Nupr1在乳腺癌細(xì)胞中的作用機(jī)制研究

王維娜 趙春蘭 梁月勉 張文清 王曄興

乳腺癌為女性最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重危害女性的健康。乳腺癌的發(fā)生發(fā)展涉及多個基因異常，目前其發(fā)病機(jī)制尚不明確，為了提高患者生存率，迫切需要尋找新的治療靶點(diǎn)。Nupr1/p8是1997年Mallo等[1]在研究急性胰腺炎的分子變化中發(fā)現(xiàn)的1個小分子核蛋白，研究表明Nupr1/p8參與了胰腺損傷、心肌肥大、性腺發(fā)育成熟、肝損傷、紅細(xì)胞分化及糖尿病腎病變、軟骨形成、皮膚衰老、體內(nèi)多部位腫瘤等多種病理生理過程，顯示了抗炎、細(xì)胞周期調(diào)控、自噬、細(xì)胞信號傳導(dǎo)、細(xì)胞生長因子及抗凋亡等作用[2-4]。人類P8基因定位于染色體16p11.2，編碼82個氨基酸組成的小分子核蛋白，相對分子量約8X103，故被命名為P8。后來Ree 等[5]在乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)分子機(jī)制研究中克隆到的轉(zhuǎn)移候選因子(candidate of metastasis 1,com-1)，經(jīng)結(jié)構(gòu)分析就是P8。隨后P8、com-1又被統(tǒng)一命名為Nupr1(nuclear protein 1)。隨后研究發(fā)現(xiàn)它在多種腫瘤中存在異常表達(dá)，主要通過控制細(xì)胞凋亡及參與細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，起到腫瘤生長啟動子的作用，參與腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展，然而在某些研究中卻發(fā)現(xiàn)了相反的作用[6]。國外一些學(xué)者研究了它在乳腺癌發(fā)生及進(jìn)展中的作用，但不同的研究結(jié)果不太一致，所有研究均發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中Nupr1較正常組織表達(dá)增高，然而具體到它的表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系，不同的研究得出的結(jié)論不盡相同[1-4]。關(guān)于Nupr1在體外腫瘤細(xì)胞中的作用機(jī)制目前國內(nèi)筆者尚未見到相關(guān)研究報道。本研究通過沉默乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的Nupr1基因，抑制Nupr1的表達(dá)。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，以MTT法檢測細(xì)胞增殖情況，克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞生長能力，Western blot法檢測實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞ki67和Survivin的表達(dá)，探討Nupr1基因在乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡中的作用，進(jìn)一步闡明Nupr1基因與乳腺癌發(fā)生、進(jìn)展、預(yù)后的關(guān)系，以期更好地指導(dǎo)臨床個體化治療。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231購自美國ATCC公司(ATCC,Manassas,VA)。RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清、青霉素、鏈霉素均購自美國Gibco公司。ki67和Survivin抗體購自Santa Cruz;Nupr1引物由上海生物工程有限公司合成，qRT-PCR試劑盒購自。Nupr1 siRNA重組慢病毒及siRNA control重組慢病毒委托上海比昂公司協(xié)助構(gòu)建(利用primer5軟件設(shè)計人Nupr1的RNA干擾序列(5’-CAT GCC TAT CAC TTC A)。 陰性對照RNAi使用一個與人類基因組無同源性的序列(5’-TTCC GAA CGT GTC ACG T)。將上述序列克隆到pGCSIL-綠色熒光蛋白(GFP)(Gene Chem，中國上海)構(gòu)建慢病毒載體。并測定慢病毒的滴度)。異硫氰酸熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)素Ⅴ/碘化丙啶(annexinⅤ-fluorescein isothiocyanate/ propidium iodide，annexinⅤ-FITC/PI)細(xì)胞凋亡檢測試劑購自凱基生物公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):細(xì)胞在含5%CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中(Thermo)，37℃條件下培養(yǎng)細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)液含10%胎牛血清、200 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，當(dāng)細(xì)胞處于對數(shù)生長期時，以含有EDTA的0.25%胰酶消化傳代。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染:乳腺癌細(xì)胞株貼壁生長至40%～50%時，接種至新的培養(yǎng)板中培養(yǎng)，孵育16 h，用適當(dāng)?shù)味鹊牟《旧锨逡?1.5 ml/孔)代替培養(yǎng)基，37℃孵育10 h后，用新鮮培養(yǎng)基代替病毒上清液繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染5 d后，用實(shí)時定量RT-PCR法測定短發(fā)夾RNA(shRNA)的敲除效率。Nupr1(211 bp)引物序列 ： 5′-GCG GGC ACG AGA GGA AAC-3′;5′-CTC AGT CAG CGG GAA TAA GTC-3′; GAPDH作為內(nèi)參標(biāo)，引物(121 bp)序列：5′-GGC GGC ACC ACC ATG TAC CCT-3′; 5′-AGG GGC CGG ACT CGT CAT ACT-3′。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μl，加入引物各0.5 μl、SYBR GREEN MAsterMix 10 μl置 iQTM SYBR Green Supermix上(Bio-Rad,Her-cules,CA)。PCR循環(huán)參數(shù)95℃ 30 s→60℃ 30 s→72℃ 30 s，共循環(huán)40個周期,72℃ 4 min 延伸。樣本均設(shè)3個平行對照以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。采用2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA相對表達(dá)量。 與空白對照組相比，Nupr1 RNAi下調(diào)99%，差異有顯著性，因此，Nupr1 RNAi可以有效地下調(diào)Nupr1的表達(dá)水平。將感染Nupr1 siRNA的乳腺癌細(xì)胞株作為實(shí)驗(yàn)組，感染Nupr1 siRNA control的細(xì)胞株作為陰性組，未做處理的乳腺癌細(xì)胞株作為空白對照組。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡:細(xì)胞經(jīng)慢病毒感染5 d后，制成細(xì)胞懸液，實(shí)驗(yàn)組和陰性組、對照組各設(shè)置3個復(fù)孔。離心并棄上清，收集細(xì)胞密度為1×105/ml 細(xì)胞懸液，PBS沖洗3次，70%預(yù)冷乙醇沉淀。離心棄去乙醇， PBS沖洗3次，加入RNA酶和溴化乙錠(PI)工作液(使PI最終濃度為50 μg/ml)，染色后流式細(xì)胞儀檢測，采用細(xì)胞周期分析軟件檢測實(shí)驗(yàn)組及陰性組細(xì)胞凋亡。

