A型肉毒毒素對增生性瘢痕組織aFGF和bFGF因子mRNA表達(dá)的作用

武鳳蓮 朱東來 王嘉欣 王連英

傷口愈合的過程本身就是一個(gè)動(dòng)態(tài)的、錯(cuò)綜復(fù)雜的，同時(shí)受很多因素影響，其過程主要包括三個(gè)階段:炎性反應(yīng)階段、肉芽組織形成階段和基質(zhì)形成或重構(gòu)階段[1]。當(dāng)傷口愈合階段發(fā)生任何變化時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致個(gè)體產(chǎn)生病理性瘢痕[2]。這些病理性瘢痕包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩[3]。增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的傳統(tǒng)治療包括按摩壓迫治療、硅膠治療、激光治療、光療和放療[4]。幾種新興的治療方案包括腔內(nèi)冷凍治療，腔內(nèi)注射5-氟尿嘧啶(5-Fu)、干擾素和博萊霉素[5]。盡管治療增生性瘢痕有很多方法，但每種方法都有局限性。已有研究報(bào)道了A型肉毒毒素(BTXA)在治療增生性瘢痕中的應(yīng)用，并取得了良好效果[6,7]。 BTXA減輕早期增生性瘢痕瘙癢癥狀，部分抑制瘢痕萎縮，促進(jìn)瘢痕軟化，減少攣縮作用，也有研究觀察到抑制成纖維細(xì)胞增殖和膠原分泌，但其分子機(jī)制尚不清楚[6,8]。為研究BTXA對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的影響，探討B(tài)TXA對增生性瘢痕調(diào)節(jié)的分子機(jī)制，采用MTT法、羅丹明123染色、H2DCFDA熒光檢測瘢痕成纖維細(xì)胞內(nèi)的活性氧ROS,qPCR等方法研究不同濃度BTXA對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的影響。我們特別確定了BTXA對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞生長因子aFGF和bFGF的影響，這些是影響增生性瘢痕組織中細(xì)胞異常增生和分化，膠原等細(xì)胞外基質(zhì)過度分泌沉積的重要影響因素[9]。本研究為肉毒毒素的臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 瘢痕組織標(biāo)本 標(biāo)本來源于2016至2018年我院整形燒傷外科的門診及住院患者，患者近期激光、放射線及其他藥物治療，病程3個(gè)月～4年。瘢痕部位包括面部、上肢、胸背部，取標(biāo)本前均得到患者的知情同意。

1.2 化學(xué)藥品與儀器 BTXA(蘭州生物制品研究所)， DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司 USA)，Trizol 總RNA提取試劑盒美國 PROMEGA公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、taq酶購于日本TAKARA；染色羅丹明123、MTT、DMSO購于SIGMA US,H2DCFDA購自 Invitrogen， 新生小牛血清(杭州四季青公司)，熒光顯微鏡，流式細(xì)胞儀，PCR 儀器。

1.3 增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的培養(yǎng) 將取下的手術(shù)標(biāo)本按無菌操作程序反復(fù)沖洗3次后，剪去多余皮下組織后，將只保留帶表皮的瘢痕組織剪成所需大小的小組織塊，緩沖液反復(fù)沖洗干凈后接種于含有培養(yǎng)液的培養(yǎng)方瓶中，在特定條件的孵箱進(jìn)行瘢痕成纖維細(xì)胞原代的培養(yǎng)，根據(jù)原代成纖維細(xì)胞的生長情況進(jìn)行更換培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，待原代成纖維細(xì)胞爬滿瓶底進(jìn)行傳代培養(yǎng)，細(xì)胞藥物實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞為3～6代。

1.4 MTT檢測瘢痕成纖維細(xì)胞的活力 取對數(shù)生長期的瘢痕成纖維細(xì)胞,用胰酶消化后的調(diào)制成為1×106/ml成纖維細(xì)胞懸浮液，以每孔200 μl的成纖維細(xì)胞密度接種于96孔培養(yǎng)板中。置于5% CO2，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)約24 h至細(xì)胞長至單層。待細(xì)胞完全貼壁后去除培養(yǎng)液，用PBS洗1～2遍，加入用含血清的培養(yǎng)基稀釋得到各組BTXA濃度的藥液。每個(gè)藥物濃度組(0.2、0.4、0.6、1.6 U/ml)及對照組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，每孔加 150 μl藥液,將細(xì)胞板繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中孵育24 h,棄上清，用PBS緩沖液溶液洗2遍，后每孔加MTT(5 mg/ml)20 μl繼續(xù)孵育3 h后，棄掉上清液，每孔加200 μl DMSO振蕩混勻，沉淀溶解完全后用自動(dòng)酶標(biāo)比色儀在波長 490 nm 處讀取吸光值(A490)時(shí)測定其OD值。計(jì)算藥物的抑制率 (IR)。IR=(1-試驗(yàn)組OD值/對照組OD值)×100%。

