QuEChERS結(jié)合超高效液相色譜質(zhì)譜法測定禽蛋及其制品中42種農(nóng)藥及其代謝物

呂青骎，王瑋，梁麗姣，滕爽，徐幸蓮*

1(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，江蘇 南京，210095)2(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 國家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部肉及肉制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心(南京)，江蘇 南京，210095)3(南京財(cái)經(jīng)大學(xué) 食品科技與工程學(xué)院，江蘇 南京，210095)

農(nóng)藥的廣泛使用在提高農(nóng)作物產(chǎn)量的同時(shí)也造成了農(nóng)藥殘留，影響農(nóng)產(chǎn)品和食品安全。常見農(nóng)藥種類主要有有機(jī)鹵素農(nóng)藥、有機(jī)磷農(nóng)藥、氨基甲酸酯類農(nóng)藥、擬除蟲菊酯農(nóng)藥、有機(jī)氮農(nóng)藥等[1-2]。在禽類飼養(yǎng)過程中，有些不易降解的農(nóng)藥會通過食物鏈富集并傳遞至禽類體內(nèi)[3]，造成禽蛋中農(nóng)藥殘留。另外,噴灑農(nóng)藥防止病害，環(huán)境污染等都會導(dǎo)致禽蛋中殘留農(nóng)藥[4-5]。世界各國和國際組織制定了嚴(yán)格的禽蛋中農(nóng)藥最大允許殘留限量[6]，如歐盟為411種，日本為236種，美國為90種，而我國僅為9種，且限量值較高[7]。我國是禽蛋生產(chǎn)和消費(fèi)大國，禽蛋質(zhì)量安全關(guān)系到消費(fèi)者身體健康和國家經(jīng)濟(jì)利益[8]。因此建立簡便快捷，靈敏準(zhǔn)確的禽蛋中農(nóng)殘檢測方法很有必要。

現(xiàn)行農(nóng)藥測定標(biāo)準(zhǔn)大都針對蔬菜水果飼料等[9-10]，不能直接應(yīng)用于禽蛋及制品的檢測。動物性食品中農(nóng)藥殘留樣品前處理方法主要有固相萃取法[11]、凝膠滲透色譜法[12]、加速溶劑萃取法[13]、QuEChERS法[14]等。其中，固相萃取法、凝膠滲透色譜法、加速溶劑萃取法均可準(zhǔn)確分離出農(nóng)藥殘留成分，但操作步驟繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且試劑消耗量大，不利于環(huán)保[15]；QuEChERS法不僅可準(zhǔn)確分離出農(nóng)藥殘留成分，還具有操作簡便、檢測成本低、環(huán)境友好、檢測高效等優(yōu)勢[16]，因此，選取QuEChERS法作為本試驗(yàn)樣品的前處理方法。農(nóng)藥殘留檢測方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)[17]、氣相色譜法(gas chromatography, GC)[18]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)[19]、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)[20]等。其中，ELISA主要用于大規(guī)模樣品的初步篩查[21]；GC與GC-MS常用于易揮發(fā)、分子量較小且熱穩(wěn)定性好的樣品，檢測農(nóng)藥殘留的種類有限[22]；HPLC易受到復(fù)雜基質(zhì)的干擾且效率較低[23]；而超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, UPLC-MS/MS)可實(shí)現(xiàn)多種物質(zhì)同時(shí)檢測與分析，檢測速度快、靈敏度高[24]。本試驗(yàn)采用QuEChERS方法對禽蛋及其制品進(jìn)行前處理，建立了可同時(shí)檢測42種農(nóng)藥及其代謝物的UPLC-MS/MS方法，旨在為我國禽蛋及其制品中農(nóng)藥殘留的高通量快速檢測以及食品安全提供科學(xué)支持和技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試材料為禽蛋及制品，包括雞蛋、鴨蛋、鵝蛋、蛋粉，購自南京農(nóng)貿(mào)市場和超市等。

