樟樹胚萌發(fā)早期影響因素及植株再生

楊 柳，林立彬，李志輝

（1.韶關(guān)市植物保護站，廣東 韶關(guān) 512001；2.中南林業(yè)科技大學(xué)，湖南 長沙 410004； 3.韶關(guān)國家森林公園管理處，廣東 韶關(guān) 512023）

樟樹Cinnamomum camphora為樟科Lauraceae樟屬Cinnamomum植物，又名香樟、臭樟，是優(yōu)良的行道樹和綠化樹[1]。樟樹木材耐腐防蟲，是家具、雕刻的良材[2]，樟樹的根、莖、葉、花等器官富含芳香油[3]，在化妝品中得到廣泛應(yīng)用，樟樹還在醫(yī)藥和化工方面有廣泛的使用價值。近年來，對于樟樹體細(xì)胞胚胎發(fā)生的研究不多，僅有杜 麗[4]，施雪萍[5]、陳甘明[6]對樟樹體細(xì)胞胚胎發(fā)生有過研究，實驗證明樟樹體胚具有直接和間接發(fā)生兩種途徑，楊柳[7]對直接發(fā)生途徑有過相關(guān)研究，但是對早期幼胚萌發(fā)條件、影響因素及間接發(fā)生途徑?jīng)]有進行探討，研究早期影響因素對后期誘導(dǎo)胚性愈傷組織及體胚發(fā)生、成熟具有指導(dǎo)意義。針對以上問題，本研究以樟樹未成熟合子胚為外植體，研究不同因素對未成熟合子胚萌發(fā)的影響，并對湖南省不同種源樟樹胚性愈傷組織進行誘導(dǎo)，對體胚發(fā)生途徑進行補充，旨在完善樟樹的體胚發(fā)生培養(yǎng)技術(shù)，為基因技術(shù)提供有力的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

不同因素對樟樹胚萌發(fā)的影響實驗中，選擇中南林業(yè)科技大學(xué)校園內(nèi)樹干飽滿、生長健壯、無病蟲害、長勢一致、年齡相當(dāng)?shù)恼翗渲仓隇楣┰嚹阁w，于7月15 日、8月15 日、9月15 日、10月15 日采集發(fā)育正常、大小一致的樟樹種子用作實驗材料。不同種源樟樹愈傷組織誘導(dǎo)的材料則選擇于2016年7月采自湖南省長沙、岳陽、婁底、醴陵、郴州、懷化的樟樹未成熟種子。

種子采集后放入4 ℃冰箱冷藏，每天進行定期檢查，發(fā)現(xiàn)種子褐化、霉變要及時篩出，避免感染其他種子。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同因素對樟樹幼胚萌發(fā)的影響

1.2.1.1 預(yù)處理對樟樹胚萌發(fā)的影響

種子消毒接種前，做以下處理：一是低溫處理，將樟樹種子提前放入0 ℃冰箱24 h；二是浸泡處理，將樟樹種子在消毒前用無菌水浸泡24 h。另外設(shè)置一個對照組，不做任何預(yù)處理，采種后統(tǒng)一放入4 ℃冰箱保存。3個處理的樟樹種子消毒后接種于培養(yǎng)基MS+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2,4-D上，附加水解酪蛋白(CH)700 mg，蔗糖30 g，瓊脂粉7.5 g，每個處理30個外植體，3 次重復(fù)。

1.2.1.2 不同采種時間對樟樹胚萌發(fā)的影響

將7月15 日、8月15 日、9月15 日、10月15 日采取的樟樹種子在無菌條件下接種于MS 基本培養(yǎng)基，統(tǒng)一添加1.0 mg/L 6-BA,0.1 mg/L 2,4-D,水解酪蛋白(CH)700 mg,蔗糖30 g,瓊脂粉7.5 g。該實驗每個處理30個外植體，3 次重復(fù)。

1.2.1.3 活性炭濃度對樟樹胚萌發(fā)的影響

在樟樹種子啟動培養(yǎng)基MS+1 mg/L 6-BA+ 0.1 mg/L 2,4-D中添加活性炭濃度分別為0、50、100、150、200 mg/L，附加水解酪蛋白(CH)700 mg， 蔗糖30 g，瓊脂粉7.5 g，每個處理30個外植體，3 次重復(fù)。

1.2.1.4 肌醇濃度對樟樹胚萌發(fā)的影響

該實驗中，將7月樟樹幼胚接種于添加了不同肌醇濃度和附加物種類和濃度同上的基本培養(yǎng)基上，肌醇設(shè)置濃度分別為0、50、100、200 mg/L，每個處理30個外植體，3 次重復(fù)。

