高蛋白酵母水解物生產(chǎn)菌株的篩選研究

徐智鵬， 陳毛清 ， 曹詩(shī)國(guó)， 梁大煒，熊 鋒 ，戴晉軍 ， 胡駿鵬 *

（1.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌443000；2.安琪酵母（崇左）有限公司，廣西崇左532201）

隨著我國(guó)畜牧、水產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，飼料的需要量越來(lái)越大，致使飼料特別是飼料蛋白源的供求矛盾日益突出。魚(yú)粉作為飼料行業(yè)最常用的蛋白原料，由于對(duì)其需求量增加，而全球魚(yú)粉資源逐漸減少，因而價(jià)格居高不下（周岐存等，2005）。動(dòng)物源蛋白原料一直以來(lái)是飼料配方中常用組分，隨著行業(yè)對(duì)食品安全認(rèn)識(shí)的加深，動(dòng)物源蛋白原料如血漿蛋白粉可能存在攜帶病原菌的安全隱患（汪洋等，2014）。針對(duì)蛋白資源對(duì)外高度依賴、原料價(jià)格無(wú)序波動(dòng)、動(dòng)物性原料存在生物安全性等問(wèn)題，開(kāi)發(fā)新型飼用蛋白資源是飼料工業(yè)全面均衡可持續(xù)發(fā)展的剛性需求。

酵母水解物是以釀酒酵母為菌種，經(jīng)液體發(fā)酵得到的菌體，再經(jīng)自溶或外源酶催化水解后，濃縮或干燥獲得的產(chǎn)品（中國(guó)農(nóng)業(yè)部，2014）。已有研究表明，酵母水解物可滿足畜禽、水產(chǎn)和反芻等養(yǎng)殖動(dòng)物對(duì)蛋白原料營(yíng)養(yǎng)的需求，是一種有效的飼用蛋白源（董愛(ài)華等，2017；賀淼等，2015）。酵母水解物對(duì)動(dòng)物有極佳的誘食、免疫和促生長(zhǎng)功效，對(duì)促進(jìn)養(yǎng)殖動(dòng)物健康發(fā)育具有重要意義（陳星河等，2016；孫雪梅等，2016）。

酵母含有豐富的蛋白質(zhì)、RNA、氨基酸、維生素等成分，但是不同酵母所含的營(yíng)養(yǎng)成分存在一定的差異性（俞燦等，2017；陳文明等，2015）。本文通過(guò)對(duì)多株酵母菌種進(jìn)行篩選研究，以期獲得一株蛋白質(zhì)含量高、生長(zhǎng)性能優(yōu)良、有較高的糖蜜轉(zhuǎn)化率和氮源利用效率的酵母菌種，為高蛋白酵母水解物的工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 酵母菌株 酵母菌株由安琪酵母股份有限公司菌種庫(kù)保存，均屬于釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌種屬。

1.2 培養(yǎng)基 液體搖瓶基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蔗糖10%，酵母粉 2%，硫酸鎂 0.1%，磷酸二氫鉀 0.1%，pH（5.0±0.2）。1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 酵母濕重測(cè)定 吸取10 mL酵母發(fā)酵液置于烘干去皮的離心管中，5000 r/min離心10 min，棄上清，稱重計(jì)算酵母濕重（g/L）。

1.3.2 蛋白質(zhì)測(cè)定 采用GBT 6432-94飼料中粗蛋白質(zhì)測(cè)定方法。

1.3.3 酒精測(cè)定 重鉻酸鉀比色法碘量法測(cè)定酒精含量（陳詩(shī)枚，2000）。

1.3.4 酵母乳產(chǎn)量計(jì)算 吸取10 mL酵母發(fā)酵液置于烘干去皮的離心管中，5000 r/min離心10 min，棄上清，洗滌2～3次，采用烘箱測(cè)定干物質(zhì)含量。發(fā)酵總產(chǎn)量（折干）為收獲酵母總濕重與干物質(zhì)的乘積。

1.3.5 糖蜜轉(zhuǎn)化率計(jì)算 酵母產(chǎn)量除以與糖蜜理論轉(zhuǎn)化酵母產(chǎn)量。

1.3.6 氮源轉(zhuǎn)化率計(jì)算 實(shí)際酵母總含氮量除以添加氮總量。

1.3.7 色度測(cè)定 色度采用色采色差儀進(jìn)行測(cè)定（CR-400，日本柯尼卡美能達(dá)）。

1.4 搖瓶發(fā)酵初篩

1.4.1 菌種的純化與活化 將菌種庫(kù)里凍干管保存的酵母菌種取出，采用直接劃線法，用接種環(huán)蘸取保種液在固體培養(yǎng)皿上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，篩選單菌落。挑取表面平滑的單菌落菌種接種于裝有250 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基的三角燒瓶中，置搖床上培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速 180 r/min，30℃培養(yǎng)24 h。

