求。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本采集 采用自然咳痰法或一次性吸痰管法對(duì)SP 樣本進(jìn)行采集。采用1T-180 型纖維支氣管鏡（Olympus，日本）對(duì)BALF 樣本進(jìn)行采集，具體步驟如下：向需要灌洗的肺段注入2%利多卡因1 ～2 mL進(jìn)行局部麻醉。經(jīng)活檢孔快速注入37 ℃滅菌生理鹽水，每次25 ～50 mL，總量100 ～200 mL。立即采用50 ～100 mmHg 負(fù)壓吸引、回收BALF，并通過(guò)雙層無(wú)菌紗布過(guò)濾以除去黏液。而后，將BALF 裝入無(wú)菌硅化玻璃容器并置于冰上，記錄總量后立即送至檢驗(yàn)科行后續(xù)研究。該2 種樣本的采集時(shí)間間隔均在24 h 以?xún)?nèi)。

1.2.2 樣本的篩選、培養(yǎng)、鑒定及分組 檢驗(yàn)科微生物實(shí)驗(yàn)室參照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)范（第4 版）》對(duì)SP樣本和BALF 樣本進(jìn)行質(zhì)量篩查[7]。合格樣本經(jīng)常規(guī)培養(yǎng)18 ～24 h 后，利用VITEK 2Compact 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏系統(tǒng)（BioMérieux，法國(guó)）對(duì)細(xì)菌菌株進(jìn)行鑒定分析，利用顯色培養(yǎng)基（Chromagar，法國(guó)）、真菌鑒定卡（BioMérieux，法國(guó)）對(duì)真菌菌株進(jìn)行鑒定分析[8]。其中，同一患者的該2 種樣本的培養(yǎng)結(jié)果視為一組，共313 組。

1.2.3 樣本培養(yǎng)結(jié)果的比較分析 針對(duì)本研究病原菌培養(yǎng)的定性結(jié)果，需行比較分析的指標(biāo)如下：①細(xì)菌培養(yǎng)方面，將培養(yǎng)結(jié)果為口腔正常菌群生長(zhǎng)定義為細(xì)菌陰性結(jié)果，其余培養(yǎng)結(jié)果定義為細(xì)菌陽(yáng)性結(jié)果；將2 種或者以上細(xì)菌發(fā)生感染定義為細(xì)菌復(fù)數(shù)菌感染。②真菌培養(yǎng)方面，將培養(yǎng)結(jié)果為真菌培養(yǎng)5 d 未生長(zhǎng)定義為真菌陰性結(jié)果，其余培養(yǎng)結(jié)果定義為真菌陽(yáng)性結(jié)果；將2 種或者以上真菌發(fā)生感染定義為真菌復(fù)數(shù)菌感染。③細(xì)菌或真菌培養(yǎng)結(jié)果均為陽(yáng)性或陰性被定義為定性一致，培養(yǎng)結(jié)果均為陽(yáng)性但菌種不一致被定義為定性一致但菌種不符。④定性總一致率（完全符合率），即培養(yǎng)結(jié)果均為陰性或者陽(yáng)性占總數(shù)的比例。⑤培養(yǎng)缺省，即為部分樣本僅接受了1 種培養(yǎng)（細(xì)菌培養(yǎng)或真菌培養(yǎng)）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.0 軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定性資料以百分率表示，組內(nèi)比較采用一致性檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2 種樣本病原菌檢測(cè)的總體情況分析

本研究對(duì)313 例肺部感染患者的BALF 樣本與SP樣本的總體培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果如圖1 所示。具體來(lái)看，綜合313 例患者樣本的真菌與細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，定性均為陽(yáng)性或者陰性的樣本總一致率為75.08%（235/313）。共287 例患者同時(shí)接受了2 種樣本的真菌培養(yǎng)檢測(cè)，8 例僅接受了BALF 樣本的真菌培養(yǎng)檢測(cè)，18例均未接受2 種樣本的真菌培養(yǎng)檢測(cè)（即BALF 樣本缺失n=18，SP 樣本缺失n=26）。共264 例患者同時(shí)接受了 2 種樣本的細(xì)菌培養(yǎng)檢測(cè)，1 例僅接受了BALF 樣本的細(xì)菌培養(yǎng)檢測(cè)，48 例均未接受2 種樣本的細(xì)菌培養(yǎng)檢測(cè)（即BALF 樣本缺失n=48，SP 樣本缺失n=49）。

由于存在部分缺失，在后續(xù)進(jìn)行的病原菌分布與一致性比較時(shí)，本研究將去除相應(yīng)缺失病例（26 例真菌培養(yǎng)，49 例細(xì)菌培養(yǎng)），以免對(duì)結(jié)果造成偏倚。