1.2.1.5 正交組合對樟樹胚萌發(fā)的影響

該實驗以MS 為基本培養(yǎng)基，研究了不同濃度的6-BA、NAA、IBA、鏈霉素組合對樟樹幼胚萌發(fā)的影響，采用L9(34)正交試驗設(shè)計方法，進行4 因素3 水平試驗，共9個處理。因素間的交互作用不在考慮之列，各因素隨機分布排列。每個處理30個外植體，重復(fù)3 次。

表1 6-BA、NAA、IBA 和鏈霉素正交組合試驗設(shè)計Table 1 Orthogonal combination of 6-BA,NAA,IBA and Streptomycin

1.2.2 不同種源樟樹胚性愈傷組織的誘導(dǎo)與增殖

前期圍繞幼胚下胚軸產(chǎn)生的愈傷組織切除褐化部分，轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基，MS 為基本培養(yǎng)基，添加0.5 mg/L TDZ、0.5 mg/L 6-BA、設(shè)置2，4-D 濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L，每個種源不少于30 瓶，30 d 后統(tǒng)計胚性愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.2.3 不同種源樟樹胚性愈傷組織誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生

胚性愈傷組織在增殖培養(yǎng)基上生長穩(wěn)定后，挑選色澤飽滿、透明緊密的黃白色顆粒狀組織轉(zhuǎn)入體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每個處理附加 0.2 mg/L 2，4-D、2 mg/L 6-BA、30 g 蔗糖、7.5 g 瓊脂，設(shè)置GA3濃度為0.1、0.5、1.0 mg/L，每個種源至少30 瓶，30 d 后統(tǒng)計體細(xì)胞胚胎發(fā)生率。成熟體胚轉(zhuǎn)入萌發(fā)培養(yǎng)基MS+1.0 mg/L 6-BA+ 0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L GA3繼續(xù)生長，直至小苗展開完整地葉片。

1.2.4 不同種源樟樹根的誘導(dǎo)

將繼代培養(yǎng)的體胚苗轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基，30 d 后觀察并記錄生根率，采用MS 培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加激素為IBA(1 mg/L)、NAA(0、0.1、0.3、0.5 mg/L)，水解酪蛋白(CH)700 mg,蔗糖30 g,瓊脂粉7.5 g，以上培養(yǎng)基用HCl 或NaOH 標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液調(diào)節(jié)pH 值5.8～6.0,培養(yǎng)基在121 ℃滅菌20 min，培養(yǎng)條件均為光照培養(yǎng)16 h，黑暗培養(yǎng) 8 h，光照強度為1 000 lx，培養(yǎng)溫度為(23±2) ℃（如無特殊說明，下同）。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

接種后的外植體培養(yǎng)4 周后分別統(tǒng)計各個處理的胚萌發(fā)率、平均出芽數(shù)，觀察褐化率及后續(xù)愈傷組織生長情況，記錄相應(yīng)數(shù)據(jù)。用SPSS 軟件進行方差分析和多重比較，最小顯著性差異水平P=0.05。

胚萌發(fā)率(100%)＝(萌發(fā)的幼胚數(shù)/接種幼胚總數(shù))×100%；

平均出芽數(shù)＝出芽總數(shù)/誘導(dǎo)出芽的外植體總數(shù)；

褐化率＝( 褐化的外植體總數(shù)/ 接種總數(shù))×100%；

胚性愈傷組織誘導(dǎo)率=(胚性愈傷組織數(shù)/接種的愈傷組織總數(shù))×100%；

體細(xì)胞胚胎發(fā)生率=(誘導(dǎo)出體胚數(shù)/接種的胚性愈傷組織總數(shù))×100%；

植株生根率=(誘導(dǎo)出根的外植體總數(shù)/接種的芽總數(shù))×100%。

2 結(jié)果與分析

將幼胚接種于培養(yǎng)基上，可以觀察到兩種情況。一種是接種一周左右外植體開始有萌動跡象，漸漸在胚芽處直接抽生出芽器官，通常一個子葉胚形成多個芽，伴隨著芽器官的發(fā)生不久之后便看到有根的生成，繼續(xù)培養(yǎng)可以觀察到環(huán)繞子葉胚胚軸有愈傷組織形成，部分愈傷組織具有胚性，后期可誘導(dǎo)體胚發(fā)生。若先形成根器官，則無法看到后面有芽的形成，不能形成完整植株，故把根器官發(fā)生不計入胚萌發(fā)；二是幼胚逐漸長大，從剛開始的小點發(fā)育成白色子葉狀結(jié)構(gòu)，在白色子葉狀周圍隨后觀察到有愈傷組織的形成，愈傷組織繼續(xù)培養(yǎng)，可以誘導(dǎo)體胚直至萌發(fā)出嫩芽。以上兩種情況均計入胚萌發(fā)的外植體總數(shù)。