1.2.4 MTT法檢測細(xì)胞增殖能力:實(shí)驗(yàn)組和陰性組、空白對照組細(xì)胞以每孔5 000個細(xì)胞接種培養(yǎng)板，每組共15孔，培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h后每孔加入5 mg/ml MTT 40 μl,在37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，棄掉孔內(nèi)上清，每孔加入150 μl DMSO，震蕩20 min，全自動酶標(biāo)儀檢測570 nm波長處吸光度(OD)值。

1.2.5 集落形成試驗(yàn)分析Nupr1沉默對MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力的影響:將實(shí)驗(yàn)組和陰性組細(xì)胞，加裂解液和蛋白酶抑制劑，勻漿器勻漿，將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞按照700個/孔接種于6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，設(shè)置3個復(fù)孔，隔3 d換液觀察細(xì)胞狀態(tài)，培養(yǎng)7 d，細(xì)胞集落用PBS洗滌2次，用4%多聚甲醛(PFA)固定15 min，用Giemsa染色20 min，再用ddH2O沖洗2次，顯微鏡下觀察>50個細(xì)胞的克隆計數(shù)?？寺⌒纬陕?(集落數(shù)目/200)×100%。

1.2.6 Western blot 法檢測細(xì)胞中Ki67 及Survivin的表達(dá):取對數(shù)生長期的細(xì)胞，PBS洗滌3次，加入400 μl 含PMSF的裂解液，提取蛋白并進(jìn)行蛋白定量。取50 ng蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜，封閉，加鼠抗人Survivin抗體及Ki67抗體(1∶1 000)，GAPDH(小鼠，1∶1 000，ABCAM，ab8245)4℃過夜孵育，PBS洗滌后加入二抗1 h，DAB顯色。測定條帶的面積和灰度，計算積分灰度值。

2 結(jié)果

2.1 敲除Nupr1后對細(xì)胞凋亡的影響 由于活細(xì)胞對于染料 PI 具有抗性，而壞死細(xì)胞則無抗性，通過Annexin-FITC、PI 雙染色法來檢測 Nupr1 敲除后乳腺癌細(xì)胞凋亡是有效的?？瞻讓φ战M、陰性組、Nupr1敲除組凋亡率分別為(3．56± 0．76)%、(4．28±1．43)%、(20．98±5． 87)%?？瞻讓φ战M與陰性組比較，細(xì)胞凋亡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.77,P>0.05)，而實(shí)驗(yàn)組與對照組比較細(xì)胞凋亡率顯著升高(t=5.09,P<0.05)，說明敲低Nupr1水平后，MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡明顯增加；這些結(jié)果表明下調(diào)Nupr1，通過增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞凋亡，可能對乳腺癌細(xì)胞的體外生長有抑制作用。