圖1 313 例肺部感染患者的BALF 樣本與SP 樣本的總體培養(yǎng)結(jié)果Fig 1 Overall culture results of BALF and SP specimens from 313 patients with pulmonary infection

2.2 BALF 樣本的培養(yǎng)結(jié)果及分析

本研究對(duì)納入肺部感染患者的BALF 樣本進(jìn)行培養(yǎng)及病原菌分析，結(jié)果（表1）顯示：在295 例接受BALF 樣本真菌培養(yǎng)的患者中，有49 例檢出為陽(yáng)性，陽(yáng)性率達(dá)16.61%（49/295），其中白假絲酵母菌、煙曲霉、光滑假絲酵母菌的檢出率依次位列前三；在265 例接受BALF 樣本細(xì)菌培養(yǎng)的患者中，有73 例檢出為陽(yáng)性，陽(yáng)性率達(dá)27.55%（73/265），其中鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌的檢出率并列第一，肺炎克雷伯菌位列第二?？紤]到復(fù)數(shù)菌感染情況，表1 還列出了按菌株數(shù)量統(tǒng)計(jì)的占比，其中真菌復(fù)數(shù)菌感染菌株為51 株、細(xì)菌復(fù)數(shù)菌感染菌株為89 株，其分布與樣本的陽(yáng)性菌構(gòu)成比相類(lèi)似。

2.3 SP 樣本的培養(yǎng)結(jié)果及分析

本研究對(duì)納入肺部感染患者的SP 樣本進(jìn)行培養(yǎng)及病原菌分析，結(jié)果（表2）顯示：在287 例接受SP 樣本真菌培養(yǎng)的患者中，有75 例檢出為陽(yáng)性，陽(yáng)性率達(dá)26.13%（75/287），其中白假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌、煙曲霉的檢出率依次位列前三；在264 例接受SP 樣本細(xì)菌培養(yǎng)的患者中，有67 例檢出為陽(yáng)性，陽(yáng)性率達(dá)25.38%（67/264），其中鮑曼不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯菌的檢出率并列第一，銅綠假單胞菌位列第二。同樣地，考慮到復(fù)數(shù)菌感染情況，對(duì)該樣本的陽(yáng)性菌及其菌株構(gòu)成進(jìn)行分析，其中真菌復(fù)數(shù)菌感染菌株為76 株、細(xì)菌復(fù)數(shù)菌感染菌株為80 株，結(jié)果顯示2 種構(gòu)成比相類(lèi)似。

表1 BALF 樣本的陽(yáng)性菌及菌株構(gòu)成Tab 1 Positive bacteria composition and strain composition of BALF specimens

表2 SP 樣本的陽(yáng)性菌及菌株構(gòu)成Tab 2 Positive bacteria composition and strain composition of SP specimens

2.4 BALF 樣本與SP 樣本培養(yǎng)結(jié)果的比較分析

綜合前述結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BALF 樣本與SP 樣本的陽(yáng)性真菌均以白假絲酵母菌、煙曲霉、光滑假絲酵母菌為主，陽(yáng)性細(xì)菌則以鮑曼不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌為主。因此，該2 種樣本的主要陽(yáng)性菌種及分布基本一致。

在真菌培養(yǎng)檢測(cè)中，去除26 例培養(yǎng)缺省后，其真菌定性一致率為79.09%（227/287），包含1 例BALF 樣本培養(yǎng)為絲狀真菌混合白假絲酵母菌，而SP 樣本培養(yǎng)為白假絲酵母菌單菌陽(yáng)性的結(jié)果；定性不一致的培養(yǎng)菌種共60例。經(jīng)一致性檢驗(yàn)顯示，2 種樣本真菌培養(yǎng)結(jié)果具有顯著一致性（P=0.000），但一致性較低（Kappa<0.40）（表3）。

表3 BALF 樣本與SP 樣本真菌培養(yǎng)結(jié)果的定性一致性分析Tab 3 Qualitative consistency analysis of fungal culture results of BALF and SP specimens

在細(xì)菌培養(yǎng)檢測(cè)中，去除49 例培養(yǎng)缺省后，其細(xì)菌定性一致率為90.91%（240/264），包含5 例SP 樣本培養(yǎng)有復(fù)數(shù)細(xì)菌生長(zhǎng)而B(niǎo)ALF 樣本培養(yǎng)僅其中幾種細(xì)菌生長(zhǎng)，7 例BALF 樣本培養(yǎng)有復(fù)數(shù)菌生長(zhǎng)而SP 樣本培養(yǎng)僅其中幾種細(xì)菌生長(zhǎng)，另有3 例定性均為陽(yáng)性但菌種鑒定完全不一致的病例；定性不一致的培養(yǎng)菌種共24 例。經(jīng)一致性檢驗(yàn)顯示，2 種樣本細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果亦具有顯著一致性（P=0.000），且一致性較好（Kappa>0.75）（表4）。

