油桐花序石蠟切片制作方法改良

付 盼，李文瑩，劉美蘭，李 靜，張 琳

（中南林業(yè)科技大學(xué) 經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410004）

油桐Vernicia fordii是大戟科Euphorbiaceae 油桐屬Vernicia落葉喬木，是我國熱帶和亞熱帶特有的木本工業(yè)油料樹種，在我國湖南、湖北、重慶等省區(qū)都有大面積栽培[1-2]。油桐種子榨出來的油稱作桐油，桐油是植物油中最優(yōu)質(zhì)的干性油[3]。桐油用途廣泛，尤其是可作為生產(chǎn)環(huán)保型油漆（涂料）的良好原料，同時(shí)也是制造生物柴油和高分子材料的優(yōu)質(zhì)原料[4-6]。油桐栽培生產(chǎn)上普遍存在著雄花多、雌花少的問題，低雌雄花比例是影響油桐果實(shí)產(chǎn)量的重要因素之一。為了研究油桐雌雄花的花芽分化過程及其成花機(jī)理，首先需要對其花序的組織形態(tài)學(xué)進(jìn)行系統(tǒng)的研究。目前關(guān)于油桐的研究主要集中在苗木培育[7-10]、生理特性[11-14]、 病蟲害防治[15-17]、化學(xué)成分分析[18-20]、基因克隆與表達(dá)[21-24]等方面，關(guān)于油桐各組織器官的細(xì)胞學(xué)及形態(tài)學(xué)研究報(bào)道較少。石蠟切片技術(shù)作為研究植物內(nèi)部構(gòu)造和發(fā)育形態(tài)的一項(xiàng)重要技術(shù)，極大地推動(dòng)了植物組織形態(tài)學(xué)的發(fā)展。然而，常規(guī)石蠟切片技術(shù)并不適用于所有的試驗(yàn)材料的研究，譬如油桐、杏花[25]、石榴花[26]以及木本植物的莖段[27]等。

油桐多為雌雄同株異花植物，花序?yàn)閳A錐狀聚傘花序，在花序主軸或二級主軸頂端著生一朵或幾朵雌花，而雄花包圍在外[28]。雌雄花器官尚未形成前，油桐花序軸也未分化完成，此時(shí)花序體積較小，常規(guī)的石蠟切片制作較為容易。但當(dāng)油桐雌雄蕊形成時(shí)，其花序結(jié)構(gòu)基本分化完畢，各級軸主次分明，小花體積也逐步增大，此時(shí)油桐花序橫縱徑約為1～1.5 cm，花序中包含著少則20 朵，多則上百朵小花，且小花之間排列緊密，小花萼片內(nèi)外密披絨毛和黏液，花序軸上著生大量小葉。油桐復(fù)雜的花序結(jié)構(gòu)及其分泌物質(zhì)，使處于此發(fā)育時(shí)期的油桐花序在石蠟切片制作過程中存在著浸蠟不充分、切片碎裂、染色不均等問題，從而影響切片質(zhì)量。

針對這些問題，本文以油桐花序?yàn)閷?shí)驗(yàn)材料，擬根據(jù)油桐花序材料的特點(diǎn)，探索出適用于油桐花序的改良石蠟切片技術(shù)，為研究油桐花芽分化及雌雄花發(fā)育的細(xì)胞學(xué)特征提供良好的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為三年桐優(yōu)良家系‘ZNL-F007’，栽植于湖南省永順縣中南林業(yè)科技大學(xué)油桐試驗(yàn)基地。于2018年7月下旬，選擇長勢良好，無病蟲害的植株，采集新梢頂端約1.5 cm 的新鮮完整的雄花芽(圖1A、B)為實(shí)驗(yàn)材料。

1.2 常規(guī)石蠟切片方法

常規(guī)方法參照陳延惠[29]、吳影[30]等的方法進(jìn)行。將固定好的材料稍剝?nèi)グ蠼?jīng)30%、50%、70%、80%、85%、90%、95%、100% 乙醇進(jìn)行梯度脫水，每梯度30 min；然后將乙醇與二甲苯按2∶1、1∶1、1∶2 比例混合液、二甲苯2 次，每梯度30 min 透明處理；將二甲苯與石蠟分別按2∶1、1∶1、1∶2 比例配成混合液，60 ℃浸蠟，再于純石蠟中浸蠟2 次，每次2 h，包埋；隨后用輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)切片，厚度10 μm，展片、烘片；二甲苯脫蠟2 次，每次15 min，1/2 乙醇+1/2 二甲苯15 min，100%乙醇兩次，每次5 min，90% 乙醇、80% 乙醇、70% 乙醇，各梯度5 min，1%番紅染色70 min、0.5%固綠 6 s、70%、80%、90%、95%乙醇，每梯度5 min、100%乙醇2 次，每次3 min、1/2 乙醇+1/2 二甲苯5 min、二甲苯2 次，每次15 min；中性樹膠封片。