1.4.2 菌體蛋白質(zhì)測(cè)定 將活化的酵母菌種按照1‰的接種量接種到裝有1 L基礎(chǔ)培養(yǎng)基的三角燒瓶中，置搖床上培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速180 r/min，30℃培養(yǎng)20 h，收集培養(yǎng)液抽濾餅，測(cè)定酵母濾餅干物質(zhì)含量，并檢測(cè)蛋白質(zhì)含量，獲得2株蛋白質(zhì)含量相對(duì)較高的酵母菌種。

1.5 二級(jí)發(fā)酵篩選培養(yǎng)

1.5.1 搖瓶發(fā)酵菌種培養(yǎng) 將活化的酵母菌種按照1‰的接種量接種到裝有2 L基礎(chǔ)培養(yǎng)基的三角燒瓶中，置搖床上培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速180 r/min，30℃培養(yǎng)24 h。靜置4℃過(guò)夜取上清接種50 L發(fā)酵罐放大培養(yǎng)。

1.5.2 50 L種子罐發(fā)酵培養(yǎng) 50 L種子罐發(fā)酵底水18 L，121℃滅菌30 min。發(fā)酵過(guò)程中采用流加培養(yǎng)方式，氮源為硫酸銨，碳源為糖蜜（總糖濃度約30%），體積約18 L，發(fā)酵過(guò)程采用濃度為20%的純堿調(diào)控pH。接種2 L搖瓶培養(yǎng)液，控制發(fā)酵酒精0.1%左右，總糖濃度0.01%～0.5%，發(fā)酵溫度維持30℃，發(fā)酵通氣量控制為8～40 m3/h，發(fā)酵攪拌速度控制為150～450 r/min，當(dāng)濕重達(dá)到160 g/L時(shí)選擇放罐。收集酵母乳作為30 L發(fā)酵罐的種子，可以供3～4次30 L發(fā)酵罐接種使用。

1.5.3 30 L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng) 30 L發(fā)酵罐底水7.5 L，121℃滅菌30 min。發(fā)酵過(guò)程采用流加培養(yǎng)方式培養(yǎng)，氮源為氨水，碳源為糖蜜（總糖濃度約30%），體積約10 L，發(fā)酵過(guò)程采用濃度為10%的濃硫酸調(diào)控pH。接種酵母乳，發(fā)酵起始濕重為55 g/L左右，發(fā)酵過(guò)程控制發(fā)酵酒精0.1%左右，發(fā)酵溫度維持30℃，發(fā)酵通氣量控制為20～45 m3/h，發(fā)酵攪拌速度控制為200～600 r/min，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間14 h時(shí)放罐，收集發(fā)酵液。

1.5.4 酵母乳收集及酵母水解物制備 將收集的發(fā)酵液采用連續(xù)流分離機(jī)進(jìn)行分析，收集酵母乳沉淀重懸洗滌，至酵母乳色度為50～55。

1.6 酵母水解物生產(chǎn)制備 將收集的酵母乳采用快速水分測(cè)定儀測(cè)定干物質(zhì)含量，控制干物質(zhì)為15%～20%，添加3%～5%的檸檬酸后調(diào)節(jié)溫度為51.5～55.0℃，自溶8～12 h后升溫至55～60℃，調(diào)節(jié)pH至5.5～6.0，加入2‰ ～4‰的AH-1酶制劑酶解，酶解6～12 h后，升溫75℃保溫1 h。采用噴霧干燥的方式對(duì)樣品進(jìn)行干燥，噴塔進(jìn)風(fēng)溫度為165℃，出風(fēng)溫度為90℃，收集粉體樣品進(jìn)行結(jié)果分析。

1.7 酵母水解物口感評(píng)價(jià) 酵母水解物口感評(píng)價(jià)方法參照周俊清等（2008）方法，感官評(píng)定小組由經(jīng)過(guò)篩選的9人組成（男女比例4：5，均為不吸煙者），樣品用熱水溶解配制成2%的水溶液。評(píng)定員用蒸餾水漱口后，取出2 mL樣品液置于口中，5～10 s后吐出，然后根據(jù)評(píng)分表進(jìn)行評(píng)分（表1），評(píng)分高的為口感較優(yōu)的樣品。

表1 酵母水解物口感評(píng)分表

2 結(jié)果與分析

2.1 高蛋白菌株的搖瓶發(fā)酵篩選 對(duì)多株酵母菌株搖瓶培養(yǎng)后，菌株蛋白質(zhì)檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。數(shù)據(jù)表明，菌株 1、2、3、4、5、6 的蛋白質(zhì)含量均高于對(duì)照菌株，且含量達(dá)到58%以上；菌株1、菌株2的蛋白質(zhì)含量超過(guò)60%，明顯優(yōu)于對(duì)照菌株，因此篩選菌株1和2進(jìn)行二級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)研究。

2.2 二級(jí)發(fā)酵篩選培養(yǎng)

2.2.1 50 L發(fā)酵罐培養(yǎng) 相同發(fā)酵條件下，酵母菌株最終發(fā)酵濕重與發(fā)酵過(guò)程中生產(chǎn)酒精的曲線如圖2所示。整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，菌株1最終發(fā)酵濕重為186 g/L，高于對(duì)照菌株（166 g/L）；發(fā)酵第16小時(shí)，菌株1的酒精含量低于0.1%。上述結(jié)果表明菌株1對(duì)酒精的消化速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于對(duì)照菌株和菌株2。