標(biāo)準(zhǔn)品：啶蟲脒(acetamiprid)、阿維菌素(avermectin B1a)、氯蟲苯甲酰胺(chlorantraniliprole)、毒死蜱(chlorpyrifos)、苯醚甲環(huán)唑(difenoconazole)、烯酰嗎啉(dimethomorph)、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽(emamectin benzoate)、甲氰菊酯(fenpropathrin)、氟蟲腈(fipronil)、氟甲腈(fipronil-desulfinyl)、氟蟲腈硫醚(亞砜)(fipronil-sulfide)、氟蟲腈砜(fipronil-sulfone)、吡蟲啉(imidacloprid)、辛硫磷(phoxim)、噠螨靈(pyridaben)、嘧霉胺(pyrimethanil)、胺菊酯(tetramethrin)、三環(huán)唑(tricyclazole)、抑霉唑(imazalil)、三唑酮(triadimefon)、戊唑醇(tebuconazol)、克百威(carbofuran)、3-羥基克百威(3-hydroxy-carbofuran)、多菌靈(carbendazim)、滅幼脲(chlorbenzuron)、氟啶脲(chlorfluazuron)、二嗪磷(diazinon)、敵敵畏(dichlorvos)、乙霉威(diethofencarb)、除蟲脲(diflubenzuron)、樂果(dimethoate)、水胺硫磷(isocarbophos)、馬拉硫磷(malathion)、滅多威(methomyl)、咪鮮胺(prochloraz)、丙溴磷(profenofos)、氟胺氰菊酯(tau-fluvalinate)、噻蟲嗪(thiamethoxam)、三唑磷(triazophos)、甲基對硫磷(parathion-methyl)、噻嗪酮(buprofezin)、甲萘威(carbaryl)，德國Dr. Ehrenstorfer公司，純度均≥95.0%。

試劑：乙腈、甲醇、乙酸乙酯,均為色譜純，美國Fisher公司；甲酸、乙酸、二氯甲烷、NaCl、MgSO4、Na2SO4，HCOONH4,均為分析純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；QuEChERS多功能針式過濾膜，天津阿爾塔科技有限公司；試驗(yàn)中用水均為一級水。

1.2 儀器與設(shè)備

Vanquish & TSQ Quantis超高效液相色譜質(zhì)譜儀，美國Thermo Fisher Scientific公司；advance EDI純水儀、CPA224S電子天平、D-16C高速離心機(jī)，德國Sartorious 公司；X025-12DTD超聲波清洗機(jī)，南京先歐儀器制造有限公司；Vortex Genius漩渦混勻器，德國IKA公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的前處理

提取：準(zhǔn)確稱取5.00 g均質(zhì)好的樣品，置于50 mL離心管中，加入5 mL一級水，10 mL體積分?jǐn)?shù)為1%的乙酸乙腈，渦旋1 min，40 kHz超聲提取10 min。再加入3 g NaCl，渦旋混合1 min，10 000 r/min離心10 min。

凈化：用一次性注射器取1 mL上清液(再吸入1 mL空氣)，勻速通過QuEChERS多功能針式過濾膜至進(jìn)樣瓶中，進(jìn)行UPLC-MS/MS分析。

除不稱取試樣，按上述前處理步驟完成試劑空白實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取100.0 mg 42種農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)品，乙腈稀釋，定容到100.00 mL容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

分別移取100 μL 42種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲備液用乙腈稀釋，定容到100.00 mL容量瓶中，配制成1.00 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

移取一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用空白樣品提取液配制成不同質(zhì)量濃度的基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用于建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，濃度梯度為0.5、1.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 μg/L。基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.3 UPLC-MS/MS方法的建立

1.3.3.1 液相色譜條件

色譜柱：Thermo Accucore aQ C18(2.1 mm×150 mm, 2.6 μm)；流動相A：體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸水溶液，流動相B：5 mmol/L甲酸銨甲醇溶液；梯度洗脫條件：0～1.00 min，90%A保持不變；1.00～5.00 min，90% A線性變化10%；5.00～9.00 min，10%A保持不變，9.00～9.01 min，10%A變化至90%；9.01～11.00 min，90%A保持不變；流速0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源(electrospary ionization, ESI)；掃描方式：正反離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測；正離子噴霧電壓：3 500 V；負(fù)離子噴霧電壓：2 500 V；鞘氣流速：40 Arb；輔助氣流速：10 Arb；離子傳輸管溫度：300 ℃；霧化溫度：200 ℃。