1.3 改良石蠟切片方法

1.3.1 固定與處理

將新鮮材料剝?nèi)ネ獠堪笸度隖AA（70%乙醇∶冰醋酸∶甲醛=9∶0.5∶0.5）固定液中，抽氣處理30 min，待固定24 h 以上，換70%乙醇4 ℃保存。樣品脫水處理前，在體式顯微鏡下切除花芽基部多余組織，剝?nèi)セㄐ蛩闹軞堄喟⒉鸪ㄐ蚧蜉S上多余分支，只留花序主軸及其兩側(cè)相互對稱的兩個(gè)分支，用小毛刷輕輕刷除花序外圍的絨毛（圖1C、D）。

1.3.2 脫水與透明

材料經(jīng)85%乙醇、95%乙醇脫水處理1 h，100%乙醇脫水處理45 min，重復(fù)一次。隨后樣品轉(zhuǎn)至無水乙醇與二甲苯等體積混合液中靜置1 h，然后在足量二甲苯中透明，二甲苯更換2 次，每次30 min。

1.3.3 浸蠟與包埋

將透明完成后的樣品轉(zhuǎn)入盛有二甲苯的小坩鍋中，加入等體積的石蠟溶液（石蠟的熔點(diǎn)為56～58 ℃）中。將坩鍋置于55 ℃烘箱中，恒溫保持 2 h 后更換為純蠟，其后1 d 內(nèi)更換3 次以上純蠟，浸蠟期間烘箱保持在60 ℃。包埋時(shí)，將提前準(zhǔn)備好的塑料包埋盒在60 ℃烘箱中預(yù)熱3～5 min，將材料置入裝有蠟液的包埋盒中擺正好位置，放入60 ℃ 烘箱30 min 后取出，常溫冷卻（圖1E、1F）。

1.3.4 切片與烘片

將包埋后的蠟塊進(jìn)一步修整成規(guī)整的四棱臺(tái)，將蠟塊轉(zhuǎn)移至輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)蠟塊鉗內(nèi)，切片厚度為12 μm（圖1G），使用超純水做展片液，切片烘干后轉(zhuǎn)移至37 ℃恒溫箱中保存。

1.3.5 脫蠟與復(fù)水

將粘有樣品的載玻片置于染缸內(nèi)，于60 ℃的烘箱內(nèi)用二甲苯脫蠟3 次，每次30 min。后經(jīng)過1/2 乙醇+1/2 二甲苯，100%乙醇2 次，95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇、純水3 次梯度復(fù)水，每個(gè)步驟停留2 min。復(fù)水完成后隨即進(jìn)行染色。

1.3.6 染色

染色采用番紅-固綠雙重染色法。用0.5%番紅溶液染色60 min，然后用純水泡洗多次，直至染缸內(nèi)只有微量浮色。脫水重染的步驟是：30%乙醇配合鹽酸稀釋液分色1 min，50%乙醇、70%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、100%乙醇、100%乙醇各脫水10 s，其中30%乙醇中加入半滴濃鹽酸以利于番紅脫色，95%的乙醇中加入固綠粉末配成0.1%固綠溶液進(jìn)行復(fù)染。

1.3.7 封片

將染色脫水完成的材料經(jīng)過二甲苯透明后，用中性膠封片。封片后將玻片轉(zhuǎn)于37 ℃恒溫箱中烘干，隨后進(jìn)行顯微觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)方法優(yōu)化結(jié)果

與傳統(tǒng)方法相比，改良的石蠟切片方法在材料處理及主要步驟等方面進(jìn)行了諸多優(yōu)化，并對各處理階段所需時(shí)間進(jìn)行了總結(jié)（表1～2）。

表1 常規(guī)石蠟切片與改良后石蠟切片方法對比Table 1 The comparison of traditional and improved paraffin section