2.2 敲除Nupr1對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響 慢病毒感染后，陰性組與空白對照組在24 h、48 h、72 h、96 h細(xì)胞增殖能力差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；敲除組細(xì)胞在24 h、48 h、72 h、96 h的OD值與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖力均低于空白對照組,說明Nupr1低表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖。見表1。

組別24h48h72h96h空白對照組0.38±0.040.52±0.030.87±0.081.07±0.08陰性組 0.37±0.020.51±0.040.85±0.071.05±0.13敲除組 0.21±0.030.30±0.020.37±0.030.41±0.02t值6.0710.4710.2014.04P值<0.001<0.001<0.001<0.001

2.3 敲除Nupr1對乳腺癌細(xì)胞的克隆形成的影響 陰性組細(xì)胞克隆形成情況與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.158,P>0.05)。敲除組細(xì)胞克隆形成率與對照組相比明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.62,P<0.05)。見表2。

組別克隆形成率空白對照組30.02±2.04陰性組 29.76±1.98敲除組 15.68±1.34t值9.62P值<0.05

2.4 細(xì)胞中Ki67及Survivin的表達(dá)情況 陰性組與空白對照組Ki67及Survivin表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.81、t=1.59;P>0.05)。敲除組Ki67及Survivin表達(dá)均低于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0005)。見表3，圖1、2。

組別SurvivinKi67空白對照組0.82±0.040.47±0.05陰性組 0.79±0.050.40±0.06敲除組 0.42±0.060.14±0.01t值9.759.64P值<0.05<0.05

圖1 Western blot檢測Survivin蛋白表達(dá)

3 討論

乳腺癌為女性最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅女性的健康與生命。近年來，乳腺癌患者的生存率得到很大提高，然而復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移仍然是影響患者生存率的主要問題，因此對乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡調(diào)控機(jī)制的研究彰顯重要。P8是一個相對分子量約8×103的小分子核蛋白，由Nupr1基因編碼。它為廣泛分布于體內(nèi)的應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白，參與了體內(nèi)多部位多種病理生理過程，顯示了抗炎、細(xì)胞周期調(diào)控、自噬、細(xì)胞信號傳導(dǎo)、細(xì)胞生長因子及抗凋亡等作用。Ree等[5]研究發(fā)現(xiàn)p8與乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)，命名為乳腺癌轉(zhuǎn)移候選因子(candidate of metastasis 1,com-1)。隨后Jung等[7]用比較基因組雜交技術(shù)研究了具中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移潛能的早期乳腺癌細(xì)胞系中基因組不穩(wěn)定的發(fā)生情況，發(fā)現(xiàn)染色體16p11.2及17q12循環(huán)區(qū)改變與腫瘤預(yù)后不良有關(guān)，二者共同陽性的腫瘤預(yù)后更差，推測基因拷貝數(shù)的異常改變參與了腫瘤的轉(zhuǎn)移，他的研究進(jìn)一步從基因水平證實(shí)Nupr1與乳腺癌預(yù)后不良的相關(guān)性。Jiang等[8]卻發(fā)現(xiàn)乳腺癌中預(yù)后較差的及淋巴結(jié)陽性的腫瘤Nupr1表達(dá)降低，他們認(rèn)為Nupr1在乳腺癌細(xì)胞中的作用與在膀胱癌、前列腺癌中的作用類似，可能起著腫瘤抑制基因的作用，其中Nupr1可能受雌激素和泛素通路雙重調(diào)節(jié)。而Ito等[9]發(fā)現(xiàn)Nupr1的表達(dá)與乳腺癌細(xì)胞凋亡指數(shù)、腫瘤大小及UICC分期均呈負(fù)相關(guān)。在乳腺浸潤性癌中Nupr1的高表達(dá)率與腫瘤分期有關(guān)，腫瘤的分期越晚，Nupr1高表達(dá)率越高，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。且預(yù)后相對不良的HER-2型和三陰性型，Nupr1的表達(dá)顯著高于預(yù)后較好的Luminal型，推測在乳腺癌的晚期進(jìn)展中，Nupr1可能起了重要作用，且它的高表達(dá)與乳腺癌的預(yù)后不良有關(guān)[10]。這種截然不同的作用也許是基于不同種腫瘤的微環(huán)境不同。