表4 BALF 樣本與SP 樣本細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果的定性一致性分析Tab 4 Qualitative consistency analysis of bacterial culture results of BALF and SP specimens

本研究培養(yǎng)結(jié)果定性均為陽(yáng)性且菌種一致的病例數(shù)中，單數(shù)菌有68 例、復(fù)數(shù)菌有6 例，定性均為陽(yáng)性但菌種不一致的單數(shù)菌為1 例、復(fù)數(shù)菌為16 例。因此，在陽(yáng)性菌種水平的完全符合率方面：?jiǎn)螖?shù)菌為98.55%（68/69），包括單數(shù)真菌100.00%（30/30）和單數(shù)細(xì)菌97.44%（38/39）；復(fù)數(shù)菌為27.27%（6/22），包括復(fù)數(shù)真菌50.00%（1/2）和復(fù)數(shù)細(xì)菌25.00%（5/20）。復(fù)數(shù)菌完全不符合率為9.09%（2/22），均是復(fù)數(shù)細(xì)菌，占復(fù)數(shù)細(xì)菌的10.00%（2/20）；復(fù)數(shù)菌部分不符合率為復(fù)數(shù)真菌4.55%（1/22）、復(fù)數(shù)細(xì)菌54.55%（12/22）。

3 討論

近年來(lái)臨床肺部感染的發(fā)病率較高，早期明確病原菌、精準(zhǔn)選擇抗生素是提高該疾病治愈率、降低其致死率的重要措施。臨床上，SP 樣本培養(yǎng)因常存在口腔菌群污染或難以取到病變部位使其應(yīng)用受到限制。目前，臨床肺部感染的初始治療仍依賴(lài)于傳統(tǒng)的經(jīng)驗(yàn)用藥[9]。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，如何明確病原菌特征成為保證有效治療的關(guān)鍵，其也是合理使用抗菌藥物的前提[10]。有研究報(bào)道，以纖維支氣管鏡獲取下呼吸道樣本的檢測(cè)方法（即BALF 樣本培養(yǎng)）優(yōu)于常規(guī)SP 樣本培養(yǎng)[11]，且兼具肺部檢查和治療功能[12]。另有研究[13]認(rèn)為，常規(guī)SP 樣本培養(yǎng)方法依舊是目前指導(dǎo)臨床用藥的主要病原學(xué)方法，但易受到菌群污染，限制了其對(duì)疾病診斷和指導(dǎo)治療的臨床應(yīng)用。一項(xiàng)為期12 年的回顧性研究[14]發(fā)現(xiàn)，SP 與BALF的微生物學(xué)分析的一致性良好，其效率與有創(chuàng)采樣方法相似，且其分析的成本效益更高。因此，SP 與BALF 培養(yǎng)結(jié)果間是否存在差異，且當(dāng)SP 培養(yǎng)結(jié)果與臨床相符時(shí)是否有必要再行BALF 培養(yǎng)，是本研究主要探究的 內(nèi)容。

本研究中，通過(guò)分析SP 樣本與BALF 樣本的培養(yǎng)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該2 種樣本的真菌檢測(cè)一致率為79.09%，一致性檢驗(yàn)顯示該2 種樣本的培養(yǎng)結(jié)果具有顯著一致性；細(xì)菌培養(yǎng)檢測(cè)一致率為90.91%，且培養(yǎng)結(jié)果亦具有顯著一致性。因此，我們認(rèn)為SP 樣本與BALF 樣本的培養(yǎng)結(jié)果間無(wú)顯著差異。由于BALF 樣本采集具有一定的創(chuàng)傷性，根據(jù)本研究結(jié)果我們推測(cè)，當(dāng)SP 培養(yǎng)結(jié)果與臨床癥狀相符合時(shí)，則無(wú)需再行BALF 培養(yǎng)，即臨床上可優(yōu)先參考SP培養(yǎng)結(jié)果。