2.1 不同因素對樟樹胚萌發(fā)的影響

2.1.1 預(yù)處理對樟樹胚萌發(fā)的影響

低溫與浸泡預(yù)處理對樟樹幼胚萌發(fā)的影響見表2，由表2 可知，不同的預(yù)處理方式對樟樹胚萌發(fā)率沒有顯著差異，能觀察到幼胚萌發(fā)均在20 瓶以上，本質(zhì)上沒有太大差別，觀察到各處理的芽苗均發(fā)育正常，葉片大小較均一，大部分顏色較綠，沒有出現(xiàn)大批量黃化的現(xiàn)象。但是對種子提前浸泡24 h 處理會較早出現(xiàn)褐化，幼胚邊緣少許水漬化，接種后培養(yǎng)基顏色隨著時間的推移逐漸加深，到了第五天可觀察到較為明顯的黃褐色，而低溫與對照組在第7 天觀察到褐化現(xiàn)象，褐化較輕，經(jīng)后續(xù)芽苗生長觀察，低溫處理與對照組沒有明顯區(qū)別。這可能是采種后的種子放入4 ℃冰箱保存，而0 ℃低溫處理與之相差不大，沒有達(dá)到樟樹種子的臨界溫度故沒有太大差異，而提前浸泡種子沒有化學(xué)上的本質(zhì)變化，而在一定程度上破壞了包裹幼胚的果肉，吸收了更多的水分，故較早褐化與水漬化，不利于后續(xù)芽的生長和愈傷組織的誘導(dǎo)。綜上所述，各預(yù)處理對樟樹胚萌發(fā)沒有顯著性差異，浸泡處理不利于幼胚后續(xù)生長發(fā)育。

表2 預(yù)處理對樟樹胚萌發(fā)的影響?Table 2 Effect of pretreatment on germination of Cinnamomum camphora embryo

2.1.2 不同采種時間對樟樹胚萌發(fā)的影響

采種時間對樟樹胚萌發(fā)的影響見表3，分析不同采種時間對樟樹胚萌發(fā)有明顯的影響。7月樟樹種子幼胚萌發(fā)率和平均出芽數(shù)高于其余月份，在實驗的過程中，觀察不到9、10月樟樹種子的胚萌發(fā)和胚性愈傷組織發(fā)生，把9月和10月種子接種到培養(yǎng)基上，種子直接褐化嚴(yán)重，無法觀察到胚正常萌發(fā)。7月樟樹種子可誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，多為白色透明狀組織，表面有光澤，經(jīng)過培養(yǎng)，后期可以成功誘導(dǎo)出體胚直至誘導(dǎo)不定芽長成完整植株，9月與10月愈傷為灰褐色組織，褐化嚴(yán)重，繼代過程中易死亡，無法誘導(dǎo)正常芽，此外，相同處理下污染率、褐化率明顯高于7月份，雖然有觀察到8月種子胚萌發(fā)的過程，但是胚萌發(fā)率和平均出芽數(shù)低于7月，幼胚萌動也比7月晚。綜上所述，隨著采種時間的推移，胚萌發(fā)率和平均出芽數(shù)下降，污染率、褐化率增加，7月幼胚對樟樹胚萌發(fā)誘導(dǎo)效果最好，實驗時選擇7月的未成熟合子胚最佳。

表3 采種時間對樟樹胚萌發(fā)的影響Table 3 Effect of seed selection time on germination of Cinnamomum camphora

2.1.3 活性炭濃度對樟樹胚萌發(fā)的影響

活性炭濃度對樟樹幼胚萌發(fā)的影響，從表4可以看出，誘導(dǎo)率隨著活性炭濃度的變化而變化，低濃度（≤100mg/L）的活性炭對發(fā)芽率沒有顯著差異。當(dāng)活性炭濃度為150 mg/L 時，樟樹種子有最大的胚萌發(fā)率88.89%，此時褐化率最低，可觀察到胚性愈傷組織表面光澤度明顯，呈透明或乳白狀，最低誘導(dǎo)率54.44%是當(dāng)活性炭濃度為 200 mg/L 時，此時褐化數(shù)最多，以非胚性愈傷組織居多，另外我們發(fā)現(xiàn)，活性炭濃度為100 mg/L時，各指標(biāo)與對照組沒有明顯區(qū)別，胚萌發(fā)率甚至略低于對照組，繼續(xù)增大活性炭濃度，當(dāng)活性炭濃度為200 mg/L 時，胚萌發(fā)率明顯低于對照組，褐化數(shù)顯著增加。活性炭對胚萌發(fā)率的促進作用可以理解為活性炭有吸附乙烯等代謝物質(zhì)的作用，使各營養(yǎng)物質(zhì)保持在一種平衡的狀態(tài)，pH 在合理的范圍內(nèi)，活性炭的抑制作用則是除了吸附代謝物質(zhì)，也會對激素濃度進行一定程度上的改變，激素濃度過低，無法滿足其生長發(fā)育的需求。綜上所訴，當(dāng)活性炭濃度為150 mg/L 時樟樹幼胚有最大的萌發(fā)率，但是還要進一步探討活性炭與幼胚萌發(fā)變化規(guī)律，找出最有效控制褐化、提高誘導(dǎo)率的技術(shù)措施。