表2 各步驟材料處理時(shí)間對比Table 2 the time comparison of material processing

運(yùn)用改良的方法制作石蠟切片，增加體式顯微鏡下處理過程后，消除了因油桐生理結(jié)構(gòu)特性引起浸蠟不充分所導(dǎo)致的材料破損易碎問題，使材料與石蠟結(jié)合緊密。脫水時(shí)間減少1 h，透明時(shí)間縮短0.5 h，避免了透明與脫水時(shí)間過長會(huì)導(dǎo)致材料變硬變脆的問題。浸蠟時(shí)間延長了16 h，縮短二甲苯與石蠟混合液的處理時(shí)間，避免頻繁更換二甲苯導(dǎo)致的去除不徹底以及浸蠟不充分，增加樣品與石蠟的結(jié)合度。這一改進(jìn)不僅提高了切片制作的效率，還很大程度的減少了二甲苯對實(shí)驗(yàn)操作者的危害[31]。染色及脫水重染時(shí)，縮短各溶液處理時(shí)間，避免染色過度和因分色時(shí)間過長導(dǎo)致的染色不均。

2.2 材料處理優(yōu)化結(jié)果

油桐花序去除了多余苞片、分支以及密實(shí)纏繞在小花萼片外的絨毛，使樣品在保持主要結(jié)構(gòu)不變的情況下盡可能的減少了無用組織，去除絨毛使得藥液和蠟液更易進(jìn)入材料內(nèi)部，避免了由于油桐花序苞片緊實(shí)，絨毛極多所導(dǎo)致的脫水、浸蠟不充分等現(xiàn)象（圖1I 常規(guī)方法效果、圖1J 改良方法效果）。

2.3 脫水透明改良結(jié)果

脫水透明的目的是為了能更好地浸蠟與染色，在這步操作中是按照從低濃度到高濃度依次進(jìn)行。大量的試驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)表明，脫水透明的時(shí)間不宜過長，二甲苯透明時(shí)間過長會(huì)使材料變硬變脆[32]。與常規(guī)脫水時(shí)間相比，改良后的乙醇脫水時(shí)間縮短了1 h， 當(dāng)脫水后的材料放入純二甲苯時(shí)未出現(xiàn)白色霧狀渾濁，說明材料脫水充分。因此，對油桐花芽選取5 h 的脫水和透明時(shí)間，既能脫水徹底又能縮短試驗(yàn)時(shí)間，還能避免因脫水透明時(shí)間過長引起的材料變硬變脆問題（表1～2）。

2.4 浸蠟包埋改良結(jié)果

浸蠟包埋的目的是用石蠟取代透明劑，并固定樣品便于切片。理想的處理效果是石蠟可以與材料形成密不可分的整體，切片時(shí)能得到完整和連續(xù)的蠟帶。改良試驗(yàn)方法延長浸蠟時(shí)間為1 d，使大體積材料也能浸蠟充分；與常規(guī)方法相比，改良的包埋過程選擇在恒溫烘箱中進(jìn)行，保證器械與材料溫度一致，避免了二者產(chǎn)生溫差導(dǎo)致材料中產(chǎn)生氣泡的不良現(xiàn)象，保證材料的完整性（圖1E、1F）。

2.5 染液濃度與染色時(shí)間優(yōu)化結(jié)果

油桐小花組織幼嫩，細(xì)胞核大質(zhì)濃，番紅極易著色，若染色液濃度過高或染色時(shí)間過長，則細(xì)胞因著色過深而難以分色，細(xì)胞核質(zhì)不甚分明。改良方法中，采用0.5%的番紅溶液染色1 h，配合鹽酸稀釋液分色1 min，0.1%固綠溶液復(fù)染，染色后的切片細(xì)胞核顏色紅亮鮮艷，核質(zhì)分明，細(xì)胞間輪廓清晰，不論是花序的整體形態(tài)結(jié)構(gòu)，還是不同組織的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，均清晰可見（圖1M 常規(guī)方法效果、圖1N 改良方法效果）。