1.3.4 線性范圍的確定

基于已建立的UPLC-MS/MS方法，將配制好的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液上機(jī)測定，線性范圍為0.5～100 μg/L，最低點(diǎn)設(shè)定為出峰良好的最低濃度，共設(shè)定6個(gè)濃度點(diǎn)。以定量離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，對應(yīng)溶液濃度(μg/L)為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求回歸方程，計(jì)算平方相關(guān)系數(shù)(square of correlation coefficient,R2)。

1.3.5 準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)

在陰性雞蛋液中分別添加3個(gè)水平農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加量為5、10、50 μg/kg，依照1.3.1進(jìn)行提取和凈化，上機(jī)進(jìn)行添加回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)添加濃度平行測定6個(gè)樣品，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviations, RSD)，得到精密度。

1.3.6 方法的實(shí)際應(yīng)用

選用市售禽蛋及其制品23份，其中雞蛋8份，鴨蛋5份，鵝蛋3份，蛋粉7份。其樣品前處理和檢測方法參照1.3.1和1.3.3，以此來評價(jià)該方法的實(shí)際應(yīng)用效果。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Thermo Scientific XCalibur工作站軟件(版本號：4.1.31.9)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法的優(yōu)化

2.1.1 提取試劑的優(yōu)化

根據(jù)分析物在不同溶劑中的溶解性，分別采用乙腈、乙酸乙酯、正己烷、石油醚、二氯甲烷作為提取溶劑進(jìn)行前處理，向陰性雞蛋液中添加10 μg/kg的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)液，參照1.3.1進(jìn)行前處理。

表1 提取溶劑對42種農(nóng)藥回收率的影響

結(jié)果表明：使用5種提取溶劑提取42種農(nóng)藥，回收率在70%～120%范圍內(nèi)個(gè)數(shù)分別為42、30、13、13、34種。有機(jī)磷類農(nóng)藥、氨基甲酸酯類農(nóng)藥極性偏強(qiáng)，使用正己烷、石油醚等非極性溶劑提取效果較差；二氯甲烷提取后為乳狀物，難以分離；乙腈總體回收率高于乙酸乙酯，為最優(yōu)選擇。

部分農(nóng)藥屬于兩性化合物，提取溶劑的pH影響提取效果，因此在乙腈中添加乙酸以改善回收率。分別使用體積分?jǐn)?shù)0.5%、1%、3%、5%的乙酸乙腈進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，乙酸添加量為體積分?jǐn)?shù)1%時(shí)，目標(biāo)農(nóng)藥回收率均在70%～120%范圍內(nèi)(表2)，且與乙腈相比回收率更好。例如使用乙腈時(shí)，氯蟲苯甲酰胺和甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽回收率為118%和74%，而使用1%乙酸乙腈時(shí)，回收率分別為98%和94%。因此選用1%乙酸乙腈作為本試驗(yàn)提取溶劑。

表2 乙酸含量對42種農(nóng)藥回收率的影響

2.1.2 除水劑的優(yōu)化

試樣中添加無機(jī)鹽可除水同時(shí)促進(jìn)電離，分離有機(jī)相與水相，防止乳化，常見的除水劑有NaCl、Na2SO4、MgSO4等。向陰性雞蛋液中添加10 μg/kg的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)液，參照1.3.1設(shè)置7組不同劑量無機(jī)鹽作為除水劑進(jìn)行對照試驗(yàn)。結(jié)果表明，增加NaCl用量至3 g時(shí)，目標(biāo)農(nóng)藥回收率均在70%～120%范圍內(nèi)，繼續(xù)增加NaCl用量回收效果無明顯變化(表3)。