2.1.4 肌醇濃度對樟樹胚萌發(fā)的影響

肌醇濃度對樟樹幼胚萌發(fā)早期的影響，見表6。肌醇作為一種有效的有機化合物滲透劑，不僅可以調(diào)節(jié)滲透壓，還可以為植物體提供碳源，分析表中各項數(shù)據(jù)，隨著肌醇濃度的小范圍增大，幼胚萌發(fā)率逐漸上升，但沒有顯著性差異，各項處理幼胚萌發(fā)率均大于70%。平均出芽數(shù)在2～3個之間，無顯著差異。雖然兩項指標(biāo)沒有達(dá)到顯著性差異，發(fā)生途徑也以出芽和愈傷組織發(fā)生為主，但附加100 mg/L 肌醇的培養(yǎng)基上觀察到胚性愈傷組織生成，胚性愈傷組織的產(chǎn)生在后期可直接誘導(dǎo)體胚發(fā)生，為植株再生提供發(fā)生基礎(chǔ)。

表4 活性炭濃度對樟樹種子胚萌發(fā)的影響Table 4 Effect of activated carbon concentration on germination of Cinnamomum camphora seeds

表5 ANOVA 單因素分析-誘導(dǎo)率Table 5 ANOVA single factor analysis - Induction rate

圖1 樟樹種子組織培養(yǎng)過程中的褐化情況Fig.1 Browning in the seed tissue culture of Cinnamomum camphora

表6 肌醇濃度對樟樹胚萌發(fā)的影響Table 6 Effect of inositol concentration on germination of Cinnamomum camphora

2.1.5 6-BA、NAA、IBA 和鏈霉素對樟樹胚萌發(fā)的影響

6-BA、NAA、IBA 和鏈霉素正交設(shè)計試驗結(jié)果見表7。分析表中數(shù)據(jù)，樟樹幼胚萌發(fā)率隨著6-BA 濃度的增加而增加，在不含6-BA 的處理上，誘導(dǎo)率普遍偏低，在6-BA 的基礎(chǔ)上添加另外激素，誘導(dǎo)率均在50%以上，可見6-BA 是影響胚萌發(fā)的主要影響因子。不添加任何激素的情況下，可觀察到胚萌發(fā)的低頻發(fā)生，證明樟樹未成熟胚生長分化能力較強，是適合誘導(dǎo)后期體胚發(fā)生的外植體類型。另外，鏈霉素的添加可在一定程度上抑制培養(yǎng)基褐化，吸附酚類物質(zhì)，改善生長條件，最大的胚誘導(dǎo)率是在處理1（0.5 mg/L6-BA+ 0.1 mg/LNAA +0.5 mg/LIBA）中得到的達(dá)75%。對表中各試驗因素進行主次分析，以幼胚誘導(dǎo)率作為評價指標(biāo)，其影響的主次順序為：6-BA ＞NAA ＞鏈霉素＞IBA。

對主要影響因子6-BA進行方差分析，見表8～ 10。表8 表明隨著6-BA 濃度的增加，均值也呈現(xiàn)顯著增加的趨勢；從表9 可以看出6-BA 各處理之間誘導(dǎo)率在0.05 水平上達(dá)到顯著差異（P ＜0.05）；對表10 中的數(shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)不添加6-BA 與其余兩個處理之間存在顯著性差異，0.1～0.5 mg/L 之間沒有顯著差異。綜合生長情況可得出，較高濃度的6-BA 表現(xiàn)較好，其誘導(dǎo)率明顯優(yōu)于不添加6-BA 的處理，同時也說明了細(xì)胞分裂素6-BA 對胚萌發(fā)的重要性，只有生長素與細(xì)胞分裂素結(jié)合使用，才能有較好的結(jié)果。