1.5 羅丹明123染色 用羅丹明123染色技術(shù)評估BTXA對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞線粒體膜通透性的影響。將成纖維細(xì)胞制成1×106懸浮液接種于96孔培養(yǎng)板中，用濃度為0.4 U/ml、0.8 U/ml BTXA處理組細(xì)胞進(jìn)行24 h培養(yǎng)，并與對照組細(xì)胞進(jìn)行比較。培養(yǎng)24 h后，PBS沖洗細(xì)胞，每孔加入羅丹明123染液(10 μg/ml)10 μl,置于37.0℃、5%(體積分?jǐn)?shù))的CO2飽和溫度的孵箱中繼續(xù)孵育15 min。然后熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞，用Image軟件進(jìn)行評價(jià)。

1.6 H2DCFDA檢測瘢痕成纖維細(xì)胞內(nèi)的活性氧(ROS) 利用熒光探針H2DCFDA 檢測對照組及用濃度為0.4 U/ml、0.8 U/ml BTXA處理組細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生情況。將增生性瘢痕成纖維細(xì)胞制成1×106懸浮液接種于96孔培養(yǎng)板中，用濃度為0.4 U/ml、0.8 U/ml BTXA處理組細(xì)胞進(jìn)行24 h培養(yǎng)，并與對照組細(xì)胞進(jìn)行比較。細(xì)胞孵育培養(yǎng)24 h后，棄細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)細(xì)胞上清液，細(xì)胞板內(nèi)用 PBS 清洗細(xì)胞后棄 PBS。然后每孔內(nèi)分別加入H2DCFDA工作液(終濃度為 10 μmol/L)置 37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光染色 15 min。經(jīng)胰酶快速消化及 PBS 終止洗滌，1 500 r/min 離心 5 min 后，最后加入 200 μl PBS 重懸，后在激發(fā)波長488 nm,發(fā)射波長525 nm條件下在流式細(xì)胞儀檢測各樣本平均熒光強(qiáng)度，該值代表細(xì)胞ROS水平。

1.7 RNA提取與qPCR 總RNA是從增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中分離出來，將含有不同濃度BXTA及對照組的培養(yǎng)液加入對數(shù)生長的密度為1×106個(gè)/ml的成纖維細(xì)胞混懸液中，將細(xì)胞放置于孵育箱中培養(yǎng)24 h，棄上清液收集細(xì)胞。按總RNA抽提試劑盒說明書，操作步驟按試劑盒的操作指南進(jìn)行。采用 Trizol 法提取總 RNA，經(jīng)NanoDrop ND-2000 紫外分光光度儀檢測完整性后于-80℃保存?zhèn)溆谩λ袠悠啡? μg總RNA，利用Promega公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作步驟進(jìn)行合成 cDNA。1 μl cDNA與1 μl 引物混合，于15 μl反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增。將各組樣本擴(kuò)增后的10 μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，用凝膠掃描成像分析儀處理系統(tǒng)掃描各條帶紫外光吸收量(Vol)。以為β-actin內(nèi)參，檢測各組bFGF和aFGF基因的Vol與內(nèi)參β-actin的Vol的比值作為目標(biāo)基因的相對表達(dá)量，并比較對照組與加入不同濃度肉毒毒素作用后增生性瘢痕成纖維細(xì)胞bFGF和aFGF基因的表達(dá)的變化。引物序列如下：bFGF(303 bp):上游引物5’-AGCGGCTGTACTGCAAAAAC-3’，下游引物5’-CAGTTCGTTTCAGTGCCACA-3’,aFGF(430 bp):上游引物5’-GGAATTCCATATGGCTAATTACAAGCCCA-3’,下游引物5’-AAGAGATCTTTAATCAGAAGAGACTGGCAGG-3’,β-actin(166 bp):上游引物5’-TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3’，下游引物5’-CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAGGG-3’。

2 結(jié)果

2.1 MTT檢測結(jié)果 采用MTT法測定不同濃度BTXA對成纖維細(xì)胞的抑制作用。與對照組(1.020±0.031)比較，0.2、0.4、0.8、1.6 U/ml BTXA(5.62±0.0121,15.01±0.023,32.25±0.124,51.21±0.214,72.47±0.061)處理的細(xì)胞中存活的成纖維細(xì)胞數(shù)量顯著減少，且呈劑量依賴性(P<0.01)。