2.6 改良方法效果驗(yàn)證

為驗(yàn)證此改良方法是否適用于油桐大花序，選取了橫縱徑1 cm 左右的花序若干朵，花序中小花數(shù)大于40 朵。其中一枚花序沿主軸頂花縱切后用體視鏡觀察，初步確定此時(shí)花序處于雄蕊原基發(fā)育時(shí)期（圖1H），剩余花序進(jìn)行石蠟切片制作。圖1 K為使用常規(guī)方法制作的切片，可見材料破損，石蠟與材料之間有縫隙，樣品中空洞明顯；圖1L為使用改良方法制作的切片，切片后可見材料與蠟帶成為密不可分的整體，材料結(jié)構(gòu)完整。樣品經(jīng)染色后，圖1M 為常規(guī)方法染色后的切片效果，可見樣品中空洞明顯，材料破損，材料外圍的苞片浮起，影響顯微觀察；圖1N 為改良方法獲得的切片，可見切片輪廓完整，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，核質(zhì)分明，說明該石蠟切片方法適用于油桐大花序。

3 結(jié)論與討論

改良的油桐花序石蠟切片制作方法為：將采下的油桐花序簡單剝?nèi)グ罅⒓赐度隖AA 固定液中抽氣30 min，固定24 h 后更換70%乙醇于4 ℃ 冰箱中保存；樣品剝盡苞片，去掉多余花序軸，用毛刷刷去萼片外大部分絨毛后，經(jīng)85%乙醇 （1 h）、95%乙醇（1 h），100%乙醇（1 h）脫水處理。二甲苯與乙醇等比例混合液（1 h）、純二甲苯（1 h）透明。將透明好的樣品轉(zhuǎn)移到盛有石蠟與二甲苯等體積混合液的小坩鍋中，于55 ℃烘箱中處理2 h 后更換純蠟，其后更換3 次以上純蠟，浸蠟溫度為60 ℃。浸蠟完全的樣品置于盛有石蠟的塑料包埋盒中，然后于60 ℃烘箱中處理30 min 后取出，常溫冷卻凝固。蠟塊修整后進(jìn)行切片，厚度為12 μm。使用超純水做展片液，在40 ℃的展片機(jī)上展片并烘干多余水分。在60 ℃烘箱中脫蠟后快速梯度復(fù)水，0.5%番紅溶液染色1 h，鹽酸稀釋液分色，0.1%固綠復(fù)染后用中性樹膠封片。獲得的切片完整且厚度適宜，浸蠟充分且脫蠟均勻徹底，染色后的切片組織結(jié)構(gòu)完整清晰，色彩分明。

大量的研究表明，脫水透明的時(shí)間不宜過長，在無水乙醇和二甲苯中浸泡時(shí)間過長會(huì)使材料變硬變脆，從而難以獲得結(jié)構(gòu)完整的切片[32-33]。因此，脫水、透明的時(shí)間應(yīng)在保證材料中液體置換充分的情況下越短越好。浸蠟充分與否對石蠟切片能否制作成功至關(guān)重要。若浸蠟充分，石蠟則均勻的融入到組織內(nèi)部，樣品與石蠟緊密結(jié)合，切片完整成帶；否則蠟塊中會(huì)存在空洞和裂縫，切片時(shí)難以獲得結(jié)構(gòu)完整的切片。改良后的浸蠟時(shí)間比常規(guī)方法所需要的時(shí)間長，使材料與石蠟更好的結(jié)合，將石蠟與二甲苯混合液置于烘箱中，使石蠟更快的溶于二甲苯。另外，脫蠟后的樣品在后期復(fù)水與脫水重染過程若浸泡時(shí)間過長，還會(huì)導(dǎo)致樣品脫落[34-35]，因此需對乙醇處理時(shí)間進(jìn)行控制。此外，選用諸如蛋清甘油液等粘片劑也可以避免脫片現(xiàn)象發(fā)生[34]。在染色過程中選用合理有效且經(jīng)濟(jì)安全的染色劑是確保實(shí)驗(yàn)成功的根本保證，本實(shí)驗(yàn)選用0.5%番紅溶液染色，染色效果良好，但染色劑的選擇仍有很多備選可能，需要進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

圖1 雄蕊分化時(shí)期油桐花序芽Fig.1 Inflorescence buds of tung oil tree during the differentiation of stamen

在實(shí)際操作時(shí)，同一試驗(yàn)操作方法針對不同植物的同一組織或同一植物上不同部位的組織存在著一定的局限性[36]。油桐花序隨著生長發(fā)育的進(jìn)行，其體積大小及內(nèi)部形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生了很多變化，需要根據(jù)其獨(dú)特的理化特性合理選用具有針對性的處理方式及試驗(yàn)藥品。