表7 6-BA、NAA、IBA 和鏈霉素對樟樹幼胚萌發(fā)的影響Table 7 Effects of 6-BA,NAA,IBA and streptomycinon germination of Cinnamomum camphora

2.2 不同種源樟樹胚性愈傷組織的誘導(dǎo)與增殖

在體胚誘導(dǎo)過程中，圍繞幼胚下胚軸常伴有愈傷組織的出現(xiàn)，視覺上與外植體輕微連在一起，不同種源愈傷組織不盡相同，挑選結(jié)構(gòu)致密、略帶粘性、生長旺盛的愈傷轉(zhuǎn)入不同激素配比的相應(yīng)培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，觀察胚性愈傷組織生長情況及速度，不同種源樟樹胚性愈傷組織誘導(dǎo)率見表11，從表中我們可以看出，各種源誘導(dǎo)率基本分布在30%～70%之間，婁底例外，個別處理效果不理想，誘導(dǎo)率僅僅只有16.67%和26.67%。當(dāng)培養(yǎng)基只添加細(xì)胞分裂素6-BA 時，各種源誘導(dǎo)率偏低，集中分布在30%左右，各種源隨著6-BA濃度的變化呈現(xiàn)不同的變化趨勢，沒有固定的規(guī)律可循，在這種情況下，胚性愈傷組織誘導(dǎo)率相對較好的是長沙和岳陽種源。在細(xì)胞分裂素6-BA的基礎(chǔ)上添加生長素2,4-D 可有效提高愈傷組織向胚性愈傷組織的轉(zhuǎn)換，在兩者結(jié)合使用的條件下，誘導(dǎo)率大部分都提高到50%以上，相比單獨使用6-BA 有更好的誘導(dǎo)效果，其中郴州和長沙達(dá)到最高的誘導(dǎo)率66.67%。細(xì)胞分裂素6-BA 濃度不變，隨著生長素2，4-D 濃度的增加，各種源變化趨勢不一，岳陽種源樟樹為先減小后增大，其余種源大體上表現(xiàn)為先減小后增大。雖然各種源在不同激素配比下胚性愈傷組織變化規(guī)律不完全一致，但我們可以得出細(xì)胞分裂素與生長素共同使用可提高誘導(dǎo)效果，細(xì)胞處于不斷分化狀態(tài)，需要積累營養(yǎng)物質(zhì)，單獨的細(xì)胞分裂素不足以支持細(xì)胞增殖，2，4-D 作為體胚誘導(dǎo)過程中不可缺少的生長素，在愈傷組織分化中同樣重要。

表8 6-BA 單因素描述Table 8 6-BA single factor description

表9 主因素6-BA ANOVA 分析Table 9 Main factor 6-BA ANOVA analysis

表10 6-BA 組間多重比較?Table 10 Multiple comparisons between groups 6-BA

表11 激素配比對不同種源樟樹胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響 Table 11 Effect of hormone ratio on callus induction in Cinnamomum camphora embryo of different provenance

觀察不同種源樟樹愈傷組織生長情況，從表12中可以看出，長沙和岳陽愈傷組織增殖較快，產(chǎn)生的胚性愈傷組織較多，大多為黃白色、質(zhì)地較松散的愈傷組織，生長旺盛且前期不易褐化，后期能成功誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生；其次生長狀況良好的是郴州與懷化種源的樟樹，黃色結(jié)構(gòu)較緊密，但愈傷組織表面略微褐化，生長速度較慢，增殖效果不是太明顯；相對較差的是醴陵和婁底種源，在這兩種種源的培養(yǎng)基上，均發(fā)現(xiàn)了個別細(xì)胞較大的愈傷組織，前期透明化，后期逐漸褐化，少數(shù)能進行下一步培養(yǎng)，褐化的愈傷組織生長速度快，僅僅幾天可擴大幾倍體積，部分褐化的愈傷組織經(jīng)過后期培養(yǎng)有體細(xì)胞胚胎產(chǎn)生，著生于褐化的愈傷底部或頂部。

表12 不同種源樟樹愈傷組織的生長比較Table 12 Comparison of the growthcallus of Cinnamomum camphora in different provenances

圖2 不同種源愈傷組織形態(tài)對比 Fig.2 Comparison of callus morphology of different provenances