2.2 羅丹明123染色結(jié)果 細(xì)胞凋亡的初始事件是線粒體膜電位的降低和細(xì)胞色素C的釋放，而線粒體膜電勢的變化通常反映線粒體膜穩(wěn)定性的狀態(tài)，一旦線粒體膜穩(wěn)定性變差，即線粒體膜通透性增高致使趨向發(fā)生凋亡，因此，本實(shí)驗(yàn)采用羅丹明123染色評估跨膜線粒體膜通透性的變化。相近細(xì)胞數(shù)目情況下，與對照組成纖維細(xì)胞比較,0.4 U/ml與0.8 U/ml A型肉毒毒素處理組的細(xì)胞綠色熒光降低，線粒體膜電位降低(P<0.01)，線粒體膜通透性發(fā)生變化。提示BTXA對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞有抑制增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。見圖1。

對照組0.4U/ml0.8U/ml

圖1肉毒毒素對瘢痕成纖維細(xì)胞膜電位的影響

2.3 細(xì)胞內(nèi) ROS 改變 H2DCFDA作為一種活細(xì)胞染料，它在進(jìn)入活細(xì)胞膜內(nèi)能夠被細(xì) 胞內(nèi)酯酶作用并轉(zhuǎn)化生成為H2DCF，而后者對細(xì)胞內(nèi)各類ROS 敏感且極容易被其氧化并生成 2’，7’-dichloroflurorescein 產(chǎn)物(DFC)。而氧化后產(chǎn)物具有強(qiáng)熒光特性，通常結(jié)合熒光顯微鏡或流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平，根據(jù)平均熒光強(qiáng)度變化來表示細(xì)胞內(nèi)ROS水平。由此，我們選擇H2DCFDA 并結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測,選擇濃度為0.4 U/ml、0.8 U/ml的A型肉毒毒素預(yù)處理對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響。肉毒毒素處理組(0.4 U/ml時(shí)174.28%，0.8 U/ml時(shí)247.36%)與對照組100%比較，細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高(P<0.01)，并且高濃組顯著高于低濃度組(P<0.05)。見表1，圖2。

組別aFGFbFGF對照組 110.2U/mlBXTA組0.890±0.211?0.900±0.012?0.4U/mlBXTA組0.790±0.051?0.750±0.036?0.8U/mlBXTA組0.615±0.027?0.520±0.024?1.6U/mlBXTA組0.402±0.012?#0.491±0.142?#

注：與對照組比較,*P<0.05;與0.2 U/ml BXTA比較,#P<0.01

2.4 qPCR結(jié)果 與對照組比較，對用濃度分別為0.2 U/ml、 0.4 U/ml 、0.8 U/ml、1.6 U/ml的A型肉毒毒素的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中的bFGF和aFGF蛋白的表達(dá)量呈明顯下降趨勢,說明A型肉毒毒素可抑制bFGF和aFGF兩種因子的表達(dá),并且隨著A型肉毒毒素濃度的增加，bFGF和aFGF兩種因子蛋白表達(dá)呈劑量依賴趨勢，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1，圖3。

圖2 肉毒毒素對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞內(nèi)活性氧的影響

圖3 不同濃度BTXA(U/ml)對aFGF及bFGF mRNA表達(dá)的影響

3 討論

成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)于20世紀(jì)40年代首次被發(fā)現(xiàn)，并于1974年人們從牛垂體中分離出來[10,11]。FGF家族的所有成員都有一定的相似之處，但都有其獨(dú)特的特征。FGF家族包括這些酸性和堿性亞型，表現(xiàn)出廣泛的生物活性。人aFGF和bFGF蛋白均由154個(gè)氨基酸組成，受體相同，序列同源性超過55%[12,13]。酸性FGF(aFGF)作為細(xì)胞分裂的促進(jìn)因子，是細(xì)胞增殖和分化的有效促進(jìn)因子[14]。堿性FGF(bFGF)主要作用于中胚層和神經(jīng)外胚層來源的細(xì)胞，也是一種功能強(qiáng)大的細(xì)胞分裂因子。在大多數(shù)生物活性分析中，bFGF表現(xiàn)出比aFGF更強(qiáng)的效力[15,16]。在生理?xiàng)l件下，酸性FGF以陰離子形式存在，堿性FGF以陽離子形式存在，兩種生長因子都沒有信號(hào)肽結(jié)構(gòu)，分泌方式尚不明確。aFGF和 bFGF作為重要的細(xì)胞分裂因子，能夠直接作用血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞，從而促進(jìn)新的毛細(xì)血管生成[17]。酸性FGF能夠主動(dòng)與創(chuàng)面邊緣細(xì)胞的細(xì)胞膜上的受體特異性結(jié)合，誘導(dǎo)細(xì)胞分裂、增殖和遷移，促進(jìn)皮膚和黏膜創(chuàng)面愈合。堿性FGF能夠促進(jìn)肉芽組織過度生長的同時(shí)，還可以誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)的合成，刺激結(jié)締組織增生，從而加速創(chuàng)面的愈合[18]。