發(fā)酵結(jié)束，收集酵母乳進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，計(jì)算酵母乳產(chǎn)量、糖蜜轉(zhuǎn)化率及氮源利用率，結(jié)果見(jiàn)表2。在相同發(fā)酵條件下，不同酵母菌株對(duì)糖蜜的轉(zhuǎn)化率和氮源的利用率均不相同，菌株1的蛋白質(zhì)含量、糖蜜轉(zhuǎn)化率及氮源利用率都高于對(duì)照菌株和菌株2。

表2 不同酵母菌株的生產(chǎn)過(guò)程數(shù)據(jù)比較（50 L種子罐）%

2.2.2 30 L發(fā)酵罐培養(yǎng) 統(tǒng)一發(fā)酵工藝條件，將前期50 L發(fā)酵罐發(fā)酵收集的酵母乳作為種子進(jìn)行30 L發(fā)酵罐發(fā)酵，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程控制同50 L發(fā)酵罐發(fā)酵過(guò)程，控制發(fā)酵時(shí)間14 h后取樣分析，最終發(fā)酵濕重與發(fā)酵過(guò)程中生產(chǎn)酒精的曲線如圖3所示。整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，菌株1最終發(fā)酵濕重為246 g/L，高于對(duì)照菌株（237 g/L）和菌株 2（225 g/L）。數(shù)據(jù)表明，3株酵母菌株在30 L發(fā)酵過(guò)程中，酒精含量均能控制在較低水平。

發(fā)酵結(jié)束，收集酵母乳進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，計(jì)算酵母乳產(chǎn)量、糖蜜轉(zhuǎn)化率及氮源利用率，結(jié)果見(jiàn)表3。在相同發(fā)酵工藝、營(yíng)養(yǎng)源添加的條件下，不同酵母菌株對(duì)糖蜜的轉(zhuǎn)化率和氮源的利用率不相同，其中菌株1在蛋白質(zhì)含量、糖蜜轉(zhuǎn)化率和氮源利用率上都表現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)，與50 L發(fā)酵罐結(jié)果保持一致。

表3 不同酵母菌株的生產(chǎn)過(guò)程數(shù)據(jù)比較（30 L發(fā)酵罐）%

2.3 酵母水解物制備 收集30 L發(fā)酵罐培養(yǎng)的酵母乳，經(jīng)洗滌后，采用相同酶解工藝制備得到3種酵母水解物，指標(biāo)如表4所示。數(shù)據(jù)表明，酵母水解物的營(yíng)養(yǎng)成分指標(biāo) （粗蛋白質(zhì)、賴氨酸和RNA含量）由酵母乳決定，生產(chǎn)技術(shù)指標(biāo)（酸溶蛋白與氨基酸態(tài)氮含量）由酶解工藝決定；3種酵母乳均可以制備酵母水解物；3種酵母水解物的RNA、酸溶蛋白和氨基酸態(tài)氮含量無(wú)明顯差異，但菌種1在蛋白質(zhì)和賴氨酸上有明顯優(yōu)勢(shì)。

2.4 酵母水解物口感測(cè)試 不同菌種生產(chǎn)酵母水解物感官評(píng)價(jià)結(jié)果如表5所示。數(shù)據(jù)表明，3種酵母水解物屬于同一口感系列，菌株1生產(chǎn)的酵母水解物鮮甜味濃郁、回味好、整體口感均衡；對(duì)照菌株生產(chǎn)酵母水解物鮮甜味濃郁、有回味、整體口感略差于菌株1生產(chǎn)酵母水解物；菌株2生產(chǎn)酵母水解物鮮甜味適中，回味及整體口感偏淡。

表4 不同酵母水解物的生產(chǎn)指標(biāo)和營(yíng)養(yǎng)成分%

表5 不同酵母水解物的口感評(píng)分結(jié)果

3 結(jié)論

酵母水解物富含蛋白質(zhì)、氨基酸、小肽、核酸等營(yíng)養(yǎng)成分，其對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物的促生長(zhǎng)作用已被證實(shí)。本文從酵母菌種出發(fā)，通過(guò)搖瓶篩選、二級(jí)發(fā)酵篩選培養(yǎng)（50 L種子罐和30 L發(fā)酵罐）、酵母水解物制備、感官評(píng)價(jià)等方法研究，表明菌株1的發(fā)酵過(guò)程數(shù)據(jù)（酒精消耗、糖蜜轉(zhuǎn)化率、氮源利用率等）和營(yíng)養(yǎng)成分（蛋白質(zhì)、賴氨酸含量）均優(yōu)于對(duì)照菌株和菌株2，可作為生產(chǎn)高蛋白酵母水解物（蛋白質(zhì)≥55%）的生產(chǎn)菌株。后續(xù)需對(duì)該菌株的發(fā)酵工藝進(jìn)一步系統(tǒng)優(yōu)化，以期逐步實(shí)現(xiàn)該菌株的發(fā)酵工藝放大及高蛋白酵母水解物的規(guī)模化生產(chǎn)。