2.3 不同種源樟樹胚性愈傷組織誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生

將誘導(dǎo)的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接到含有不同激素配比的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生，培養(yǎng)20～30 d， 肉眼可見愈傷組織表面有乳白色體胚發(fā)生，隨著體胚發(fā)生進程，愈傷組織逐漸褐化，胚性愈傷組織生長速度減緩。不同種源體胚誘導(dǎo)率見表4～5，6-BA 濃度一定，附加相同濃度的生長素2，4-D 和NAA，各種源體胚誘導(dǎo)率在兩種處理下沒有太大差別，且誘導(dǎo)率較低，誘導(dǎo)率相對較好的是長沙和婁底種源樟樹。一定量的6-BA 和KT，添加不同濃度的NAA，由表中數(shù)據(jù)可知，隨著NAA 濃度的增加，岳陽、醴陵體胚誘導(dǎo)率逐漸減小，郴州、長沙、懷化、婁底呈現(xiàn)先增加后減小趨勢，總體看來，0.1 mg/L 和0.5 mg/L 的NAA 由較高的誘導(dǎo)率，誘導(dǎo)效果好，均與處理1 和處理2 相比誘導(dǎo)率有較大的提升。體胚誘導(dǎo)率較差的郴州種源在后期培養(yǎng)中愈傷組織易褐化，容易在褐化的愈傷組織上長出一定數(shù)量的體胚，胚性愈傷組織難保存，導(dǎo)致體胚誘導(dǎo)率低。表現(xiàn)較好的為長沙種源，愈傷組織結(jié)構(gòu)較松散，黃白色胚性愈傷組織分布較為廣泛，后期體胚容易萌發(fā)嫩芽。

將誘導(dǎo)出的體胚轉(zhuǎn)入MS+1 mg/L 6-BA+ 0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L GA3培養(yǎng)基中繼續(xù)生長，一個月后體胚逐漸變得白、綠相間，繼續(xù)培養(yǎng)，綠色芽點萌發(fā)成小苗，在相同培養(yǎng)基上經(jīng)過一段時間的壯苗，可直接萌發(fā)生根，但是有的根脆弱易斷，必須轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根，少數(shù)可長出茁壯的根且后期不需要另外誘導(dǎo)生根。

表13 激素配比對胚性愈傷組織誘導(dǎo)體胚的影響 Table 13 Effects of hormone composition on somatic embryo induction in embryonic callus

圖3 樟樹愈傷組織誘導(dǎo)植株再生過程Fig.3 Callus induction of plant regeneration in Cinnamomum camphora

2.4 不同種源樟樹在不同激素組合上根的誘導(dǎo)

從表14 中可以看出，激素濃度對不同種源樟樹生根率有影響，各處理生根率基本都在50%以上，由此看來，樟樹是較易誘導(dǎo)生根類型。不添加任何激素，樟樹也能生根，生根率在40%～60%左右；單獨添加1 mg/L 的IBA，生根率并沒有在空白對照組上明顯提高，甚至個別種源略低于空白對照組；在IBA 上附加0.1 mg/L 的IAA 和NAA，生根率均有明顯提高，提高到70%～90%之間，總體看來，IBA 與NAA 的組合略好于IBA與IAA 組合。由表中可知，長沙種源樟樹有最高的生根率，達(dá)89.25%，其次為岳陽種源88.36%。各種源生根率不同，根長、數(shù)量均不同，平均長根數(shù)在2～5 條之間，常常以繞圈的形式盤踞培養(yǎng)基底部。醴陵和郴州種源樟樹最佳生根激素配比為1 mg/L IBA+0.1 mg/L IAA，其余種源生根最適激素均為1 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA。

表14 激素對不同種源樟樹生根的影響Table 14 The effect of hormonefor root fromdifferent provenances of Cinnamomum camphora

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié) 論

低溫和浸泡預(yù)處理種子對樟樹幼胚萌發(fā)沒有顯著性差異，浸泡處理不利于幼胚后續(xù)生長發(fā)育；不同的采種時間對胚萌發(fā)率和平均出芽數(shù)影響很大，隨著采種時間的推遲，胚萌發(fā)率顯著降低，甚至在9月份和10月份沒有觀察到出芽發(fā)生，7月幼胚對樟樹萌發(fā)誘導(dǎo)效果最好，實驗時選擇7月的未成熟合子胚最佳；附加150 mg/L 的活性炭，培養(yǎng)基褐化率較低；肌醇濃度對樟樹幼胚萌發(fā)早期誘導(dǎo)無顯著性影響；對6-BA、NAA、IBA 和鏈霉素進行正交設(shè)計試驗，其影響的主次順序為：6-BA ＞NAA ＞鏈霉素＞IBA。