表3 除水方法對42種農(nóng)藥回收率的影響

使用MgSO4與Na2SO4時(shí)，回收率在70%～120%范圍內(nèi)的目標(biāo)農(nóng)藥數(shù)量均為39種，因此選擇NaCl作為除水劑，添加量為3 g。

2.1.3 凈化方法的選擇

向陰性雞蛋液中添加10 μg/kg的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)液，比較固相萃取法與QuEChERS法凈化效果。固相萃取法選用Oasis PRiME HLB(6 cc, 200 mg)小柱，凈化后回收率在70%～120%范圍內(nèi)農(nóng)藥種類僅為33種。QuEChERS法選用含50 mgN-丙基乙二胺(PSA)與50 mg C18的多功能針式過濾膜，PSA可去除脂肪酸、有機(jī)酸、糖類，C18多用于吸附脂肪、多環(huán)芳烴等弱極性物質(zhì)，聯(lián)合使用可有效去除動物源性食品中的脂肪及弱極性化合物。凈化后的提取液為淺黃色接近無色，凈化效果較好，回收率為76.77%～113.22%，滿足檢測要求。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將濃度為100 ng/mL的42種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液以3 μL/min流速直接注入質(zhì)譜，全掃描模式確定各農(nóng)藥母離子，再進(jìn)行子離子掃描，每個(gè)化合物選定2對響應(yīng)高的特征離子對作為定性、定量離子對，進(jìn)一步優(yōu)化碰撞能量，最終得到質(zhì)譜參數(shù)(表4)。

表4 42種農(nóng)藥質(zhì)譜參數(shù)

續(xù)表4

序號名稱反應(yīng)模式母離子(m/z)子離子(m/z)碰撞能量/V13吡蟲啉+256.13175.14209.10211914辛硫磷+299.1377.31129.15291315噠螨靈+365.15147.11309.00241016嘧霉胺+200.19168.10181.14334017胺菊酯+332.24135.20164.12212518三環(huán)唑+190.01135.97163.04282319抑霉唑+297.13159.04255.02262020三唑酮+294.12111.13141.08472521戊唑醇+308.2070.34125.11243522克百威+222.18123.16165.132515233-羥基克百威+238.06163.04181.04135024多菌靈+192.15132.15160.13332025滅幼脲+309.02138.95155.93271426氟啶脲+539.99247.00382.97462327二嗪磷+305.15153.11169.05202028敵敵畏+221.0279.25109.15292029乙霉威+268.20124.16180.14352030除蟲脲-309.02155.97289.04101031樂果+230.0679.24125.08332432水胺硫磷+312.00236.01269.95151433馬拉硫磷+330.9698.92127.00211034滅多威+160.0488.11106.04101035咪鮮胺+376.0970.35307.98261036丙溴磷+374.98304.84346.92211537氟胺氰菊酯+503.15181.10208.07251638噻蟲嗪+292.10181.10210.97261039三唑磷+314.09119.18162.103521

續(xù)表4

序號名稱反應(yīng)模式母離子(m/z)子離子(m/z)碰撞能量/V40甲基對硫磷+264.09122.00231.92251041噻嗪酮+306.2357.45106.22252842甲萘威+202.16127.15145.113111

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性，檢出限和定量限

本試驗(yàn)為基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用外標(biāo)法定量。42種農(nóng)藥在0.5～100 μg/L范圍內(nèi)，呈良好線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)均大于0.990 0。按已建立的UPLC-MS/MS方法，在陰性雞蛋液中添加一定量的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行試驗(yàn)，以3倍信噪比計(jì)算檢出限，10倍信噪比為定量限(表5)，42種農(nóng)藥檢出限為0.01～0.5 μg/kg，定量限為0.034～1.7 μg/kg，表明該方法有較高的靈敏度。