然而，在本研究中SP 樣本與BALF 樣本的培養(yǎng)結(jié)果也存在部分不一致的情況：①在SP 樣本培養(yǎng)為陽(yáng)性真菌的患者中，有43 例BALF 樣本培養(yǎng)結(jié)果為陰性，其中42（97.67%）例為假絲酵母菌。從臨床角度分析，BALF 樣本為陰性而SP 樣本中有真菌生長(zhǎng)，則可排除侵襲性肺部真菌感染，考慮為上呼吸道真菌的定植或樣本污染，其SP 樣本陽(yáng)性對(duì)臨床診斷意義不大，反而會(huì)影響臨床對(duì)疾病的判斷[15-16]。而去除上述43 例疑似定植真菌污染的結(jié)果，重新行一致性檢驗(yàn)顯示Kappa 值可提高至0.751，即SP 樣本與BALF 樣本的真菌培養(yǎng)一致性較好。而對(duì)于該43 例病例，由于SP 樣本培養(yǎng)存在上呼吸道定植真菌污染的可能性較大，建議結(jié)合臨床及時(shí)行BALF 樣本檢查，以排除侵襲性真菌感染的可能，從而判斷是否為SP 假陽(yáng)性污染并決定是否使用抗真菌藥物治療，在不延誤患者病情的同時(shí)最大限度地避免過(guò)度治療[17-18]。此外，本研究也發(fā)現(xiàn)另有少部分（9 例）SP 樣本培養(yǎng)細(xì)菌陽(yáng)性、BALF 樣本培養(yǎng)細(xì)菌陰性的病例，臨床上同樣需考慮SP 樣本可能存在上呼吸道細(xì)菌定植污染，不建議采取抗菌治療。②有32 例（17 例真菌、15 例細(xì)菌）BALF 樣本培養(yǎng)結(jié)果為陽(yáng)性而SP 樣本培養(yǎng)為陰性，這可能是由于患者自主取樣意識(shí)較差、SP 樣本不合格等原因?qū)е碌腟P 樣本培養(yǎng)假陰性結(jié)果。本研究發(fā)現(xiàn)，在這類(lèi)患者中被檢出有3 例耐碳青霉烯細(xì)菌和1 例耐甲氧西林細(xì)菌，存在多重耐藥的可能。研究[19-20]表明，當(dāng)SP 樣本培養(yǎng)結(jié)果為陰性且臨床癥狀與其他檢測(cè)結(jié)果不符時(shí)，建議盡早采用BALF 樣本培養(yǎng)，彌補(bǔ)SP 培養(yǎng)因樣本的局限性而導(dǎo)致的漏檢，同時(shí)配合病原菌藥敏試驗(yàn)，以指導(dǎo)臨床合理使用抗菌藥物。③在本研究2 種樣本細(xì)菌培養(yǎng)均為陽(yáng)性的58 例病例中，包括了結(jié)果中描述的5 例SP 樣本培養(yǎng)有復(fù)數(shù)細(xì)菌生長(zhǎng)而B(niǎo)ALF 樣本培養(yǎng)僅其中幾種細(xì)菌生長(zhǎng)、7 例BALF 樣本培養(yǎng)有復(fù)數(shù)菌生長(zhǎng)而SP 樣本培養(yǎng)僅其中幾種細(xì)菌生長(zhǎng)，以及3 例定性均為陽(yáng)性但菌種鑒定完全不一致的病例。經(jīng)查閱病史資料發(fā)現(xiàn)，該類(lèi)患者多患有風(fēng)濕病、重癥肺部感染或多臟器疾病。為達(dá)到有效抗炎目的，臨床上均可長(zhǎng)期采用激素類(lèi)藥物和廣譜抗菌藥物對(duì)其進(jìn)行治療，因此該類(lèi)患者的下呼吸道可能同時(shí)存在多種低豐度的病原菌，而由于2 種培養(yǎng)方法采樣時(shí)存在隨機(jī)選擇優(yōu)勢(shì)菌的可能，因此最終的菌種鑒定結(jié)果會(huì)有所不同。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)SP 樣本與BALF 樣本培養(yǎng)結(jié)果無(wú)顯著差異。雖然SP 樣本培養(yǎng)作為經(jīng)典的病原學(xué)檢驗(yàn)方法存在一定的優(yōu)勢(shì)，但經(jīng)纖維支氣管鏡獲取BALF 樣本行病原學(xué)檢測(cè)這一新方法不僅優(yōu)于SP 樣本培養(yǎng)，兼具有檢查和治療的功能，還被作為臨床上的金標(biāo)準(zhǔn)；同時(shí)，SP樣本培養(yǎng)結(jié)合臨床仍可作為肺部感染的參考標(biāo)準(zhǔn)之一，可在一定程度上減少由BALF 采樣帶來(lái)的創(chuàng)傷；而當(dāng)SP 樣本培養(yǎng)結(jié)果與臨床癥狀及影像學(xué)不相符，尤其是在高度懷疑侵襲性肺部真菌感染時(shí)，應(yīng)及時(shí)采取BALF 樣本檢查。因此，對(duì)于疑似肺部感染患者，不僅需根據(jù)其病情、臨床表征行血液檢測(cè)、影像學(xué)檢查等，還需結(jié)合SP 樣本培養(yǎng)行病原學(xué)檢查，以明確病原菌種類(lèi)，及時(shí)行病原菌藥敏試驗(yàn)，從而為臨床合理使用抗生素及精準(zhǔn)治療提供一定的 參考。

參·考·文·獻(xiàn)

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