綜合各種源胚性愈傷組織誘導(dǎo)率和生長情況，生長較好的是長沙和岳陽種源樟樹，生長郴州與懷化種源的樟樹次之，相對較差的是醴陵和婁底種源。岳陽、郴州、醴陵、長沙、懷化、婁底胚性愈傷組織最大誘導(dǎo)率分別為53.55%、66.67%、63.33%、66.67%、60%、53.33%；岳陽、郴州、醴陵、長沙、懷化、婁底愈傷組織誘導(dǎo)體胚發(fā)生最大誘導(dǎo)率分別為56.41%、42.31%、48.96%、64.71%、63.25%、56.31%；醴陵和郴州種源樟樹最佳生根激素配比為1 mg/L IBA+0.1 mg/L IAA，其余種源生根最適激素均為1 mg/L IBA+ 0.1 mg/L NAA。

3.2 討 論

3.2.1 采種時間與胚萌發(fā)的關(guān)系

影響體胚發(fā)生的因子很多，如外植體采種時間、培養(yǎng)基、母株基因型和激素種類及用量等，在對各種因子進行研究后發(fā)現(xiàn)，外植體采種時間直接影響了外植體的發(fā)育程度，對整個組織培養(yǎng)以及體胚發(fā)生具有非常重要的作用，針對此項研究已經(jīng)在不同的樹種中有所體現(xiàn)。劉艷芝[8]、王萍[9]等發(fā)現(xiàn)大豆Glycine max的不同生長發(fā)育階段、取材時間對體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)有顯著地影響；習(xí)洋[10]等在研究刺槐Robinia pseudoacacia體細(xì)胞胚胎發(fā)生時，得出開花后55 d 的刺槐是誘導(dǎo)體細(xì)胞胚和胚性愈傷組織的最佳時候；于曉芳[11]利用馬尾松Pinus massoniana不同采種時間的種子誘導(dǎo)其愈傷組織的發(fā)生，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胚性愈傷組織誘導(dǎo)的最佳采種時間為7月25 日。在樟樹體細(xì)胞胚誘導(dǎo)方面，對于胚齡對于體胚發(fā)生早期的影響，僅有陳甘明[6]有此研究，他的實驗結(jié)果表明開花后不同時間采種的樟樹幼胚對體細(xì)胞胚胎發(fā)生有顯著差異，得出了開花60 d 的樟樹合子胚體胚誘導(dǎo)率明顯高于開花后70、80 d。由此可見，掌握好外植體取材時間非常重要，外植體過于幼嫩或者過于成熟都難以誘導(dǎo)得到理想的結(jié)果。本試驗研究結(jié)果與之前的類似，結(jié)果顯示采種時間為7月15 日胚萌發(fā)率最高，為81.11%，而到9月份采種的種子幼胚萌發(fā)率為0%，基本觀察不到胚性愈傷組織的發(fā)生，由此得出樟樹幼胚最佳采種時間為7月。本次試驗為樟樹幼胚早期萌發(fā)和后期體胚發(fā)生采種時間做了相關(guān)研究，此前并沒有外植體采種月份對于樟樹胚萌發(fā)的相關(guān)報道，但試驗存在許多不足的地方，取材間隔時間太長，未對7月進行幾天一采種，沒有觀察到種子外部變化，一個月的時間對于幼嫩種子來說發(fā)育程度不一致，在以后實驗中盡量進行更加細(xì)致的處理，不斷完善樟樹離體培養(yǎng)發(fā)生的技術(shù)，為后人提供一個可借鑒的試驗基礎(chǔ)。