2.4 準(zhǔn)確度與精密度

將不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液分別添加至陰性雞蛋液中，制備不同添加濃度的樣品，參照1.3.1前處理后上機(jī)檢測，進(jìn)行準(zhǔn)確度和精密度測定。由表6可知，3個(gè)不同濃度水平測得的加標(biāo)回收率在74.13%～113.22%，RSD在0.98%～14.29%，表明本方法準(zhǔn)確度高，精密度好，可以滿足禽蛋中農(nóng)藥檢測。

2.5 實(shí)際樣品的測定

為驗(yàn)證該方法的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，選取23份市售禽蛋及其制品為研究對象，其中雞蛋8份，鴨蛋5份，鵝蛋3份，蛋粉7份。試驗(yàn)結(jié)果雞蛋、鴨蛋、鵝蛋均未檢出農(nóng)藥殘留，蛋粉有3份檢出(表7)。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)將QuEChERS前處理技術(shù)與UPLC-MS/MS檢測方法相結(jié)合，同時(shí)檢測禽蛋及制品中42種農(nóng)藥及其代謝物殘留，操作簡便快捷，分析時(shí)間短，靈敏度高。低、中、高三水平加標(biāo)回收率在74.13%～113.22%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于15%，表明該方法在不同濃度水平具有較高的精密度與準(zhǔn)確度。將該方法應(yīng)用于實(shí)際禽蛋樣品的檢測，達(dá)到了良好的檢測結(jié)果，可滿足市售禽蛋及制品中多種農(nóng)藥殘留的高通量快速檢測。

表5 42種農(nóng)藥線性方程、線性平方相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限及線性范圍

表6 42種農(nóng)藥精密度及添加回收率(n=6)

續(xù)表6

序號名稱添加量5 μg/kg添加量10 μg/kg添加量50 μg/kg回收率/%RSD/%回收率/%RSD/%回收率/%RSD/%4毒死蜱75.653.1780.899.3490.375.205苯醚甲環(huán)唑95.776.03100.645.50101.6011.686烯酰嗎啉95.023.9798.585.20103.561.377甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽104.853.61109.004.47108.741.428甲氰菊酯77.383.9379.846.7988.874.799氟蟲腈103.032.13113.222.55111.002.0210氟甲腈102.851.99110.254.64107.612.1311氟蟲腈硫醚(亞砜)103.892.63110.863.52110.441.4312氟蟲腈砜100.461.36108.514.06107.411.2413吡蟲啉97.735.4794.673.8995.136.0314辛硫磷93.937.81103.967.64103.872.2515噠螨靈82.263.6085.996.0091.313.0216嘧霉胺88.684.5790.213.8696.593.7217胺菊酯88.563.4898.665.5197.3652.9318三環(huán)唑83.482.1092.164.26103.462.4619抑霉唑89.694.7592.524.1994.825.4220三唑酮96.552.98105.233.07106.013.0321戊唑醇96.575.0992.426.0399.392.4722克百威97.682.10105.776.68104.102.82233-羥基克百威97.155.24101.791.2299.301.8224多菌靈93.132.8995.492.7999.742.3325滅幼脲90.833.7995.242.7999.762.9726氟啶脲83.0114.2989.235.4791.394.1827二嗪磷95.047.27102.004.64101.731.8528敵敵畏95.434.1396.802.35103.102.5529乙霉威97.620.98103.404.10100.311.2630除蟲脲103.015.73111.592.52103.812.7731樂果98.204.3994.532.73103.802.4932水胺硫磷90.857.03103.933.81101.722.63.33馬拉硫磷92.764.7495.933.31104.212.2234滅多威100.936.4297.003.8798.703.6135咪鮮胺85.377.5595.297.25100.503.0836丙溴磷88.315.3995.915.2897.035.2137氟胺氰菊酯74.132.7076.778.3881.853.6138噻蟲嗪94.512.0194.203.3298.533.9439三唑磷100.472.04105.735.09102.241.6740甲基對硫磷95.366.1698.063.24102.822.3141噻嗪酮88.232.1495.374.5698.353.6642甲萘威91.853.7395.765.29100.832.63

表7 蛋粉農(nóng)藥檢測結(jié)果