BTX是一種神經(jīng)毒性蛋白，由肉毒桿菌及相關(guān)物種產(chǎn)生。它存在于各種血清型(A至G)。A型肉毒毒素(BTXA)可用于臨床及各種疾病的治療[19,20]。 近年來，在瘢痕的臨床治療中，BTXA被越來越多的人重視并開始應(yīng)用，并取得了良好的臨床治療效果[21-23]。雖然BTXA廣泛用于病理性瘢痕的治療，但其分子機(jī)制尚不清楚。BTXA最初應(yīng)用于瘢痕的預(yù)防和治療，是因?yàn)樗梢越档颓锌趶埩?。我們都知道決定瘢痕最終外觀的重要關(guān)鍵因素是在愈合過程中作用于傷口邊緣的張力[24]。傷口邊緣的張力可以直接(機(jī)械地)和間接(化學(xué)地)導(dǎo)致病理性瘢痕的生成。垂直于傷口邊緣的張力往往會(huì)機(jī)械地拉伸傷口肌肉，從而扭曲正常的傷口愈合過程，從而導(dǎo)致增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的形成[25]。當(dāng)局部注入BTXA時(shí)，BTXA通過抑制神經(jīng)肌肉連接部位乙酰膽堿的釋放而起作用 ，會(huì)導(dǎo)致傷口肌肉暫時(shí)麻痹而固定，從而降低垂直張力。BTXA可以在傷口愈合過程中幾乎完全消除傷口上的動(dòng)態(tài)張力，從而改善傷口瘢痕愈合[26]。也有研究發(fā)現(xiàn)BTXA能有效抑制成纖維細(xì)胞的生長[21]。BTXA對增生性瘢痕和瘢痕疙瘩作用機(jī)制的另一理論就是其對成纖維細(xì)胞周期分布的影響。成纖維細(xì)胞過度增殖是導(dǎo)致增生性瘢痕重要的因素之一[27]。BTXA可能通過改變病理性瘢痕上的凋亡、遷移和纖維化通路，直接調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的活性，從而改善其外觀[27]。

本研究中，我們觀察了不同濃度的BTXA對增生性瘢痕中成纖維細(xì)胞的影響。不同的細(xì)胞毒性信號(hào)，如活性氧，生長剝奪和死亡受體誘導(dǎo)細(xì)胞中的凋亡信號(hào)。對照組細(xì)胞和肉毒毒素處理組細(xì)胞的H2DCFDA染色結(jié)果清楚地描繪出A型肉毒毒素增加了活性氧(ROS)的產(chǎn)生。羅丹明123染色結(jié)果表明，A型肉毒毒素誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生并導(dǎo)致凋亡蛋白的活化，從而增加了增生性瘢痕成纖維細(xì)胞線粒體膜通透性。線粒體膜通透性的增加導(dǎo)致細(xì)胞色素C等促凋亡蛋白的釋放，從而激活凋亡蛋白進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[28]。本研究中我們還研究了不同濃度的A型肉毒毒素作用的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中aFGF和bFGF蛋白表達(dá)的變化，肉毒毒素處理組細(xì)胞與對照組細(xì)胞比較，aFGF和bFGF蛋白表達(dá)降低。本結(jié)果提示：BTXA對增生性瘢痕組織中成纖維細(xì)胞的生長有抑制并誘導(dǎo)其凋亡的作用，且具有濃度依賴性，與對照組比較aFGF和bFGF蛋白的表達(dá)隨著BTXA濃度的增加而降低。結(jié)果提示BTXA對增生性瘢痕組織成纖維細(xì)胞增殖方面具有明顯的抑制作用，其作用機(jī)制可能是通過降低aFGF和bFGF蛋白的表達(dá)，從而導(dǎo)致增生性瘢痕內(nèi)成纖維細(xì)胞增殖的減緩，凋亡的增加，細(xì)胞外基質(zhì)合成分泌降低。其具體的分子機(jī)制、aFGF和bFGF與細(xì)胞凋亡的具體作用及細(xì)胞周期及信號(hào)通路的具體調(diào)控將是我們進(jìn)一步深入研究探討的方向。