圖2 Western blot檢測Ki67蛋白表達(dá)

關(guān)于Nupr1在體外腫瘤細(xì)胞中的作用機(jī)制，最近研究較多。RNAi是基因功能分析的有用工具，可能是治療包括癌癥在內(nèi)的各種疾病的一種潛在治療策略。因此，慢病毒與RNAI的結(jié)合為腫瘤基因治療提供了一種新的治療思路。評估有效抑制乳腺癌細(xì)胞生長的靶點(diǎn)可以促進(jìn)基因沉默的臨床應(yīng)用。要想成功抑制細(xì)胞Nupr1的表，構(gòu)建沉默Nupr1表達(dá)的載體非常關(guān)鍵。我們首先確保Nupr1 RNAi可以有效地下調(diào)Nupr1的表達(dá)水平，這是實(shí)驗(yàn)成功的首要步驟。Zeng等[11]通過敲低Nupr1 基因研究Nupr1 基因下調(diào)對人多發(fā)性骨髓瘤 U266 細(xì)胞增殖及凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲低Nupr1 水平后，U266細(xì)胞增殖減弱，凋亡率明顯增加。認(rèn)為Nupr1基因在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的增殖及凋亡中起重要作用。鄧躍林等[12]用腫瘤抑制劑鹽酸素處理非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞Nupr1 蛋白表達(dá)量下降，Nupr1基因沉默后通過上調(diào) TIMP-1 的表達(dá)，下調(diào) MMP-2 的表達(dá)降低肺癌 A549 細(xì)胞的侵襲和遷移能力，進(jìn)而促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡。在肝癌及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤及其他腫瘤中的研究也得到了相似的結(jié)果[13,14]。抑制Nupr1的表達(dá)可降低肝癌細(xì)胞集落形成能力，抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的細(xì)胞增殖。這些結(jié)果均在體外細(xì)胞中直接證實(shí)了Nupr1對腫瘤細(xì)胞的作用，而Nupr1是否和如何影響乳腺癌癌細(xì)胞的存活尚不清楚。本研究結(jié)果同樣首次證實(shí)在乳腺癌細(xì)胞中，細(xì)胞轉(zhuǎn)染抑制Nupr1基因表達(dá)后，乳腺癌細(xì)胞增殖活性降低，凋亡明顯增加，這與其他學(xué)者在不同腫瘤細(xì)胞的研究結(jié)果相似，推測Nupr1可能通過影響細(xì)胞增殖和凋亡過程促進(jìn)腫瘤形成，從而為更好的了解乳腺癌發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。

Ki67為一種細(xì)胞核抗原，在增殖活性細(xì)胞中表達(dá)。它的表達(dá)水平能夠反映細(xì)胞的增殖能力，且與腫瘤的惡性生物學(xué)行為相關(guān)。Survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成員，與腫瘤細(xì)胞的分化增殖及浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。細(xì)胞信號系統(tǒng)是細(xì)胞生長、分化、凋亡及物質(zhì)代謝的調(diào)控系統(tǒng)，任何一個環(huán)節(jié)發(fā)生異常均會導(dǎo)致疾病的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示敲除Nupr1基因后乳腺癌細(xì)胞Ki67及Survivin表達(dá)水平下降，推測Nupr1在乳腺癌細(xì)胞中作用機(jī)制可能是通過降低Survivin表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性，發(fā)揮抗腫瘤作用。

本研究結(jié)果顯示，沉默Nupr1基因后，乳腺癌細(xì)胞增殖能力降低，細(xì)胞克隆形成數(shù)降低，提示Nupr1在乳腺癌細(xì)胞增殖中起促進(jìn)作用。

綜上所述，乳腺癌細(xì)胞中抑制Nupr1的表達(dá)可以降低細(xì)胞增殖能力，檢測組織中Nupr1的表達(dá)、探討其與細(xì)胞內(nèi)信號機(jī)制的關(guān)系可從嶄新的角度明確乳腺癌發(fā)生的機(jī)制，檢測Nupr1的表達(dá)水平可能作為乳腺癌早期發(fā)現(xiàn)、判斷預(yù)后及采用個體化治療方案的有用指標(biāo)。