3.2.2 胚萌發(fā)過程中的褐化現(xiàn)象

褐化是組織培養(yǎng)過程中的常見現(xiàn)象，其褐化程度與外植體狀態(tài)、取材部位、培養(yǎng)方式、生理年齡、激素濃度等多重因素有關(guān)，進行其組培過程中優(yōu)化研究實際上就是為了控制褐化率，提高體胚發(fā)生出芽率及增殖系數(shù)，尤其在培養(yǎng)的前期，褐化直接會影響種子發(fā)芽、愈傷組織的形成。針對樟樹種子在組織培養(yǎng)過程中褐化、發(fā)芽率低等問題，本研究也從種子預(yù)處理、在培養(yǎng)基中添加一定量的激素、活性炭等幾個方面開展了實驗，結(jié)果表明雖然樟樹種子細(xì)胞里的酚類物質(zhì)易被氧化為棕褐色的醌類物質(zhì)，但是幼嫩的外植體氧化的程度有限，即使不添加活性炭，褐化程度也沒有那么嚴(yán)重，通過不斷繼代，外植體在培養(yǎng)基中仍然可以正常生長發(fā)育，這也與7月未成熟種子誘導(dǎo)胚萌發(fā)更佳的實驗結(jié)果相符合。燕麗萍[12]等曾對香樟種子開展過消毒實驗，處理為剝?nèi)》N子蠟質(zhì)層及種皮，研究表明較厚蠟質(zhì)層不是抑制香樟種子發(fā)芽的原因，這與本實驗研究結(jié)果類似，帶果肉種子仍有較高出芽率；甘艷[13]等探討了香樟繼代及生根的最適活性炭濃度，結(jié)果表明1.8 g/L 的活性炭對香樟繼代培養(yǎng)過程中控制褐化效果最好；蔣建林[14]等研究發(fā)現(xiàn)活性炭為1.5 g/L 時外植體褐化程度最低。本實驗的外植體為未成熟種子，所以活性炭用量規(guī)則不同，但是同樣可以證明活性炭在一定程度上能有效控制培養(yǎng)基褐化；有研究表明水培預(yù)處理時間越長能夠降低外植體褐化率[15]，這與本文的浸泡處理相類似，但是本研究并沒有得到理想的結(jié)果，褐化率反而略高于其余處理，這可能是因為一定程度上外植體為未成熟種子，不能歸類于“水培法”，且樟樹新鮮種子為漿果，含水量高，長時間浸泡果肉易腐爛。在樟樹種子萌發(fā)后，經(jīng)過在同種培養(yǎng)基上的繼代培養(yǎng)、芽分化，培養(yǎng)基MS+1 mg/L IBA+0.3 mg/L NAA 的生根誘導(dǎo)，能發(fā)育為完整植株。本實驗對樟樹種子胚萌發(fā)過程中褐化問題進行研究，并在前人的基礎(chǔ)上進行優(yōu)化，旨在為高頻率誘導(dǎo)樟樹組培苗提供依據(jù)，為樟樹規(guī)范化栽培提供技術(shù)參考，以獲得更高的經(jīng)濟和生態(tài)效益，這也在一定程度上填補了樟樹未成熟種子萌發(fā)過程中控制褐化方面的研究空缺。

3.2.3 肌醇的滲透調(diào)節(jié)作用

肌醇是一種水溶性維生素，有促進植物生長發(fā)育、促進細(xì)胞新陳代謝、提供碳源、調(diào)節(jié)滲透壓，從而影響植物體細(xì)胞胚胎發(fā)育過程等作用。在許多研究中，肌醇對愈傷組織及體細(xì)胞胚胎發(fā)生都有促進作用，郭家雁[16]等研究發(fā)現(xiàn)缺肌醇的饑餓處理可以影響后期體細(xì)胞的形成，饑餓處理的體細(xì)胞數(shù)量與時間的增加成反比，缺肌醇時間越長，形成的體細(xì)胞數(shù)量越少；在禾本科植物蘆葦中，吳國良[17]等發(fā)現(xiàn)肌醇對愈傷組織的形成是必須的，尤其對愈傷組織的良好生長有著不可或缺的作用；在針葉樹中，宋躍[18]等得出肌醇濃度為10 g/L，體胚發(fā)生量較好，與預(yù)測值一致；但在落葉灌木刺五加研究中，李香竹[19]認(rèn)為在肌醇缺失的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)物生長狀態(tài)更好，同步率更高?？梢?，肌醇對于愈傷組織及誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎胚發(fā)生是個非常復(fù)雜的問題，不可一概而論，既有研究表明有促進作用，也有實驗證明有抑制作用，這要視不同樹種、不同外植體、不同添加物、外植體不同生長狀態(tài)等而異，在本實驗中，少量肌醇（≤100 mg/L） 對幼胚萌發(fā)有少許促進作用，但是促進效果不明顯，各實驗處理沒有顯著性差別，這可能是培養(yǎng)基中添加的蔗糖抵消掉了一部分培養(yǎng)物對于碳源的需求，滲透壓趨于平衡，故沒有達(dá)到顯著性差異。對于其中的機理，以后還需設(shè)置更多的實驗加以驗證。

4 展 望

胚性愈傷組織誘導(dǎo)率不高、體胚難以成熟發(fā)芽、褐化問題沒有完全解決等都在一定程度上制約著樟樹的進一步發(fā)展，可對激素種類及用量再做細(xì)致的研究，可設(shè)置更多的濃度梯度來得出更加準(zhǔn)確的結(jié)論；樟樹體細(xì)胞胚胎發(fā)生還處于初級階段，今后應(yīng)在此基礎(chǔ)上開展關(guān)于樟樹生理生化以及細(xì)胞學(xué)觀察等機理研究，揭示體細(xì)胞胚胎發(fā)生的起源方式、發(fā)生方式、細(xì)胞學(xué)形態(tài)、特點等，完善胚胎發(fā)育的全過程，為體胚的發(fā)生機理提供有力的理論基礎(chǔ)。